風(fēng)柜斗草提取物通過調(diào)控脂質(zhì)代謝改善小鼠肝脂質(zhì)沉積癥

王玥文，蔡鳳迎，薛凱航，華寶玉,3，郭 昌,3，李 焰,3*，邱龍新,3*

(1.龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院)，福州 350002；3.預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與生物技術(shù)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，龍巖 364012)

肝脂質(zhì)沉積癥又稱脂肪肝是寵物臨床中最常見的肝膽疾病之一，包括肝脂肪變性、炎癥和纖維化等病理改變[1]。其近些年來日趨普遍的發(fā)病趨勢(shì)嚴(yán)重威脅到寵物的生命健康以及生活質(zhì)量。犬貓肝脂沉積癥的病理學(xué)機(jī)制非常復(fù)雜，肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯積累的主要代謝異常原因尚不完全清楚，但可能包括脂肪酸攝取、合成、分解和分泌途徑的改變[1-3]。風(fēng)柜斗草(SarcopyramisnapalensisWall)作為一種保肝護(hù)肝、治療肝炎的單驗(yàn)方被民間廣為使用[4]。Guo等[5]研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)柜斗草醇提物能有效改善經(jīng)CCl4或D-GalN處理后的小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)的活力水平，及肝組織中丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，同時(shí)顯著提高了組織中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)的活性和谷胱甘肽(glutathione，GSH)的活性，與水飛薊素或雙苯二甲酸酯處理結(jié)果相似；組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，與CCl4組和D-GalN組相比，風(fēng)柜斗草醇提物組小鼠肝病理變化有明顯改善。鄭曉艷和陳育青[6]應(yīng)用高脂飲食誘導(dǎo)大鼠建立的非酒精性脂肪肝病模型，觀察風(fēng)柜斗草黃酮干預(yù)非酒精性脂肪肝病的作用，發(fā)現(xiàn)風(fēng)柜斗草黃酮可顯著降低非酒精性脂肪肝病大鼠血清中TC、TG、ALT、AST的含量，改善其肝組織病理學(xué)改變，表明風(fēng)柜斗草黃酮可有效預(yù)防和治療非酒精性脂肪肝病。因此，風(fēng)柜斗草在治療寵物肝脂質(zhì)沉積癥上具有很大的潛力，本課題組前期研究證明風(fēng)柜斗草水提物顯著改善貓肝脂質(zhì)沉積癥，但目前對(duì)其作用機(jī)制尚未深入研究。

本研究通過分析風(fēng)柜斗草提取物對(duì)蛋氨酸膽堿缺乏(methionine-choline-deficient, MCD)飲食誘導(dǎo)肝脂沉積癥小鼠肝脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)情況，結(jié)合肝脂質(zhì)代謝組學(xué)分析結(jié)果，進(jìn)一步探究脂質(zhì)代謝在該藥物治療肝脂沉積癥中的作用，為該藥在寵物臨床中的開發(fā)與應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司。試驗(yàn)嚴(yán)格按照龍巖學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的試驗(yàn)方案和指南進(jìn)行。MCD、MCS鼠糧購自睿迪生物科技(深圳)有限公司。

堿性磷酸酶(AKP)檢測(cè)試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT/GPT)檢測(cè)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST/GOT)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)檢測(cè)試劑盒、丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；組織固定液購自武漢賽維爾生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自南京諾唯贊生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞裂解液、蛋白酶、磷酸酶抑制劑、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；GADPH抗體、AMPK抗體、p-AMPK抗體、羊抗兔二抗均購自Cell Signaling Technology。

1.2 方法

1.2.1 風(fēng)柜斗草提取物制備 風(fēng)柜斗草粉碎過50目篩，取風(fēng)柜斗草粉100 g，用20倍蒸餾水浸泡升溫至70 ℃后60 赫茲頻率超聲萃取2 h，抽濾泵抽濾收集濾液，濾渣用20倍水重復(fù)操作1次，全部濾液負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10～15 mL，冷卻至室溫，加入無水乙醇至70%醇含量，抽濾得上清，負(fù)壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥制得風(fēng)柜斗草提取物(SarcopyramisnapalensisWall extract, SNE)，-80 ℃保存。

