蜱攜帶牛丙型肝炎病毒新亞型巢式PCR檢測(cè)方法的建立

郭鑾英，王妮娜，李杭遠(yuǎn)，紀(jì)雨霏，馬 駿，裴明超，邵建偉，劉 全

(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，是黃病毒科(Flaviviridae)、丙型肝炎病毒屬(Hepacivirus)的成員，是人患肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因之一[1]。HCV慢性感染是一個(gè)全球性的健康問(wèn)題。據(jù)估計(jì)，全球超過(guò)1.84億人感染HCV[2]，每年有300萬(wàn)～400萬(wàn)新感染病例。丙型肝炎病毒不僅存在于人類，也存在各種動(dòng)物中，包括馬[3-4]、嚙齒動(dòng)物[5]、蝙蝠[6]和非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物[7]。2015年，Baechlein等[8]首次發(fā)現(xiàn)HCV可以感染牛，并證實(shí)了該病毒為丙型肝炎病毒屬的一個(gè)新種——丙型肝炎病毒N(Hepacivirus N，HNV)。因?yàn)榕Ｊ瞧涮禺愋运拗鳎蔋NV又被稱為牛丙型肝炎病毒(BovHepV)[2]。截至2020年，BovHepV共分為7個(gè)亞型(A～G型)，我國(guó)主要流行E和G型[9]。HNV具有強(qiáng)嗜肝性，主要造成牛無(wú)癥狀持續(xù)性感染，感染時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)13個(gè)月[10]。

HNV在(我國(guó))牛群中普遍存在，但HNV的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。在之前的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用血清學(xué)檢測(cè)方法時(shí)，黃病毒科的病毒間普遍存在交叉反應(yīng)現(xiàn)象，因此血清學(xué)檢測(cè)方法可能不適用于HNV的臨床快速診斷。PCR技術(shù)已成為多種病毒早期臨床檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，而巢式PCR是PCR的優(yōu)化方法，具有敏感性高、特異性強(qiáng)，重復(fù)性好的特點(diǎn)。因此，建立HNV病毒的巢式PCR檢測(cè)方法，可有助于HNV病毒在臨床上的快速診斷。

本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)采集自牛體表的蜱進(jìn)行了宏轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序，經(jīng)試驗(yàn)獲取到1株病毒全基因組，基于保守基因NS3、NS5B構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)其為HNV新亞型，命名為BovHepV-GDZJ(GenBank登錄號(hào)MZ221927)。為了更好地鑒別、監(jiān)測(cè)、防控以及深入研究該新亞型病毒的流行情況，本研究結(jié)合蜱樣品中的BovHepV的高通量測(cè)序結(jié)果，探索并建立了針對(duì)該病毒株的巢式PCR檢測(cè)方法。經(jīng)試驗(yàn)證明，該方法敏感性高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)，具有較好的臨床檢測(cè)應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2020年6—10月，在廣東省湛江市牛養(yǎng)殖場(chǎng)采集蜱115只；在揭陽(yáng)市牛養(yǎng)殖場(chǎng)采集蜱59只；在廣東省佛山市犬身上，采集蜱126只。經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，蜱均為扇頭蜱屬，其中，微小扇頭蜱59只、鐮形扇頭蜱241只。

1.1.2 病毒毒株或病毒核酸 BovHepV-GDZJ、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、阿龍山病毒(Alongshan virus，ALSV)、廣平病毒(Quang Binh virus)、Lihan蜱病毒(Lihan tick virus，LTV)、發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)等病毒毒株或病毒核酸均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 主要試劑與儀器 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、PremixTaq、pMDTM18-T Vector Cloning Kit試劑盒、PrimeScript One Step RT-PCR kit Ver 2(寶日醫(yī)生物技術(shù)北京有限公司)；TRIzol LS 試劑(賽默飛世爾科技中國(guó)有限公司)；TIANprep Mini Plasmid Kit質(zhì)粒小提試劑盒；組織研磨機(jī)(QIAGEN，德國(guó))；超低溫冰箱(海爾DW-40L508)；渦旋混勻器(WIGGENS，德國(guó))；三槽基因擴(kuò)增儀(Biometra TRIO 48)；經(jīng)典電泳儀電源(WIX-EP600C)；恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)；Axygen瓊脂糖凝膠回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 蜱樣品RNA的提取 根據(jù)MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說(shuō)明書(shū)，提取蜱樣品RNA。本研究所使用的RNA終濃度約200 ng·μL-1或使用量為1 ng·50 μL-1體系。

