免疫熒光檢測綿羊體外受精胚胎Oct4、Cdx2表達研究

毛林軍，陳 瑩，雷 熙，彭新榮，齊·阿拉達爾*

(1.新疆農業(yè)大學動物科學學院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學院生物技術研究所，烏魯木齊 830011；3.石河子大學動物科技學院，石河子 832000)

Oct4是迄今人們發(fā)現最早也是最重要的維持胚胎干細胞多潛能性和自我更新的關鍵基因，這種功能遺傳于早期脊椎動物Oct4基因的同系物，并在不同種系之間高度保守[1]。Oct4最初在卵母細胞、早期胚胎和胚胎癌細胞中被發(fā)現。由于胚胎癌細胞與來自胚胎內細胞團(inner cell mass，ICM)的胚胎干細胞具有相似的生物學特性，被廣泛用作研究胚胎發(fā)育的模型[2]。Oct4主要在受精卵、桑椹胚、卵裂球、囊胚內細胞團以及著床后胚胎的上胚層和原始生殖細胞等多能性細胞中表達[3]。例如在小鼠中，將Oct4基因敲除，該胚囊正常植入后不能形成多能性的內細胞團，因此，不能正常著床而停滯發(fā)育，在著床前期囊胚階段(胚胎發(fā)育3.5～4.5 d)死亡。表明Oct4基因在早期胚胎發(fā)育過程中形成多能性細胞是必要的[4]。在多個動物物種上關于Oct4基因的文章已報道過多篇，而在綿羊上的報道很少。在牛胚胎滋養(yǎng)層細胞(trophectoderm，TE)中檢測到Oct4 mRNA[5-6]，而在小鼠上，Oct4僅在內細胞團上表達[7]。與小鼠的高繁殖力相比，反芻動物如牛羊的繁殖力一直比較低，在牛羊中，大約45%的囊胚會在胚胎附植和妊娠識別過程中丟失[8]。在牛羊胚胎進入子宮后，會經歷囊胚擴張、孵化、遷移、伸長、附植，侵潤和胎盤形成等幾個主要過程。牛羊等反芻動物的囊胚在附植前需要在子宮充分的伸長[9],這與小鼠有明顯的不同。在小鼠上，對囊胚發(fā)育的多能基因調控一直是研究熱點。其中，多能轉錄因子Oct4(Pou5f1)的表達逐漸完全限定在囊胚ICM中隨后限定在上胚層細胞(epiblast)中表達[10-11]。內細胞在胚胎植入過程中分化為上胚層(epiblast，EPI)和下胚層(hypoblas，也稱原始內胚層，即primitive endoderm，PrE)[12]。Cdx2基因(caudal related homeobox 2 transcription factor，Cdx2)則完全在囊胚分化的滋養(yǎng)層細胞上表達[13]，Oct4和Cdx2相互負調控，Oct4基因抑制Cdx2的表達，Berg等[6]研究表明，在牛TE上存在Oct4和Cdx2的共表達，牛受精卵第6天左右開始發(fā)育為囊胚，并進入子宮角，牛囊胚TE細胞中檢測到Oct4 mRNA，并可以維持到第12～13天，直到孕體開始延長的時候才在TE中逐漸消失[14-15]，而在小鼠上，Oct4僅在內細胞團上表達[7]。與小鼠胚胎相比，Oct4下調對牛胚胎發(fā)育的影響更為嚴重。不同于小鼠胚胎，Oct4在牛TE中的表達不會消失，即使在完全擴張的囊胚階段也是如此[16]。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

從烏魯木齊市屠宰場采集阿勒泰綿羊卵巢。將采集的新鮮卵巢在37 ℃恒溫條件下3 h內運回實驗室。

1.2 試驗材料

熒光倒置顯微鏡(Olympus)，固定針(Origio)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo)，體視鏡(Olympus)，NUNC四孔板培養(yǎng)皿(Becton Dickinson)，35、60 mm培養(yǎng)皿(Becton Dickinson)，玻璃管(BJ-40細玻管,中國)，15 mL離心管(Corning，USA)，一次性注射器(康福萊醫(yī)療器械有限公司，鄭州，中國)，礦物油(Sigma)，卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液,體外受精液,胚胎培養(yǎng)液。

溶液配方如下：

卵母細胞體外成熟培養(yǎng)液：M199+10% FBS(Gibco)+0.05 IU·mL-1FSH+0.05 IU·mL-1LH+1 μg·mL-1雌二醇+24.2 μg·mL-1丙酮酸鈉+10 ng·mL-1EGF(Gibco)。