1.2.2 試驗(yàn)小鼠分組、造模、給藥 60只雄性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，對(duì)照組飼喂蛋氨酸膽堿充足(methionine-choline-sufficient, MCS)鼠糧，灌喂生理鹽水；MCS+SNE組灌喂400 mg·(kg·bw)-1劑量的風(fēng)柜斗草提取物；模型組飼喂MCD鼠糧，灌喂生理鹽水；MCD+SNE低、中、高劑量組飼喂MCD鼠糧，分別灌喂100、200、400 mg·(kg·bw)-1劑量的風(fēng)柜斗草提取物，造模及藥物干預(yù) 6周。

1.2.3 肝組織病理學(xué)評(píng)估 取5 mm×5 mm×2 mm的小鼠肝組織，將其浸泡在福爾馬林中，一系列的脫水處理，二甲苯透明，將燒的蠟放在烘箱中使其融化，取肝組織進(jìn)行浸蠟，隨后進(jìn)行石蠟包埋，用切片機(jī)切取厚度為5 μm的組織石蠟，進(jìn)行后續(xù)的HE和天狼猩紅染色以及封片觀察，評(píng)估肝脂肪沉積以及纖維化程度。

1.2.4 血清AKP、ALT、AST及肝組織GSH-Px、SOD、MDA檢測(cè) 按照試劑盒說明書進(jìn)行血清AKP、ALT、AST活力水平以及肝組織GSH-Px、SOD活力水平的檢測(cè)，以及肝組織MDA含量的檢測(cè)。

1.2.5 肝組織AMPK蛋白的Western blot分析 取肝組織勻漿，提取總蛋白，用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量，變性，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育抗體過夜(一抗為兔源AMPK、p-AMPK、GAPDH抗體，均按1∶1 000稀釋，二抗為羊抗兔抗體，按1∶2 000稀釋)，顯影，用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.6 肝組織脂質(zhì)代謝和纖維化相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 取肝組織按照試劑盒說明書提取總RNA并且分析RNA的濃度和純度；依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄說明書，在42 ℃ 2 min、37 ℃ 15 min以及85 ℃ 5 sec進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，隨后建立RT-PCR體系，擴(kuò)增并檢測(cè)肝型-脂肪酸結(jié)合蛋白(liver-fatty acid binding protein,L-FABP)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、金屬蛋白酶組織抑制劑-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2,TIMP-2)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)、固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element binding protein 1c,SREBP-1c)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-3(fatty acid transport protein-3,FATP-3)、脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-4(fatty acid transport protein-4,FATP-4)、細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表達(dá)，引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 引物序列

反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，53～60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(40個(gè)循環(huán)周期)和72 ℃ 10 min。脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)量以GAPDH為內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化，計(jì)算出目的基因以及內(nèi)參基因的Ct平均值，利用公式(2-ΔΔCt)計(jì)算結(jié)果。

1.2.7 肝組織非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析 采用LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行非靶向脂質(zhì)組學(xué)分析，利用高分辨率質(zhì)譜儀Q Exactive(Thermo Fisher Scientific, USA)，分別采集正離子和負(fù)離子兩種模式的數(shù)據(jù)來增加脂質(zhì)檢測(cè)覆蓋度。使用LipidSearch 4.1軟件進(jìn)行LC-MS/MS數(shù)據(jù)處理，包括智能峰提取、脂質(zhì)鑒定、峰對(duì)齊等的一系列分析。使用代謝組學(xué) R 軟件包metaX進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過PCA模型觀察樣本的組間差異情況，使用PLS-DA模型前兩個(gè)主成分的VIP值，結(jié)合差異變化倍數(shù)分析和T檢驗(yàn)篩選差異脂質(zhì)分子。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)分析 采用Graphpad prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析Turkey多重比較，P<0.05(差異顯著)，P<0.01(差異極顯著)作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 肝組織病理學(xué)評(píng)估