1.2.2 BovHepV序列豐度分析 使用軟件Geneious、PUTTY和FileZilla，結(jié)合宏轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)室獲得的BovHepV全基因組進(jìn)行簡(jiǎn)易可視化定量分析。

1.2.3 HNV巢式PCR引物的設(shè)計(jì) 根據(jù)廣東湛江地區(qū)的蜱樣品宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，比較BovHepV基因組信息及mRNA表達(dá)量；利用生物學(xué)軟件Primer Primeier 6、Oligo 7，在病毒mRNA表達(dá)量相對(duì)高的區(qū)域設(shè)計(jì)巢式PCR引物。引物經(jīng)NCBI在線功能Primer-BLAST驗(yàn)證，對(duì)蜱傳或蜱攜帶的多種病原體，如無(wú)形體、立克次體均無(wú)非特異性擴(kuò)增。引物序列見(jiàn)表1，由廣州天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成，引物使用濃度均為10 μmol·L-1。

表1 巢式PCR引物

1.2.4 BovHepV巢式PCR檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化 以陽(yáng)性樣品為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增并優(yōu)化退火溫度。一輪RT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)：滅菌去離子水2.8 μL，2×1 Step Buffer 5 μL，上游及下游引物各0.4 μL，PrimeScript Enzyme 酶0.4 μL，模板1.0 μL。一輪RT-PCR反應(yīng)條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56、57、58、59、60、61 ℃(6個(gè)不同溫度)30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min;4 ℃ 保溫。巢式PCR反應(yīng)體系(50 μL)：滅菌去離子水18.5 μL、PremixTaq25.0 μL、上游引物及下游引物各2 μL、模板2.5 μL。二輪PCR反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 30 s，55、56、57、58、59、60、61 ℃(7個(gè)不同溫度)30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 BovHepV-GDZJ株標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以陽(yáng)性樣品的cDNA為模板，上游引物BovHepV-F：5′-AACCACTGCTGCTCGTCTG-3′，下游引物BovHepV-R：5′-ACGCAGTCGCCTTCAGTT-3′進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增終產(chǎn)物大小為2 094 bp。反應(yīng)體系共50 μL：滅菌去離子水18.5 μL、PremixTaq25.0 μL、上游引物及下游引物各2 μL、模板2.5 μL。反應(yīng)條件：98 ℃ 1 min;98 ℃ 30 s;59 ℃ 30 s;72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min;4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過(guò)核酸凝膠電泳、膠回收后連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，于含氨芐青霉素的培養(yǎng)板37 ℃培養(yǎng)12 h，挑單個(gè)菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR鑒定后，陽(yáng)性克隆送公司測(cè)序。提取質(zhì)粒，采用分光光度計(jì)測(cè)定濃度，計(jì)算質(zhì)粒copies數(shù)。Copies數(shù)=質(zhì)量濃度(mg·L-1)×6.023×1014/(堿基數(shù)×660)。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 用巢式PCR方法檢測(cè)蜱攜帶病毒的核酸，包含HNV、LCMV、ALSV、廣平病毒、SFTSV，以滅菌去離子水作為陰性對(duì)照，擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或鑒定。

