內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)牛源致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因檢測(cè)及耐藥性分析

楊斯琴，敖日格樂(lè)*，王純潔，周 婷

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

致病性大腸桿菌(Escherichia coli)為導(dǎo)致畜牧業(yè)中細(xì)菌性疾病最常見的病原，不同動(dòng)物感染后出現(xiàn)不同的臨床癥狀和病理變化，而且常與其他病原菌混合感染或并發(fā)，發(fā)病率和死亡率較高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。因此，致病性E.coli 的檢測(cè)尤為重要。盡管致病性E.coli 通常集中于某些特定的血清型，但眾多研究發(fā)現(xiàn)相同血清型E.coli 的病原生物學(xué)特性也不盡相同。不同地區(qū)血清型差別較大，同一地區(qū)不同牧場(chǎng)血清型存在差異，同一牧場(chǎng)相同牧群也存在不同的血清型[2]。因此，E.coli 的致病性并不完全與血清型有關(guān)，而主要是取決于其所產(chǎn)生的特定的毒力因子，如菌毛、鐵攝取系統(tǒng)、外膜蛋白以及毒素等。毒力基因的檢測(cè)己成為確定致病性E.coli 的常用方法[3]。因此毒力基因的測(cè)定不僅可以作為特征性鑒定，而且還可對(duì)其潛在的致病性能做出前瞻性判定。另一方面，目前由于濫用抗生素導(dǎo)致耐藥致病性E.coli 不斷出現(xiàn)，防治效果也愈來(lái)愈不理想。為了解不同血清型致病性E.coli的毒力基因攜帶情況和耐藥性，本研究采集內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛直腸糞便樣品，對(duì)其進(jìn)行致病性E.coli 分離鑒定，并進(jìn)行毒力基因、血清型檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)研究，為防治由致病性E.coli 所引起的各種疾病提供參考。

1 材料和方法

1.1 臨床樣品、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 100 份新鮮糞便樣品于2013 年6 月采自內(nèi)蒙古呼和浩特地區(qū)3個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)的成年奶牛。昆明系健康小鼠(體質(zhì)量為20±2 g)購(gòu)自內(nèi)蒙古大學(xué)動(dòng)物中心。麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(EMB)、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、普通肉湯培養(yǎng)基、糖發(fā)酵培養(yǎng)基、西蒙氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基、0.5 %石炭酸生理鹽水、革蘭染色液、吲哚試劑、M-R 試劑、V-P 試劑均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；Premix TaqTM、100 bp DNA Ladder、細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa 公司；E.coli 標(biāo)準(zhǔn)“O”抗原定型血清購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏中心；20 種藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 E.coli 的分離鑒定 參照文獻(xiàn)[4]的方法對(duì)糞便樣品進(jìn)行分離并純培養(yǎng)，挑取菌落涂片染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)及染色特性。取37 ℃培養(yǎng)18 h 的肉湯純培養(yǎng)物，進(jìn)行常規(guī)生化試驗(yàn)。按生化鑒定管使用說(shuō)明書進(jìn)行鑒定。

1.3 致病性試驗(yàn) 將各分離株菌液(0.5×109cfu/mL)分別按0.2 mL/只劑量腹腔注射2 只小鼠，空白對(duì)照組的2 只小鼠注射滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯0.2 mL[5]。將實(shí)驗(yàn)小鼠隔離飼養(yǎng)，觀察發(fā)病及存活情況。對(duì)死亡的小鼠立即剖檢并無(wú)菌取其臟器樣品(包括肝臟、脾臟、心血)劃線于EMB 平板，經(jīng)革蘭氏染色、鏡檢，培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色等均符合E.coli 特征的菌株確定為致病性E.coli[6]。

1.4 分離株的血清型鑒定 對(duì)經(jīng)生化鑒定和小鼠致病性試驗(yàn)鑒定為致病性E.coli 的菌株進(jìn)行普通瓊脂純培養(yǎng)，利用生理鹽水洗滌純培養(yǎng)物，3 000 r/min 離心15 min，洗滌2 次，稀釋成108個(gè)/mL 菌液，121 ℃高壓滅菌2 h，破壞其K 和H 抗原，即為“O”抗原。按血清鑒定使用說(shuō)明書采用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行鑒定。

1.5 分離株的毒力基因檢測(cè)及測(cè)序 根據(jù)文獻(xiàn)[7]和[8]設(shè)計(jì)并合成stx1、stx2、bfpA、eaeA、st、lt、irp2 和hlyA 等毒力基因的8 對(duì)引物，引物由TaKaRa公司合成。采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒提取分離株DNA，以其為模板對(duì)8 種毒力基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收并由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司測(cè)序。

1.6 藥敏試驗(yàn) 按照CLSI 標(biāo)準(zhǔn)[9]采用紙片稀釋法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[1]。根據(jù)CLSI 的抑菌圈大小進(jìn)行判斷。以E.coli ATCC25922 作為藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌。

