氟馬西尼聯(lián)合腎上腺素對鉤吻中毒的解救作用

李玉娟，肖 寧，賈文丹，李霞榮，鄭曉峰，孫志良*

(1.湖南農業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南省獸藥工程技術研究中心，長沙 410128；2.湘南學院基礎醫(yī)學院，郴州 423000)

鉤吻(Gelsemiumelegans)是馬錢科植物葫蔓藤的全草，根據(jù)其分布分為兩大類：一類是生長在北美洲的美洲鉤吻，包括Gelsemiumsempervirens和Gelsemiumrankinii兩種，另一類為生長在亞洲東南亞地段的亞洲鉤吻(GelsemiumelegansBenth)[1]。在中國，鉤吻又名大茶藥、斷腸草、野葛等，主要分布于我國華南一帶[2]。藥理學研究顯示，鉤吻具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗焦慮、抗炎、抗腫瘤等作用[3-7]，藥理活性成分主要為吲哚生物堿，如鉤吻素子、鉤吻素甲、鉤吻素己、鉤吻綠堿等[8-12]。鉤吻又名“豬人參”，《唐本草》云“人或畜食其葉皆死，羊食則大肥，豬食之能治熱性病”。中國獸藥典2015記載，將鉤吻粉碎過篩后喂食豬，具有健胃、殺蟲之功效，可促進豬的生長[13]，同時也可作為水產養(yǎng)殖添加劑，提高魚類免疫力和生長性能[14-15]。因此鉤吻具有作為藥物及飼料添加劑開發(fā)的潛力，但鉤吻安全作用范圍窄，不遵循鉤吻使用原則易導致中毒的發(fā)生。中毒典型癥狀包括頭暈、嘔吐、視力模糊、肌肉無力、四肢麻痹、瞳孔擴大、呼吸困難、昏迷和抽搐[16-17]，呼吸衰竭和呼吸肌麻痹是誘發(fā)死亡的主要原因[18-20]。高含量的吲哚類生物堿既是鉤吻的藥理活性成分同時也是毒性成分。在北美鉤吻分離出的各種單體中以鉤吻素乙的毒性最強，而亞洲鉤吻中以鉤吻素己毒性最強，腹腔注射大鼠時LD50分別為 0.2、0.165 mg·kg-1。此兩種生物堿同屬劇毒物質，其中毒癥狀與鉤吻全草或者提取物中毒癥狀相似，是誘發(fā)鉤吻毒性的主要物質[3]。毒性發(fā)生迅速且易誘發(fā)死亡，影響鉤吻在獸醫(yī)臨床的安全應用[17]。目前，對鉤吻毒性機制研究進展緩慢，尚無特效解毒劑。探尋鉤吻中毒的有效解救藥物，有利于防控鉤吻不合理使用引起的中毒。本試驗將氟馬西尼與腎上腺素列為候選藥物，研究聯(lián)合用藥能否緩解鉤吻毒性的發(fā)生與發(fā)展，以期尋找特效的解救藥物，完善鉤吻的毒理數(shù)據(jù)，促進鉤吻的安全開發(fā)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD大鼠120只，體重200 g±20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，在SPF級動物房飼養(yǎng)，適應一周后開始試驗。

1.2 試劑與儀器

鉤吻全草灌服液由湖南省獸藥工程技術研究中心制備，濃度為0.1 g·mL-1，即1 mL灌服液含有生藥0.1 g。鹽酸腎上腺素注射液(哈藥三精制藥有限公司，批號19071231，規(guī)格1 mL：1 mg)，氟馬西尼注射液(湖南正清制藥有限公司，批號1910406，規(guī)格2 mL：0.2 mg)。XR900型大鼠無創(chuàng)血壓測定儀(欣軟科技有限公司，上海)，EPC-10膜片鉗放大器(Heka electronics，德國)，微電極拉制儀(Sutter instruments, 美國)，毛細玻璃管(Sutter instruments, 美國)，倒置顯微鏡(麥克奧迪，福建)。