2.1.1 肝脂肪變性和炎癥評(píng)估 肝石蠟切片HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照MCS組的小鼠肝切片，MCD組肝細(xì)胞中出現(xiàn)大量脂質(zhì)積聚，脂質(zhì)聚集導(dǎo)致細(xì)胞核向一側(cè)偏移，肝靜脈索周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)參差不齊，可見炎性細(xì)胞浸潤及炎癥簇；MCS+400 mg·(kg·bw)-1SNE組中肝靜脈索周圍細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列整齊，細(xì)胞內(nèi)無明顯脂質(zhì)出現(xiàn)，這說明 MCS+400 mg·(kg·bw)-1SNE組不會(huì)對(duì)小鼠的肝造成影響；MCD+200 mg·(kg·bw)-1SNE、MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組對(duì)比MCD組，肝細(xì)胞中脂質(zhì)積聚顯著減少，較少見炎癥簇，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)整齊邊界清楚(圖1)。

2.1.2 肝纖維化情況評(píng)估 肝石蠟切片天狼猩紅染色結(jié)果顯示，對(duì)照MCS組的小鼠肝切片，MCD組小鼠肝纖維化明顯；MCS+400 mg·(kg·bw)-1SNE組中肝細(xì)胞排列緊密整齊，未見異常情況；MCD+100 mg·(kg·bw)-1SNE組、MCD+200 mg·(kg·bw)-1SNE組、MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組小鼠肝切片中纖維化較MCD組都有明顯改善，且隨劑量的增加纖維化改善越明顯，在MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組中已未見明顯的纖維化(圖2)。

2.2 風(fēng)柜斗草提取物對(duì)MCD模型小鼠血清中AKP、ALT、AST活力水平以及肝組織中 GSH-Px和SOD活力水平及MDA含量的影響

如表2血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，給予風(fēng)柜斗草提取物100、200、400 mg·(kg·bw)-1時(shí)均可顯著降低MCD飼料飼喂的小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶的活力(P<0.05)，同樣說明風(fēng)柜斗草提取物可以顯著改善MCD飲食誘導(dǎo)的脂肪肝炎；給予風(fēng)柜斗草提取物均可顯著降低MCD飼料飼喂的小鼠肝組織中丙二醛的含量(P<0.05)，顯著提高小鼠肝中谷胱甘肽過氧化物酶的活力(P<0.05，表2)。

2.3 風(fēng)柜斗草提取物對(duì)MCD模型小鼠肝中AMPK激活水平的影響

上述結(jié)果顯示，400 mg·(kg·bw)-1劑量的風(fēng)柜斗草提取物改善脂肪肝炎和纖維化效果最好，后續(xù)藥理機(jī)制研究采用400 mg·(kg·bw)-1劑量開展。Western blot檢測(cè)肝組織AMPK磷酸化結(jié)果顯示，與MCS組相比，MCD飼料飼喂小鼠肝中AMPK蛋白的活性(P<0.05)被顯著抑制；MCS+400 mg·(kg·bw)-1SNE組與MCS組中AMPK的激活情況沒有顯著差異；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組小鼠肝AMPK被顯著激活了(圖3)。

與MCS組相比，*.P<0.05；與MCD組相比，#.P<0.05

2.4 風(fēng)柜斗草提取物對(duì)MCD模型小鼠肝中脂肪酸與纖維化相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平的影響

檢測(cè)肝中脂肪酸合成相關(guān)基因SREBP-1c和FAS的mRNA表達(dá)水平可得(表3)：與MCS組相比，MCD組的SREBP-1c的mRNA表達(dá)水平升高49.0%(P>0.05)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組的SREBP-1c mRNA水平被極顯著地抑制，使其表達(dá)量降低了59.7%(P<0.001)，這與小鼠肝中AMPK蛋白磷酸化結(jié)果形成印證。而MCD組相比MCS組，F(xiàn)AS的mRNA表達(dá)水平顯著下降52.0%(P<0.05)；對(duì)比MCD組，MCD + 400 mg·(kg·bw)-1SNE組中FAS的mRNA表達(dá)水平升高91.7%(P<0.05)。結(jié)合AMPK激活情況分析，風(fēng)柜斗草提取物可抑制MCD飼料飼喂小鼠肝脂肪酸的合成。