1.2.7 敏感性試驗(yàn) 10倍梯度稀釋(105～10-1copies·μL-1)的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，滅菌去離子水作為陰性對(duì)照，瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證檢測(cè)一輪PCR產(chǎn)物和二輪PCR產(chǎn)物，統(tǒng)計(jì)檢出質(zhì)粒DNA的最小拷貝數(shù)。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 以構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒為模板，進(jìn)行組內(nèi)試驗(yàn)和組間試驗(yàn)。組內(nèi)試驗(yàn)，取3個(gè)不同濃度梯度(105～103copies·μL-1)的BovHepV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為重復(fù)性試驗(yàn)的檢測(cè)對(duì)象，每個(gè)梯度重復(fù)3次；組間試驗(yàn)，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每間隔1周做1次BovHepV的巢式PCR檢測(cè)試驗(yàn)，連續(xù)3周。比較組內(nèi)、組間試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果，評(píng)估該方法的可重復(fù)性。

1.2.9 蜱樣品檢測(cè) 采用PCR方法和巢式PCR方法，對(duì)2020年在廣東地區(qū)采集的蜱樣品進(jìn)行檢測(cè)，疑似陽(yáng)性條帶的PCR產(chǎn)物均經(jīng)測(cè)序方法驗(yàn)證，比較并分析兩種檢測(cè)方法的檢測(cè)效率。

2 結(jié) 果

2.1 BovHepV-GDZJ序列豐度分析

蜱樣本宏轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中，BovHepV-GDZJ株全基因組序列的可視化定量分布見(jiàn)圖1。以BovHepV-GDZJ的全基因組序列為內(nèi)參序列，樣品高通量測(cè)序結(jié)果共有224個(gè)reads定向到該內(nèi)參序列上，獲得了92.1%的基因組覆蓋率(8 115 nt/8 808 nt，兩兩相似性為99.7%。病毒reads占非核糖體reads總數(shù)的百分比為0.003 8%(224 reads/5 883 446 reads)。其中，BovHepV-GDZJ株基因組序列上的1 743―2 665、3 833―4 205、7 877―8 622位區(qū)域序列豐度較高，在高豐度區(qū)域設(shè)計(jì)本研究巢式PCR引物。

圖1 廣東湛江BovHepV-GDZJ基因組高通量測(cè)序拼接圖

2.2 巢式PCR檢測(cè)方法的優(yōu)化

以陽(yáng)性樣品RNA為模板，通過(guò)調(diào)整不同的退火溫度，篩選最適退火溫度，結(jié)果如圖2所示。6個(gè)退火溫度均能產(chǎn)生與預(yù)期大小相符的目的條帶，其中58 ℃溫度條帶最清晰且無(wú)明顯雜帶或拖帶。將二輪PCR退火溫度設(shè)為55、56、57、58、59、60、61 ℃，結(jié)果顯示7個(gè)退火溫度均能產(chǎn)生目的條帶，其中第二輪退火溫度最適為56～57 ℃。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.55 ℃；2～7.56～61 ℃；8.陰性對(duì)照

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

將BovHepV目的基因克隆至pMD18-T載體。經(jīng)PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，目的片段為2 094 bp，與預(yù)期大小一致。后將質(zhì)粒送往測(cè)序，確定成功構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。超微量分光光度計(jì)測(cè)得重組質(zhì)粒濃度為276.70 ng·μL-1，根據(jù)公式計(jì)算得知，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為6.86×1010copies·μL-1。

2.4 特異性、敏感性及重復(fù)性檢驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，此方法僅能擴(kuò)增BovHepV-GDZJ質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)其他病原無(wú)反應(yīng)，表明該巢式PCR方法的特異性較好。

敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，一輪PCR的檢測(cè)下限為6.8×103copies·μL-1(圖3A)。巢式PCR檢測(cè)下限為6.8 copies·μL-1，結(jié)果表明，本方法具有較高的敏感性，巢式PCR比一輪PCR敏感性高1 000倍(圖3B)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～7.105～10-1；8.陰性對(duì)照