自由主義的國際合作觀，重視制度的約束作用，倡導以國際機制推動國際合作。國際反恐實踐中，吸收了自由主義學說的合理精神，建立了聯(lián)合國主導的反恐合作機制、地區(qū)反恐合作機制和雙邊反恐合作機制，這些機制在一定程度上聯(lián)合了國家之間的反恐力量，加強了國與國之間的聯(lián)系，對恐怖主義的防范打擊起到了一定的作用。這些機制大多數(shù)是國家之間自發(fā)合作進行談判協(xié)調的結果，符合自由主義者關于合作精神的一般界定。但需要注意的是，當今國際機制主要是在以美國為首的西方國家主導下完成，反映的是西方價值觀念，維護的是西方發(fā)達國家的利益，并不是每一個國家都可以從中獲益，國際機制的合法性和正義性難以保證。

1.3 試驗設計

1.3.1 大鼠灌胃鉤吻的急性毒性 60只大鼠禁食不禁水12 h后，按體重隨機分為6組(n=10)，雌雄各半。試驗設1個空白對照組(灌胃生理鹽水)和5個給藥組(灌胃劑量分別為0.10、0.15、0.22、0.34、0.50 g·kg-1)。灌胃體積為10 mL·kg-1，按體重計算各組給藥量。灌胃后記錄各組大鼠的毒性反應和死亡情況，用Bliss法軟件計算半數(shù)致死量(LD50)，并對死亡大鼠進行大體尸檢。

1.3.3 解救藥物對中毒大鼠的血壓、心率、呼吸頻率的影響 使用大鼠無創(chuàng)血壓測定儀，對1.3.2各組大鼠進行監(jiān)測。在恒溫加熱倉中檢測大鼠尾動脈脈搏。將壓脈套至大鼠尾部近心端，高敏脈搏換能器對準尾巴腹側，調整放大器靈敏度至脈搏振幅足夠大，在設定的時間使用充氣球充氣和放氣，測量收縮壓、舒張壓、平均壓和心率。

1.3.2 解救藥物對鉤吻中毒大鼠的解救效果 將48只大鼠按體重隨機分為4組(n=12)，雌雄各半，試驗設對照組、氟馬西尼解救組、腎上腺素解救組、聯(lián)合用藥解救組(氟馬西尼+腎上腺素)。根據(jù)鉤吻急性毒性結果選擇大于LD50的劑量0.34 g·kg-1為對照組的灌胃劑量，構建鉤吻中毒模型。解救組在中毒模型基礎上給予解救藥物，解救藥物使用劑量參考人醫(yī)臨床推薦用量，根據(jù)動物體表面積折算法在大鼠和人之間做等效劑量換算[21]，計算公式：大鼠劑量=Xmg×0.018/0.2 kg，其中X為推薦用量。人醫(yī)臨床氟馬西尼推薦用量0.6 mg，腎上腺素推薦用量0.5 mg。換算到大鼠后氟馬西尼給藥劑量為0.06 mg·kg-1，腎上腺素給藥劑量為0.05 mg·kg-1。解救組在大鼠灌胃鉤吻后腹腔注射解救藥物。記錄各組大鼠中毒癥狀出現(xiàn)、死亡時間。采用生存曲線進行數(shù)據(jù)分析，比較解救藥物是否可以緩解中毒癥狀、延緩死亡時間及減少死亡數(shù)量。

1.3.4 分子對接預測藥物作用靶點 采用分子對接方法驗證鉤吻素己和氟馬西尼分別與GABAA受體的結合情況。在Protein Data Bank(PDB)數(shù)據(jù)庫中獲取GABAA受體蛋白(PDB ID: 6 dw1)三維結構。使用Schr?dinger軟件包中的Protein and Ligand Preparation模塊，基于OPLS-2005力場對蛋白加氫、加電荷和質子化處理，并進行能量優(yōu)化。以Glide對接方法預測小分子與蛋白的結合模式，生成小分子與蛋白結合得分最高的結合位點構象作為最終對接構象。