檢測(cè)肝中脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因L-FABP、FATP-3和FATP-4的mRNA表達(dá)水平可得(表3)：與MCS組相比，MCD組的L-FABP的mRNA表達(dá)水平極顯著升高147.0%(P<0.001)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組L-FABP的mRNA表達(dá)水平下降了68.8%(P<0.001)。分析FATP-3的mRNA表達(dá)水平，MCD組相比MCS組升高了43.0%，但沒有顯著差異(P>0.05)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組FATP-3的mRNA表達(dá)水平顯著的下降了57.3%(P<0.05)。分析FATP-4的mRNA表達(dá)水平，與MCS組相比，MCD組的FATP-4 mRNA表達(dá)水平極顯著升高了93.0%(P<0.001)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組的FATP-4 mRNA表達(dá)水平極顯著地下降了59.0%(P<0.001)。由此可見，風(fēng)柜斗草提取物可改善 MCD 飼料飼喂小鼠肝中與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的基因表達(dá)，通過抑制L-FABP、FATP-3和FATP-4的基因表達(dá)來減少肝對(duì)脂肪酸的攝取。

表3 風(fēng)柜斗草提取物對(duì)MCD模型小鼠肝中SREBP-1c、FAS、L-FABP、FATP-3、FATP-4 mRNA表達(dá)水平的影響

檢測(cè)肝中炎癥相關(guān)基因ICAM-1、VCAM-1以及纖維化相關(guān)因子MMP-2、TIMP-2的mRNA表達(dá)水平可得(表4)：與MCS組相比，MCD組的ICAM-1的mRNA表達(dá)水平極顯著升高了51.0%(P<0.01)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組ICAM-1的mRNA表達(dá)水平下降了37.1%(P<0.01)。分析VCAM-1的mRNA表達(dá)水平，MCD組相比MCS組升高了346%(P<0.001)；對(duì)比MCD組，MCD +400 mg·(kg·bw)-1SNE組VCAM-1的mRNA表達(dá)水平下降了38.8%(P<0.001)。分析MMP-2的mRNA表達(dá)水平，MCD組相比MCS組升高了347%(P<0.001)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組MMP-2的mRNA表達(dá)水平下降了61.7%(P<0.001)。TIMP-2的mRNA表達(dá)水平分析結(jié)果則顯示，MCD組相比MCS組升高了151%(P<0.01)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組TIMP-2的mRNA表達(dá)水平下降了43.8%(P<0.01)。

表4 風(fēng)柜斗草提取物對(duì)MCD模型小鼠肝中ICAM-1、VCAM-1、MMP-2、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 肝脂質(zhì)代謝組學(xué)分析

2.5.1 差異脂質(zhì)分子分析 差異脂質(zhì)分子的聚類分析，首先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了log2轉(zhuǎn)換，采用層次聚類方法(hierarchical cluster)對(duì)差異脂質(zhì)分子進(jìn)行聚類分析。距離計(jì)算使用歐氏距離(Euclidean distance)，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化方法選擇Z-score(zero-mean normalization)。結(jié)果如圖4，圖中的每一列代表一個(gè)差異離子，每一行代表一個(gè)樣本，不同顏色表示不同的強(qiáng)度。從綠色到紅色，表示強(qiáng)度從低到高(圖4A-B)。