體外受精液配方：SOF液+1% NEAA+2% BAA+20% FBS+6 IU·mL-1肝素鈉+100 IU·mL-1慶大霉素。

胚胎培養(yǎng)液配方：SOF液+1% NEAA+2% BAA+100 IU·mL-1雙抗+5 mg·mL-1BSA。

本試驗中未注明試劑均購自Sigma Aidrich(Saint Louis, USA)公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 卵母細胞成熟 屠宰場取阿勒泰羊卵巢，用滅菌的生理鹽水洗滌卵巢2～3次后，再抽取直徑為2～8 mm卵泡，用PBS緩沖液稀釋后，在體視顯微鏡下收集形態(tài)正常和結構完整的A、B級卵母細胞，將卵母細胞用PBS緩沖液洗3次后，再用卵母細胞成熟液洗2次，放入預先平衡好的成熟培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)24 h[4]。培養(yǎng)條件為：38.5 ℃，5% CO2和飽和濕度。

在體視顯微鏡下觀察卵丘細胞擴展狀態(tài)，用0.1%的透明質酸酶對成熟后的卵母細胞進行處理,除去大部分卵丘細胞,并用受精液洗滌3次后置于裝有0.5 mL受精液的四孔板內備用。

1.3.2 卵母細胞的體外受精 從液氮罐中取薩?？搜虻膬鼍?，40 ℃ 水浴解凍，將解凍后的精液移入3 mL平衡好的獲能液底部，在培養(yǎng)箱中使精子孵育上游30 min，使精子獲能，然后取上清1.5 mL，1 500 r·min1離心5 min，去上清液，底部即為獲能精子，將獲能后的精子用受精液重懸，按照1×105個·ml-1輕輕加入含有成熟卵母細胞的四孔板中，放入CO2培養(yǎng)箱中受精24 h[17]。

1.3.3 胚胎培養(yǎng) 體外受精胚胎用胚胎培養(yǎng)液洗3次，然后放入胚胎培養(yǎng)液中，置38.5 ℃，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，受精48 h后統(tǒng)計卵裂率，培養(yǎng)168 h后統(tǒng)計囊胚率。

1.3.4 胚胎免疫熒光染色 胚胎樣品在4%多聚甲醛固定過夜，PBS洗5 min(3次)，吸去PBS；用5%山羊血清封閉；用含0.2% Triton-100的PBS通透30 min，加入PBS洗5 min(3次)，吸去PBS；加入anti-OCT4一抗(Abcom-19857)或者anti-CDX2(Abcom-227201)一抗，4 ℃ 孵育過夜，吸去一抗，加入PBS洗5 min(3次)，吸去PBS；加入用Alexa Fluor 488或546(red)標記的二抗(Abcom)，室溫孵育60 min，PBS洗3 min(3次)，胚胎細胞核用DAPI(1 mg·mL-1)染核5 min，加入PBS洗5 min(3次)，吸去PBS，將胚胎用封片劑固定于載玻片上，用熒光顯微鏡觀察[18]。

2 結 果

2.1 綿羊體外囊胚的直徑和細胞數

對體外培養(yǎng)的胚胎進行了卵裂率和囊胚率的統(tǒng)計，結果如表1所示，經過體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)的阿勒泰羊胚胎卵裂率為79%，卵裂后的胚胎體外培養(yǎng)168 h后，可獲得大量的囊胚，結果如圖1a和圖1b所示。阿勒泰羊體外胚胎囊胚率為62%。此時的囊胚包括不同直徑的早期囊胚、擴張囊胚和孵化囊胚(圖1b)。

表1 綿羊卵母細胞體外受精后卵裂率和囊胚率

胚胎發(fā)育至囊胚期后，出現了細胞形態(tài)學上第一次明顯的分化：即分化為外周扁平的TE細胞和內側團狀ICM細胞(圖1c、1d)，TE細胞在囊胚外層形成單層球狀結構,內部包裹ICM和囊胚液，ICM為致密的團塊狀[19]。

如圖1a所示，發(fā)育阻滯的胚胎未形成囊胚，其透明帶沒有擴張，胚胎直徑在160 μm以下(結果未顯示)。對早期囊胚、擴張囊胚和孵化囊胚的直徑分別進行測量，結果如圖1e所示：綿羊早期囊胚直徑在160 μm以下，此時透明帶還沒有明顯的擴張；擴張囊胚直徑范圍在160 μm～240 μm之間，此時透明帶明顯變薄，但是胚胎還未從透明帶中孵出。由于囊胚從透明帶孵化后直徑迅速增加，孵化囊胚直徑一般在240～340 μm之間。根據試驗結果，推測體外獲得的綿羊囊胚開始孵化的直徑臨界區(qū)間在200～220 μm。

a.發(fā)育至168 h的綿羊胚胎(40×)；b.發(fā)育至168 h的綿羊胚胎(100×)；c.早期囊胚(200×)；d.擴張囊胚(200×)；e.發(fā)育至囊胚階段的胚胎直徑分布圖