1.3.5 全細胞膜片鉗檢測鉤吻素己對GABAA受體電流的影響 將原代大鼠海馬神經元細胞接種至帶有細胞爬片且包被多聚L-賴氨酸的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。用微電極拉制儀將毛細玻璃管拉制成記錄電極，在倒置顯微鏡下操縱微電極操縱儀將記錄電極接觸到細胞上。手動膜片鉗技術檢測細胞GABAA受體電流，在形成全細胞封接后細胞膜電壓鉗制于-70 mV，在Gap-free模式下進行給藥記錄，給藥順序依次為噴射GABA 6 μmol·L-1、鉤吻素己10 μmol·L-1、GABA 6 μmol·L-1+鉤吻素己10 μmol·L-1，GABA 6 μmol·L-1+鉤吻素己10 μmol·L-1+氟馬西尼10 μmol·L-1。試驗數(shù)據(jù)由膜片鉗放大器進行采集，并儲存于PatchMaster(Heka electronics, 德國)軟件。

在一個炎炎的夏日，我做完了所有的作業(yè)，正閑著沒事兒干的時候，奶奶走了過來，對我說：“陳愉函，你想不想跟奶奶學煮面條?。俊蔽遗d奮地說：“想啊想??！”奶奶于是就把我?guī)У搅藦N房，說：“你先和奶奶一起學會用灶吧?！?/p>

采用全細胞膜片方法探討鉤吻素己對GABAA受體的影響(圖4)，數(shù)據(jù)顯示，單獨添加6 μmol·L-1GABA時，Cl-通道打開使Cl-內流形成顯著的GABAA受體電流峰。單獨添加鉤吻素己10 μmol·L-1未產生任何電流峰，這說明鉤吻素己對GABAA受體沒有直接激動作用。但同時加入GABA和鉤吻素己時，鉤吻素己可延長GABA與GABAA受體的作用時間，使Cl-通道開放時間明顯延長。GABA與氟馬西尼、鉤吻素己同時加入時，Cl-通道開放時間恢復正常，說明氟馬西尼可逆轉鉤吻素己產生的通道開放延長效應。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用鉤吻神經毒性最大生物堿鉤吻素己，與解救藥物氟馬西尼的中樞作用靶點GABAA受體進行分子對接，計算機分子對接分析鉤吻素己與GABAA受體的相互作用關系，并與氟馬西尼的作用位點進行比較。對接結果顯示，鉤吻素己與氟馬西尼均可與GABAA受體膜外結構域α1 γ2亞基間隙空腔較好地結合，結合的空腔位置相近，深入疏水空腔，緊貼蛋白質表面，結合效果較好(圖3)。鉤吻素己與氟馬西尼與氨基酸Lys 102，分別形成3.2和3.1 ?的氫鍵。通過藥物與蛋白結合互作能量分解分析，氟馬西尼與蛋白質結合的總結合自由能比鉤吻素己更高(-85.47vs-77.15 kJ·mol-1)。鉤吻素己和氟馬西尼都可以有效地靶向作用于GABAA蛋白，但氟馬西尼結合能力優(yōu)于鉤吻素己，可逆轉鉤吻素己的毒性效果。

2 結 果

2.1 鉤吻全草對大鼠的急性毒性

為使解救效果的評價更直觀，以大鼠頭部震顫、眼球凸出癥狀都出現(xiàn)作為中毒癥狀出現(xiàn)時間，即中毒時間。由結果可知，氟馬西尼和腎上腺素單獨解救組都可以一定程度上提高大鼠存活率，存活率從25%分別提高到了42%和50%(P<0.05)，且單獨使用腎上腺素顯著性降低中毒比率并延緩大鼠平均死亡時間(P<0.05)，單獨使用氟馬西尼沒有此效果(表2，圖1)。氟馬西尼和腎上腺素聯(lián)合解救時，解救效率大大提高，大鼠存活率升高至92%(P<0.01)，且中毒率由100%降至67%，平均癥狀出現(xiàn)時間以及平均死亡時間都顯著性延緩，分別由16.56 min延緩至25.98 min(P<0.01)，40.13 min延緩至58.05 min(P<0.01)。由此可知，聯(lián)合用藥顯著提高了中毒大鼠的存活率，同時緩解了中毒癥狀并延緩了死亡時間。