2 結(jié)果

2.1 E.coli 的分離鑒定 糞便樣品經(jīng)多種分離培養(yǎng)基培養(yǎng)后結(jié)果顯示，分離菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)玫瑰紅色菌落；EMB 平板上呈現(xiàn)黑紫色并且對(duì)光具有金屬光澤的菌落；普通瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、表面光滑、半透明的菌落；普通肉湯中液體渾濁、表面有菌膜、底部有沉淀即菌體。100 份糞便樣品中共分離出88 株疑似E.coli，經(jīng)生化鑒定其中有77 株確定為E.coli。

2.2 分離株的致病性試驗(yàn) 將各分離株菌液分別腹腔注射小鼠后進(jìn)行致病性試驗(yàn)，結(jié)果顯示，77 株E.coli 分離株中有50 株E.coli 均在12 h～48 h 內(nèi)致小鼠死亡(64.9 %)，而對(duì)照組小鼠無(wú)任何變化。實(shí)驗(yàn)組小鼠注射分離鑒定的E.coli 后出現(xiàn)昏睡，厭食，呼吸急促，被毛蓬松，少數(shù)可見拉稀和眼角出血。剖檢死亡小鼠可見腹腔內(nèi)有黏性黃色滲出物，肝臟和腎脾腫大，有點(diǎn)狀壞死灶；肺充血及淤血，腸嚴(yán)重膨脹充氣。將死亡小鼠心血接種于EMB 瓊脂進(jìn)行培養(yǎng)后革蘭氏染色、鏡檢，培養(yǎng)特性、形態(tài)、染色等均符合接種菌的特性。

2.3 分離株的血清型鑒定結(jié)果 分離株經(jīng)玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行血清型鑒定，結(jié)果顯示50 株致病性E.coli中18 株有自凝現(xiàn)象，8 株未定型；其余24 株定型血清型(表1)，分別為10 種不同的血清型，包括O1、O2、O8、O18、O78、O86、O114、O118、O146和O152血清型，其中O18、O146和O152為主要流行的血清型，分別占定型血清的25 %、17 %和17 %。

表1 致病性E.coli 的血清型鑒定結(jié)果Table 1 Identification of serotype of pathogenic E.coli

2.4 分離株的毒力基因檢測(cè)及測(cè)序結(jié)果 對(duì)分離株的8 種毒力基因進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果顯示，50 株致病性E.coli 中，毒力基因irp2 的檢出率為100 %；毒力基因eaeA、stx1、stx2 和hlyA 的檢出率分別為50 %、14 %、10 %和8 %；而毒力基因bfpA、st 和Lt 的檢出率為陰性(0/50)(表2)。此外同時(shí)含有stx1和irp2 2 種毒力基因，stx1、irp2 和hlyA 3 種毒力基因，stx1、stx2、irp2 和hlyA 4 種毒力基因的菌株各有1 株；同時(shí)含有stx1、stx2、eaeA 和irp2 4 種毒力基因，stx1、eaeA、irp2 和hlyA 4 種毒力基因，stx2、eaeA 和irp2 3 種毒力基因的菌株各2 株；同時(shí)含有eaeA 和irp2 2 種毒力基因的菌株共有19 株；只含有irp2 毒力基因的菌株有22 株(表2)。毒力基因的PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank 參考序列相似度均高于97%。8 種毒力基因的PCR 結(jié)果見圖1。

表2 致病性E.coli 的毒力基因檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection of virulence genes of pathogenic E.coli

圖1 致病性E.coli 的8 種毒力基因的PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Detection of 8 kinds of virulence genes of pathogenic E.coli by PCR

2.5 致病性E.coli 耐藥性的檢測(cè)結(jié)果 在血清型鑒定和毒力基因檢測(cè)的基礎(chǔ)上，從每種血清型中挑選1 株并含有毒力基因最多的10 株代表分離株，測(cè)定其對(duì)20 種抗生素的耐藥性。結(jié)果顯示，所有血清型菌株均表現(xiàn)為多重耐藥性，其中10 種血清型致病性E.coli 均對(duì)青霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、利福平、復(fù)方新諾明和阿莫西林6 種抗生素具有耐藥性；70%的致病性E.coli 表現(xiàn)為鏈霉素耐藥；50 %的致病性E.coli 對(duì)頭孢曲松和頭孢噻吩耐藥(表3)。

表3 致病性E.coli 血清型的耐藥表型和毒力基因的分布Table 3 Resistance phenotype and distribution of virulence genes in relation to pathogenic E.coli serotypes

3 討論

關(guān)于致病性E.coli 的檢出率各個(gè)國(guó)家及地區(qū)各不相同。有報(bào)道顯示，牛致病性E.coli 的檢出率為28.43 %[10]，羊致病性E.coli 的檢出率為48 %[11]。而本研究中，100 份新鮮糞便樣品中致病性E.coli 的檢出率為50 %，其檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于上述報(bào)道，表明致病性E.coli 的檢出率具有地域性和宿主性。