為進一步分析不同發(fā)育時期囊胚的細胞數，并確定ICM和TE細胞的形態(tài)和位置，本試驗收集了體外培養(yǎng)168 h后的囊胚，對不同發(fā)育階段的囊胚進行DAPI染色，統(tǒng)計各階段囊胚的總細胞數。DAPI是細胞核熒光染料，表示細胞核所在位置，結果如圖2所示：同一時間發(fā)育至囊胚階段的胚胎不僅在細胞直徑上有所差異，且在細胞總數上有明顯的不同。早期囊胚細胞數較少，細胞數在100以下(圖2a)；擴張囊胚一般細胞數為200個以下(圖2b、2c)；同一時期孵化囊胚細胞數可以達到280個，結果表明在同一培養(yǎng)條件下，胚胎分裂增殖速度差異明顯。

a.早期囊胚，總細胞數53；b.擴張囊胚，總細胞數129；c.擴張囊胚，總細胞數175；d.孵化囊胚，總細胞數280，紅色箭頭所示為ICM區(qū)域

2.2 綿羊胚胎的Oct4和Cdx2基因的表達分析

2.2.1 不同發(fā)育時期綿羊胚胎Oct4基因的免疫熒光染色 為分析阿勒泰羊早期胚胎不同發(fā)育階段Oct4基因在表達，分別對2～8細胞期，16～32細胞期和囊胚期胚胎進行了Oct4基因的免疫熒光染色，染色結果表明，阿勒泰羊早期胚胎在2～8細胞期胚胎內均未檢測到Oct4基因的表達(結果未顯示)；在阿勒泰羊16～32細胞期中Oct4基因出現表達(圖3A)，由于Oct4基因是轉錄因子，主要在細胞核表達，因此和DAPI的細胞核定位染色相互重疊(圖3A)，染色結果提示：在阿勒泰羊胚胎16～32細胞期并不是所有的細胞都檢測到Oct4基因的表達，只有部分細胞表達Oct4基因(圖3A)。胚胎發(fā)育至囊胚期后，細胞分化為外圍扁平的TE細胞和內部團塊狀的ICM，從免疫熒光染色結果看，在擴張期和孵化期囊胚，Oct4基因不僅在內細胞團中表達(圖3B、3C)，也在大部分TE細胞中表達，這與小鼠的Oct4基因表達模式不同。Oct4基因是多能基因，但是在綿羊上，不僅觀察到Oct4基因在內細胞團中表達，而且在擴張囊胚分化的TE細胞上也有表達(圖3B)。

2.2.2 囊胚期TE細胞Cdx2免疫熒光染色 對囊胚期胚胎Cdx2基因進行免疫熒光染色，結果如圖3D所示：作為TE的標記基因，Cdx2基因在囊胚期分化的TE細胞上表達。由于囊胚期胚胎為多層球狀體，TE細胞在外側包裹著內部的內細胞團細胞，本試驗免疫熒光染色顯示：在內細胞團所在區(qū)域未見明亮的團塊狀熒光區(qū)域，Cdx2基因在綿羊內細胞團上不表達(圖3D)。本試驗結果證實：綿羊囊胚期TE細胞上存在Oct4和Cdx2的共表達。由于體外培養(yǎng)條件的限制，綿羊胚胎只能培養(yǎng)到囊胚階段，Oct4在綿羊附植前胚胎TE中何時消失，還需要進一步的研究證實。

3 討 論

在過去20年當中，利用體外胚胎生產技術已經成功得到了大多數的家養(yǎng)動物的后代[20-24]。然而，當前無論從胚胎形態(tài)還是物質代謝方面，體外生產的胚胎在質量上都還達不到體內胚胎的水平[25]。體外受精效率的提高不僅要求卵母細胞成熟和精子獲能的能力，同時體外培養(yǎng)環(huán)境，包括培養(yǎng)液對促進體外胚胎的生產都具有重要作用[26]。當前在綿羊體外受精胚胎生產過程中，國內外研究者大多參考和借鑒牛體外受精胚胎生產的體系和方法，并在此基礎上加以完善[27]。