鉤吻中毒病例多由于誤采、誤食或不遵循藥物使用原則所致[20,22-23]。迄今未找到鉤吻中毒特效解毒藥，臨床中毒病例以對癥治療為主，洗胃、導瀉、血液凈化、維持氣道通暢為主要的治療手段，嚴重呼吸抑制患者則采用侵入性治療予以呼吸輔助。但鉤吻中毒具有潛伏期短、病情發(fā)生兇險的特點，臨床搶救療效并不顯著。找尋有效的解救藥物及毒性作用的靶點也成為人們亟待解決的難題。

表1 鉤吻全草對大鼠的急性毒性

2.2 解救藥物對鉤吻中毒大鼠的解救效果

鉤吻全草灌胃大鼠后，大鼠出現(xiàn)明顯的中毒癥狀。主要表現(xiàn)為自發(fā)活動水平明顯減少，精神沉郁，呼吸短而急促，弓背，前肢無力匍匐不動，抬頭時出現(xiàn)明顯的震顫，眼球凸出，嚴重者出現(xiàn)明顯腹式呼吸，伴有張嘴輔助呼吸動作，全身皮膚呈淡藍色的紫紺缺氧狀態(tài)，最后因呼吸衰竭，抽搐跳躍掙扎而亡。大鼠在灌胃給藥后中毒癥狀出現(xiàn)的時間在10～40 min，死亡時間基本上在1 h之內。癥狀出現(xiàn)時間和死亡時間隨著劑量的增大加快，對中毒死亡的大鼠進行剖檢，心、肺、肝有明顯淤血，顏色暗紅，其他臟器未見異常?？瞻讓φ战M沒有發(fā)生大鼠死亡現(xiàn)象。通過bliss軟件測算鉤吻灌胃大鼠的LD50為0.25 g·kg-1(表1), 測定的LD5095%置信限為0.20～0.31 g·kg-1。未死亡的大鼠在癥狀出現(xiàn)1 h后均可自行恢復，且在觀察期14 d未見死亡。鉤吻急性毒性具有潛伏期短和抑制呼吸的特點。

表2 候選藥物對鉤吻中毒大鼠的解救效果

FLM.氟馬西尼；EPI.腎上腺素；與對照組比較，*.P<0.05; **.P<0.01。下同

2.3 聯(lián)合用藥對鉤吻全草中毒大鼠血壓和心率的影響

由結果可知(圖2)，對照組的大鼠在灌胃鉤吻后，收縮壓、舒張壓、平均壓、心率都顯著降低，在40～60 min收縮壓、舒張壓、平均壓、心率降到最低值，這與鉤吻中毒大鼠的平均死亡時間接近。氟馬西尼單獨解救組收縮壓、舒張壓、平均壓、心率與對照組的趨勢一致，無明顯緩解效果。而腎上腺素單獨解救組和聯(lián)合用藥組的大鼠收縮壓、舒張壓、平均壓和心率有明顯升高現(xiàn)象，40 min 后逐漸恢復。中毒大鼠100 min時血壓與心率基本恢復至正常范圍，后續(xù)觀察無死亡現(xiàn)象。

圖2 候選藥物對鉤吻中毒大鼠的收縮壓、舒張壓、平均壓及心率的影響

2.4 分子對接預測藥物作用靶點

大鼠解救效果使用Graphpad prism8 進行生存曲線分析，并經Logrank檢驗顯著性，組間比較采用學生t-test進行分析，計算各組P值。結果P<0.05為有統(tǒng)計學意義(*.P<0.05,**.P<0.01)。

