犬副流感病毒CC-14 株全基因組測序及分析

高菽蔓，靳紅亮,2，張守峰，劉 曄，扈榮良*

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 軍事獸醫(yī)研究所，吉林 長春 130122；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118)

犬副流感病毒(Canine parainfluenza virus，CPIV)又稱副流感病毒5 型(Parainfluenza Virus 5，PIV5)，為單股負鏈不分節(jié)段RNA 病毒，屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)，副黏病毒亞科(Paramyxovirinae)，腮腺炎病毒屬(Rubulavirus)，與同屬的猴病毒5 型(Simian virus 5，SV5)[1]、人SV5 分離株及人副流感病毒II 型(Human paramyxovirus type 2，hPIV2)抗原性密切相關(guān)，性質(zhì)相似[2]。各年齡段的犬均可以感染，是犬窩咳的主要病原之一[3]，幼犬對該病毒最易感，并且發(fā)病急，傳播快，病毒呈世界性分布，貓、倉鼠、豚鼠、豬均有感染報道[4]。

隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，眾多病毒基因組成為具有巨大開發(fā)潛力的病毒活載體工具。研究表明，PIV5 極具作為開發(fā)新型疫苗的候選病毒載體[5]。PIV5 基因組大小為15 246 nt，從3' 端到5' 端編碼產(chǎn)生7～8 種常見結(jié)構(gòu)蛋白，包括核衣殼蛋白(NP)、V 蛋白(V)、磷酸化蛋白(P)、膜基質(zhì)蛋白(M)、融合蛋白(F)、小疏水性蛋白(SH,該蛋白在某些副流感病毒5 型中不存在[6])、血凝素-神經(jīng)氨酸酶(HN)、聚合酶蛋白(L)，其中NP 基因高度保守[7]。

本研究對本實驗室保存的CPIV CC-14 株進行了全基因組的克隆、測序與NP 基因編碼區(qū)序列分析，充實了我國PIV5 基因組數(shù)據(jù)信息，為以PIV5 為載體的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要實驗材料 CPIV CC-14 株和MDCK 細胞均由軍事獸醫(yī)研究所流行病學(xué)實驗室保存。Simply P 總RNA 提取試劑盒購自BioFlux 公司；膠回收試劑盒購自Axygen 公司；pMD18-T 載體購自TaKaRa公司。

1.2 引物設(shè)計及合成 參照SV5 全基因組序列，設(shè)計覆蓋CPIV CC-14 株基因組全長的14 對引物(表1)，引物由金唯智生物技術(shù)有限公司合成。

表1 CPIV 全基因組克隆引物Table 1 The primers of complete genome of CPIV

1.3 病毒全基因組的擴增及克隆 按照Simply P總RNA 提取試劑盒說明書方法提取CPIV 細胞毒的總RNA，以各片段上游引物進行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，以其為模板進行各基因片段的擴增。擴增產(chǎn)物分別克隆于pMD18-T 載體中，構(gòu)建14 個重組質(zhì)粒。

1.4 DNA 序列的測定和分析 重組質(zhì)粒由吉林省庫美生物科技有限公司進行測序，測序結(jié)果與Gen-Bank 中登錄的其他PIV5 序列進行比對分析，利用DNAStar 軟件完成序列拼接并基于NP 基因編碼區(qū)核苷酸序列及其推導(dǎo)氨基酸序列進行同源比對分析，采用MEGA 5.2 軟件繪制系統(tǒng)發(fā)生進化樹進行系統(tǒng)發(fā)生分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CPIV CC-14 株全基因組克隆及序列分析 采用設(shè)計的14 對引物PCR 擴增CPIV 各片段，并分別克隆于pMD18-T 載體中，構(gòu)建14 個重組質(zhì)粒。對其進行測序、拼接及分析，結(jié)果顯示CPIV CC-14株全基因組序列長度為15 246 nt(KP893891)。這是國內(nèi)首次完成對CPIV 全基因組的克隆測序。