本研究應用免疫熒光染色對體外培養(yǎng)的受精卵、卵裂胚、桑葚胚和囊胚進行了Oct4蛋白的檢測。結果表明：受精卵和早期卵裂胚未檢測到Oct4蛋白；16～32細胞期桑葚胚部分細胞表達Oct4蛋白表達。根據研究結果推測：雖然此時胚胎還未出現真正意義上第一次細胞分化(分化為外側的TE和內部的ICM)，胚胎細胞間已經出現了明顯的表達差異性。小鼠上的研究也證實：在4細胞期胚胎的不同卵裂球之間，多能基因Oct4和Cdx2的表達已經出現了明顯差異[6]，本研究提示：Oct4在第一次細胞分化過程中可能起到了重要調控作用。本研究還表明：在阿勒泰綿羊囊胚細胞中TE和ICM均表達Oct4。而早表達Oct4基因的細胞將發(fā)育為TE還是ICM,還需要進一步驗證。

本研究通過免疫熒光染色表明囊胚TE的細胞核上Oct4持續(xù)表達，Oct4在TE上與Cdx2存在共表達。Oct4基因和Cdx2基因互相抑制，Oct4可以負調控Cdx2基因的表達，Cdx2也可以通過抑制Oct4基因增強子的表達，而降低Oct4表達水平[28]。卵裂球中Cdx2分布的高低水平是影響小鼠胚胎進行不對稱分裂次數和ICM細胞數的關鍵影響因子[6]，升高Cdx2的表達，可以促進TE細胞分化和增殖，相反，降低胚胎中Cdx2的表達則促進了ICM的數量。因此，Cdx2和Oct4基因的協(xié)調表達決定了胎盤和胎兒的發(fā)育。

在牛上，TE細胞中Oct4基因表達下調非常緩慢，導致TE中出現Oct4和Cdx2基因的共表達[29]。在胚胎附植前，干擾素(interferon-tau，IFNT)是母體妊娠識別過程最主要的功能蛋白[6]，IFNT由反芻動物TE的單核細胞產生，自發(fā)現至今已經有三十多年的歷史，但是目前還沒有好的方法可以調控IFNT的分泌。Cdx2是IFNT轉錄必需的轉錄因子[8,16]。此外，Cdx2還可維持IFNT基因處于松散的常染色質狀態(tài)，從而有利于IFNT的轉錄[30]，促進胚胎的附植。IFNT的轉錄還需要轉錄因子激活蛋白CREBBP(cAMP-response element binding protein)，AP1和ETS2形成復合物[31],AP1-CREBBP-ETS2復合物必須結合到IFNT基因的上游的啟動子區(qū)和增強子區(qū)域，才能啟動IFNT的轉錄。Oct4基因的POU結合域可以與ETS2的中央結合域直接結合，從而抑制AP1-CREBBP-ETS2復合物的產生[32]，進而不利于TE細胞轉錄IFNT。因此，Oct4可以通過抑制Cdx2的表達，間接影響IFNT的轉錄，也可以通過抑制AP1-CREBBP-ETS2復合物而直接抑制IFNT的轉錄，因此，Oct4在胚胎TE中的持續(xù)表達，可能對胎盤發(fā)育及胚胎在子宮附植產生不利的影響。

4 結 論

本研究通過體外成熟、體外受精和體外培養(yǎng)獲得了不同發(fā)育時期的綿羊胚胎，應用免疫熒光染色探討了Oct4在早期胚胎的表達規(guī)律，結果表明：受精卵，早期卵裂胚未檢測到Oct4蛋白；16～32細胞期桑葚胚部分細胞表達Oct4蛋白；Oct4與Cdx2基因在綿羊囊胚TE中存在共表達。這一現象在反芻動物如牛上也有報道，證實了牛早期囊胚TE上存在大量Oct4基因的mRNA，但作者并未通過熒光染色證實Oct4蛋白的表達[6]。作為重要的多能轉錄因子，Oct4在TE細胞中表達的生物學意義目前還不清楚。應當關注的問題是：Oct4基因表達在牛羊胚胎TE細胞中如何調控？能否像小鼠一樣，Oct4是否可以在牛羊TE中迅速消失？Oct4在牛羊TE細胞迅速消失后，IFNT表達能否升高，從而提高妊娠率？鑒于牛羊大動物胚胎在子宮中伸長，識別和附植失敗是導致妊娠率低的主要原因，因此，有必要對早期胚胎Oct4基因表達規(guī)律和調控機制進行深入分析，以及找到提高妊娠率的關鍵靶點。