圖4 MCD_MCS(A)和MCD_MCD+400 mg·(kg·bw)-1 SNE(B)差異脂質(zhì)分子的聚類分析熱圖

2.5.2 脂質(zhì)亞類的定量分析 檢測(cè)到的不同脂質(zhì)亞類在各組樣本中的相對(duì)含量結(jié)果如圖5所示，與MCS組相比，MCD組小鼠肝中甘油三酯(triglyceride, TG)、磷脂酰膽堿(phosphatidyl cholinelecithin, PC)、神經(jīng)酰胺(ceramide, Cer)、磷脂酰甘油(phosphatidyl glycerol, PG)的相對(duì)含量顯著升高(P<0.05)，同時(shí)鞘磷脂(sphingomyelin, SM)、輔酶Co(Q9)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine, PE)、二甲基磷脂酰乙醇胺(phosphatidyldimethyl ethanolamine, dMEPE)、單半乳糖二酰甘油脂(monogalactosyl diglyceride, MGDG)、溶血磷脂酰膽堿(lysophosphatidylcholine, LPC)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)的相對(duì)含量顯著下降(P<0.05)，MCS+400 mg·(kg·bw)-1SNE組與MCS組中各物質(zhì)的相對(duì)含量沒有顯著差異(P>0.05)；對(duì)比MCD組，MCD+400 mg·(kg·bw)-1SNE組肝中TG、PC、Cer、PG的相對(duì)含量顯著降低(P<0.05)，鞘磷脂SM、輔酶Q9、PE、dMEPE、MGDG、LPC、PS的相對(duì)含量顯著上升(P<0.05)。

caseA.MCD; caseB.MCD+400 mg·(kg·bw)-1 SNE; caseC.MCD+400 mg·(kg·bw)-1 SNE; Control.MCS

3 討 論

鄭曉艷和陳育青[6]以高脂飼料飼喂SD大鼠建立脂肪肝動(dòng)物模型，應(yīng)用乙醇萃取的風(fēng)柜斗草粗黃酮干預(yù)后改善了肝脂肪沉積以及血清ALT水平，證明風(fēng)柜斗草黃酮具有抑制脂肪肝形成以及脂質(zhì)過氧化的作用，但并未進(jìn)一步探究其改善肝脂肪變性的機(jī)制。本研究則證明了風(fēng)柜斗草水煮醇沉提取物具有改善MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝脂質(zhì)沉積、炎癥和纖維化的作用，同時(shí)進(jìn)一步研究了其作用機(jī)制。本研究使用的風(fēng)柜斗草水煮醇沉提取物中，總多糖占比22.03%，總黃酮占比2.11%，總皂苷占比2.87%，其改善肝脂沉積癥的有效成分仍有待進(jìn)一步研究。

AMPK信號(hào)通路對(duì)維持有機(jī)體糖脂代謝穩(wěn)態(tài)具有特別重要的作用，激活A(yù)MPK可以有效改善包括脂肪性肝病在內(nèi)的一些代謝性疾病[7-9]。有研究報(bào)道，在肝組織中特異表達(dá)激活A(yù)MPK可以顯著改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肥胖和非酒精性脂肪肝[10]。同時(shí)也有研究表明，激活肝AMPK可抑制脂肪酸合成[11]，且其中一種機(jī)制是通過抑制SREBP-1c[12-13]。SREBPs是控制膽固醇、脂肪酸、甘油三酯和磷脂生物合成所需基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子家族，SREBP-1c優(yōu)先控制參與TG合成和積累的基因的表達(dá)[14-15]。AMPK/SREBP通路已被證明是許多天然產(chǎn)物改善脂肪肝病的作用靶點(diǎn)[16-17]。雖然本研究結(jié)果中MCD飲食下調(diào)了而不是上調(diào)肝組織FAS的基因表達(dá)水平，推測(cè)可能是代償性上調(diào)的原因，但發(fā)現(xiàn)風(fēng)柜斗草提取物激活MCD飲食飼喂小鼠肝AMPK，抑制SREBP-1c基因表達(dá)，證明了風(fēng)柜斗草提取物仍然可通過調(diào)控AMPK/SREBP-1c通路改善肝脂肪蓄積。

本研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)柜斗草提取物主要改善MCD飲食誘導(dǎo)小鼠肝TG和PG合成。肝是通過甘油磷酸途徑利用甘油以及脂肪酸合成甘油三酯的。肝中L-FABP與FATP水平升高會(huì)增加肝臟對(duì)脂肪酸的攝取[18-19]，從而促進(jìn)TG和PG合成。L-FABP在肝細(xì)胞大量表達(dá)，可結(jié)合多種配體，如飽和脂肪酸和膽固醇[20]。敲除L-FABP導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪酸攝取減少，抑制脂肪酸β氧化，改善高脂飲食誘導(dǎo)肝脂肪變性[21-22]。FATP在脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮重要作用，F(xiàn)ATP-2、FATP-4與FATP-5與肝攝取脂肪酸能力密切相關(guān)[23-24]。在高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝大鼠中發(fā)現(xiàn)隨著非酒精性肝病程度的加重，F(xiàn)ATP-4表達(dá)明顯增高[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，風(fēng)柜斗草提取物顯著抑制MCD飲食飼喂小鼠肝L-FABP和FATP-4的基因表達(dá)，說明風(fēng)柜斗草提取物也可通過抑制FATP-4與L-FABP表達(dá)來減少肝對(duì)脂肪酸的攝取，從而減少肝中 TG、PG水平，進(jìn)而改善肝脂肪蓄積。