組間及組內(nèi)試驗(yàn)均能出現(xiàn)單一目的條帶，表明本方法具有良好的重復(fù)性。

2.5 蜱樣品檢測(cè)

采用PCR和巢式PCR方法分別檢測(cè)300份蜱樣中HNV的流行情況。檢測(cè)結(jié)果經(jīng)基因測(cè)序方法驗(yàn)證，揭陽(yáng)市和佛山市的蜱樣中均未檢測(cè)到BovHepV-GDZJ，而湛江市蜱樣中，PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為33.04%(38/115)，巢式PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率為46.09%(53/115)。結(jié)果說(shuō)明巢式PCR靈敏性明顯優(yōu)于PCR。

3 討 論

HNV會(huì)造成牛無(wú)癥狀持續(xù)性感染[8]，對(duì)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展構(gòu)成了潛在威脅。同時(shí)，我國(guó)在商品化的胎牛血清中也檢測(cè)出HNV核酸[9]，揭示HNV可能對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)等科研試驗(yàn)及疫苗制備造成不利影響。HNV在全球廣泛分布流行，但關(guān)于HNV的傳播方式、傳播途徑、流行情況及早期快速檢測(cè)方法均存在較大研究空間。

目前，HCV的檢測(cè)方法有血清學(xué)方法和分子學(xué)方法[11]。血清學(xué)方法包括重組免疫印跡試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。分子學(xué)方法有直接測(cè)序、特異性引物PCR法、特異性探針雜交法等，一部分丙型肝炎病毒是通過(guò)高通量測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)的。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)HNV的發(fā)現(xiàn)及研究都是基于高通量測(cè)序技術(shù)和PCR方法，還未有系統(tǒng)的分子學(xué)或血清學(xué)檢測(cè)方法，HNV的鑒定及檢測(cè)采用何種方法，主要取決于實(shí)驗(yàn)室的現(xiàn)有條件及目的。對(duì)臨床而言，能確定病毒基因型、評(píng)估牛丙型肝炎病毒在動(dòng)物種群中受感染的比率及感染既往史，血清學(xué)調(diào)查可以提供比核酸檢測(cè)更真實(shí)的結(jié)果；對(duì)于流行病學(xué)研究而言，準(zhǔn)確定位到病毒亞型的檢測(cè)試驗(yàn)也是必需的。

此外，本研究結(jié)果提示，蜱很可能是HNV機(jī)械性傳播媒介而不是自然宿主。與澳大利亞一項(xiàng)關(guān)于蜱中發(fā)現(xiàn)嚙齒動(dòng)物肝炎病毒的研究類似[12]，BovHepV-GDZJ在蜱高通量數(shù)據(jù)集中表現(xiàn)出極低的豐度(0.003 8%)，加上HNV在黃病毒科系統(tǒng)發(fā)育中的位置，表明該病毒很可能來(lái)自蜱的脊椎動(dòng)物宿主，并且主要存在于飽血蜱的血液中，而不是來(lái)自蜱本身，也可能不感染蜱或在蜱中進(jìn)行復(fù)制。本研究的蜱存在BovHepV高陽(yáng)性率是因?yàn)楸敬螜z測(cè)的蜱樣品采集自同一個(gè)牛養(yǎng)殖場(chǎng)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。后續(xù)可重點(diǎn)關(guān)注飽血蜱及未吸血蜱攜帶HNV的流行情況、進(jìn)行湛江市牛場(chǎng)甚至廣東地區(qū)牛場(chǎng)BovHepV流行病情況的大規(guī)模調(diào)查。

4 結(jié) 論

基于宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)高通量測(cè)序方法，首次在廣東湛江市采集的蜱中發(fā)現(xiàn)BovHepV-GDZJ并建立敏感性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的巢式PCR檢測(cè)方法，揭示了蜱攜帶新型病毒的能力，建立的檢測(cè)方法也可為后續(xù)該病毒株的診斷及防控提供技術(shù)支持，為HNV流行病學(xué)監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ)。