CPIV CC-14 株基因組具有PIV5 典型組成結(jié)構(gòu)，包括3' 引導(dǎo)序列(Leader sequence，即3'-UTR)、編碼7 個結(jié)構(gòu)蛋白(NP、V、M、F、HN、L)的6 段基因(表2)以及5' 末端序列(Tailer sequence，即5'-UTR)。其中3'-UTR 長55 bp，位于1 nt～55 nt，5'-UTR 長31 bp，位于15 216 nt～15 246 nt。該病毒每個基因均具有保守的轉(zhuǎn)錄起始信號和轉(zhuǎn)錄終止信號序列，這些保守序列參與mRNA 的起始和終止，是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號。各基因間均由基因間隔序列隔開，間隔序列較為保守，并且不構(gòu)成mRNA 成分。

據(jù)報道，SH 蛋白能夠抑制TNF-α 介導(dǎo)的細胞凋亡過程[8]，某些犬源和豬源的PIV5 SH 基因發(fā)生變異，無法編碼SH 基因，即不能產(chǎn)生小疏水蛋白，因此該蛋白對于病毒感染犬和豬是非必需的[6]。本研究對CPIV CC-14 株進行全基因組測序，結(jié)果顯示該病毒不編碼SH 基因，該基因的缺失是否影響病毒與宿主之間相互作用等還有待進一步研究。

CPIV CC-14 株的NP 基因長度為1 530 nt，位于全基因組的152 nt～1 681 nt，編碼NP 蛋白，為病毒核糖核蛋白體(Ribonucleoproteins,RNPs)的組成部分之一。有研究表明，副黏病毒科N 蛋白含有一個高度保守的中間區(qū)域F-X4-Y-X3-φ-S-φ-A-M，其中X 表示任意氨基酸殘基，φ 表示芳香族氨基酸，該區(qū)域與N-N 自我組裝以及N-RNA 相互作用有關(guān)。本研究CPIV CC-14 株恰好具有323FAAANYPLLY SYAM336氨基酸序列特征，與其相符合。

表2 CPIV CC-14 株基因組編碼蛋白Table 2 The encoding proteins of CPIV strain CC-14

2.2 基于NP 基因系統(tǒng)發(fā)生分析 本研究將CPIV CC-14 株與GenBank 中登錄的17 株P(guān)IV5 NP 基因編碼區(qū)序列進行同源比對和系統(tǒng)發(fā)生分析。結(jié)果顯示，CPIV CC-14 株與GenBank 登錄的其他17 株P(guān)IV5 參考病毒株NP 基因核苷酸同源性為97.25 %～99.80 %，其中與英國豬源SER 株及長春牛源PV5-BC14 株同源性相同且最高，為99.80 %；與韓國犬源D277 株核苷酸同源性最低，為97.25 %。氨基酸同源性比較結(jié)果顯示，CPIV CC-14 株與17 株P(guān)IV5 參考病毒株NP 基因氨基酸同源性為98.62 %～99.80 %，與長春牛源PV5-BC14、美國猴源SV5、英國恒河猴源W3A、英國犬源CPI+及CPI-同源性相同且最高，為99.80 %；與韓國2 株犬源PIV5(D277 和08-1990)氨基酸同源性最低，為98.62 %。

利用MEGA 5.2 軟件基于NP 基因構(gòu)建并繪制系統(tǒng)發(fā)生進化樹，分析結(jié)果顯示，CPIV CC-14 株與長春牛源PV5-BC14 株同屬一個分支，親緣關(guān)系最近；與韓國2 株犬源PIV5(D277 和08-1990)親緣關(guān)系最遠(圖1)。

本研究單獨對NP 基因進行RT-PCR 擴增后，結(jié)果顯示，不同批次間NP 基因擴增產(chǎn)物測序結(jié)果之間存在個別堿基突變，甚至提前出現(xiàn)終止密碼子，造成個別氨基酸突變等，這些氨基酸突變是否影響病毒包裝和復(fù)制等，還有待進一步研究。

本研究明確了CPIV CC-14 株的全基因背景，為以該病毒株為載體進行重組疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

圖1 基于PIV5 NP 基因的系統(tǒng)發(fā)生進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of NP gene of PIV5 constructed with Neighbor Joining method

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