MMPs、TIMPs是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)合成和降解的兩種重要因子，它們已被證明，在肝纖維化形成中發(fā)揮的重要作用[26-27]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)MMP-2和TIMP-2表達(dá)水平在MCD飲食、高脂飲食以及四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化過程中都顯著升高，MMP-2/TIMP-2平衡也被打破[28-30]。本研究證明風(fēng)柜斗草提取物能顯著抑制MCD飲食誘導(dǎo)的MMP-2和TIMP-2表達(dá)，并改善MMP2/TIMP2的動(dòng)態(tài)平衡，進(jìn)而改善MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝的纖維化。為探討脂質(zhì)亞類在肝炎癥和纖維化中的作用，本研究進(jìn)一步利用脂質(zhì)組學(xué)分析了MCD飲食誘導(dǎo)的肝脂沉積癥小鼠肝組織多種脂質(zhì)分子的變化情況以及風(fēng)柜斗草提取物的干預(yù)影響，研究結(jié)果表明，風(fēng)柜斗草提取物顯著提高肝脂沉積癥小鼠肝組織中SM和輔酶Q9相對(duì)含量以及降低Cer相對(duì)含量。近年來有許多研究表明，SM以及其代謝產(chǎn)物Cer參與了包括非酒精性肝病在內(nèi)的一些肝疾病的發(fā)生發(fā)展[31-33]。SM和Cer參與了應(yīng)激及死亡配體誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡[34]；Cer也被證明參與了誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[35-36]，以及抑制胰島素信號(hào)傳導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、損害線粒體功能和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[37]；輔酶Q代謝在非酒精性脂肪肝小鼠中發(fā)生紊亂[38-39]，有研究發(fā)現(xiàn)，高果糖和中鏈反式脂肪酸誘導(dǎo)的脂肪肝炎小鼠的血清輔酶Q9水平也同時(shí)升高[40]。本研究有關(guān)GSH-Px和MDA等抗氧化檢測(cè)結(jié)果證明了風(fēng)柜斗草提取物顯著提高了MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝組織抗氧化水平，改善了肝氧化應(yīng)激狀態(tài)，因此本研究有關(guān)SM、Cer和輔酶Q9的研究結(jié)果提示，風(fēng)柜斗草提取物可通過提高M(jìn)CD飲食誘導(dǎo)的小鼠肝組織中SM和輔酶Q9相對(duì)含量以及降低Cer相對(duì)含量來改善肝細(xì)胞氧化損傷情況，進(jìn)而改善炎癥反應(yīng)和纖維化，但其具體作用機(jī)制未得到深入探討，同時(shí)SM和Cer的具體種類改變情況也沒有闡明，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

風(fēng)柜斗草提取物可顯著改善MCD飼料飼喂的小鼠肝脂質(zhì)沉積、炎癥以及纖維化。其改善肝脂沉積癥的作用機(jī)制可能為通過激活肝脂沉積癥小鼠肝組織AMPK來抑制SERBP-1C 調(diào)控的TG合成，以及通過抑制FATP與L-FABP表達(dá)減少肝對(duì)脂肪酸的攝取，從而減少肝中TG、PG以及其合成所需的相關(guān)物質(zhì)在肝中的含量，進(jìn)而改善肝脂肪變性。更進(jìn)一步地，風(fēng)柜斗草提取物通過提高肝脂沉積癥小鼠肝組織中SM和輔酶Q9相對(duì)含量以及降低Cer相對(duì)含量，改善肝細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷情況而改善肝炎癥反應(yīng)和纖維化。