近幾年內(nèi)蒙古地區(qū)E.coli 主要血清型分別有O78、O2、O8、O86、O35、O1，其所占的比例分別為38.89%、33.33 %、14.81 %、7.41%、3.70 %、1.85 %[12]。而本研究中優(yōu)勢(shì)血清型為O18、O146和O152，所占比例分別為25%、17%和17%。因E.coli 血清型復(fù)雜，同種動(dòng)物不同地區(qū)E.coli 的血清型具有明顯差異，因此優(yōu)勢(shì)血清型同樣具有地域性和宿主性。而對(duì)于未定型的分離株，可能由于時(shí)間和地點(diǎn)的推移，出現(xiàn)了新的致病性血清型，有待于進(jìn)一步研究。

E.coli 是臨床上分離率較高的菌株，為區(qū)分E.coli 分離株是否為致病性菌株，本研究結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和PCR 方法對(duì)其進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，分離株在12 h～48 h 內(nèi)致小鼠死亡并均含有8 種毒力基因(stx1、stx2、bfpA、eaeA、st、lt、irp2 和hlyA)中的某一種或幾種，因此鑒定為致病性菌株。

強(qiáng)致病性毒力島(High pathogenicity island，HPI)首先在耶爾森菌中發(fā)現(xiàn)，是賦予耶爾森菌毒力和致病性的重要因素。而毒力基因irp2 作為HPI 中的鐵調(diào)節(jié)基因，僅存在于強(qiáng)致病株中，與毒力密切相關(guān)，成為判斷和檢測(cè)其它病源菌是否存在HPI 的標(biāo)志基因[13]。而本研究中毒力基因irp2 的檢出率為100 %，并且致病性E.coli 為條件致病菌，因此認(rèn)為內(nèi)蒙古地區(qū)牛場(chǎng)存在潛在危險(xiǎn)，需加強(qiáng)管理，加以防范E.coli 病的暴發(fā)。而有些致病性E.coli 存在4種毒力基因，推測(cè)這些毒力基因在疾病發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明不同血清型致病性E.coli 的耐藥性存在差異，在使用抗生素治療E.coli 型疾病時(shí)應(yīng)先做初步的血清型監(jiān)測(cè)及藥敏試驗(yàn)，以篩選出其敏感藥物。本研究中所有受試菌對(duì)7～12 種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性，而且10 種血清型致病性E.coli對(duì)青霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、利福平、復(fù)方新諾明和阿莫西林6 種抗生素均耐藥。因此，內(nèi)蒙古地區(qū)可以減少以上6 種抗生素的使用或配合其他藥物進(jìn)行治療。本研究為內(nèi)蒙古地區(qū)牛源致病性E.coli病的防控和臨床合理用藥提供依據(jù)。

[1]曾博，王紅寧，鄒立扣，等.西南地區(qū)豬腸外大腸桿菌毒力基因檢測(cè)及耐藥性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2013，35(2)：126-128.

[2]劉華.多重PCR 檢測(cè)禽致病性大腸桿菌毒力基因方法的建立及應(yīng)用[D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

[3]聞曉波，崔玉東，朱戰(zhàn)波，等.牛產(chǎn)腸毒素大腸桿菌毒力因子多重PCR 檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)畜牧學(xué)報(bào)，2007，03：322-324.

[4]鄒玲，任慧英，溫建新，等.膠東地區(qū)肉雞致病性大腸桿菌的分離及血清型鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，(9)：121-122.

[5]朱蓓.腸出血性大腸桿菌感染的流行病學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)資料概述[J].解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2011，4：309-311.

[6]譚詩(shī)文，肖耀南.貴州羔羊致病性大腸埃希氏菌血清型和致病因子的研究：大腸埃希氏菌的分離、血清型、致病因子和致病性試驗(yàn)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，28(2)：9-14.

[7]趙愛蘭，熊衍文，白雪梅，等.鑒定五類致瀉性大腸埃希菌和志賀菌的多重PCR 方法[J].疾病監(jiān)測(cè)，2011，26(1)：65-67.

[8]Fagan P K,Hornitzky M A,Bettelheim K A,et al.Detection of shiga-like toxin(stx1 and stx2),intimin(eaeA),and enterohemorrhagic Escherichia coli(EHEC)hemolysin(EHEC hlyA)genes in animal feces by multiplex PCR[J].Appl Environ Microbiol,1999,65(2):868-872.

[9]National Committee for Clinical Laboratory Standards.Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests[S].

[10]斯木吉德，敖日格樂(lè)，王純潔，等.奶牛新鮮糞便致病性大腸桿菌分離鑒定[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2009，45(8)：42-43.

[11]譚詩(shī)文，肖耀南，艾玉萍，等.貴州羔羊致病性大腸埃希氏菌血清型和致病因子的研究-大腸埃希氏菌的分離、血清型、致病因子和致病性試驗(yàn)[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000，28(2)：9-14.

[12]Schubert S,Rakin A,Karch H,et al.Prevalence of the "highpathogenicity island" of Yersinia species among Escherichia coli strains that are pathogenic to humans[J].Infec Immun,1998,66(2):480-485.

[13]李葉芳，涂健，邵穎，等.利用Red 重組系統(tǒng)敲除APEC 毒力島irp2 基因[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，39(6)：854-858.