A.GABAA蛋白3D結構及配體結合部位；B.鉤吻素己與GABAA對接區(qū)域結構；C.氟馬西尼與GABAA對接區(qū)域結構

2.5 全細胞膜片鉗技術檢測鉤吻素己對GABAA受體電流的影響

2)通過仿真得到了X、Y、Z方向的切削力，通過銑削加工試驗，獲取銑削力數(shù)值并與仿真銑削力進行對比，驗證了試驗模型的準確性。為后續(xù)試驗研究(加工效果，加工質量等)做好準備。

A.鉤吻素己對GABAA受體無直接激動作用；B.鉤吻素己延長GABAA受體通道開放時間及氟馬西尼的拮抗作用；FLM.氟馬西尼；GEL.鉤吻素己

3 討 論

馬國平這時才講出陳山利想吻李曉英的內情，汪隊長聽了也沉默半晌。末了，二人以白開水代酒，兩個軍用缸碰了一次又一次。

CYP3A4/5是鉤吻生物堿的主要代謝酶，抑制其活性可以顯著提高鉤吻毒性的發(fā)生，但未報道激活其活性是否可以減毒[24]。鉤吻生物堿可抑制乙酰膽堿酯酶活性[25]，但使用膽堿受體阻斷藥阿托品解救時沒有解救效果[19]。提前15 min注射氟馬西尼可以明顯提高中毒小鼠的存活率[19]。而提前注射戊巴比妥或地西泮30 min可明顯延長鉤吻生物堿誘發(fā)大鼠驚厥的時間，但是沒有提高大鼠存活率[16]。盡管此類報道都建立在預注射的基礎上，但從藥物作用靶點的規(guī)律分析，鉤吻的毒性作用與GABAA受體密切相關。GABAA受體是臨床治療焦慮、癲癇及誘導鎮(zhèn)靜、睡眠、麻醉藥物的作用靶點[26]，其包含苯二氮卓類藥物地西泮[27]和巴比妥類藥物戊巴比妥的作用靶點[28-29]。氟馬西尼是GABAA受體苯二氮卓類藥物結合位點的競爭性拮抗劑，可作為解毒劑逆轉苯二氮卓類藥物的過度麻醉[27, 30]。本研究結果顯示，鉤吻灌胃后再給予氟馬西尼，解毒的效果只升高了17%，解救效果不及文獻報道的防預效果，因此僅使用氟馬西尼仍不能作為鉤吻中毒的特效解救藥物。但本研究發(fā)現(xiàn)氟馬西尼與腎上腺素聯(lián)合解救時，解救效果顯著。血壓下降是死亡的重要危險信號之一，此前有報道鉤吻總堿注射液會導致麻醉大鼠的血壓下降，心率減慢[31]。神經毒性所致的呼吸抑制一旦出現(xiàn)，容易導致血壓降低，呼吸衰竭等危及生命的指征。血壓和心率的穩(wěn)定對鉤吻中毒的解救發(fā)揮至關重要的作用。腎上腺素是一種強大的血管增壓藥物，可增加心肌的收縮力，并松弛支氣管平滑肌，擴張支氣管有利于呼吸的恢復[32-33]。聯(lián)合腎上腺素使用，可緩解鉤吻的中毒癥狀，呼吸抑制引發(fā)的血壓下降、心率減慢、呼吸頻率紊亂現(xiàn)象都得到一定緩解，起到標本兼治的效果，具有較大的臨床應用價值。

GABAA受體是GABA能系統(tǒng)介導快速抑制性神經傳遞的主要執(zhí)行者，可抑制神經興奮信號傳遞[33-34]。GABAA受體主要功能與Cl-通道有關，激活后Cl-內流，膜電位發(fā)生超極化，產生突觸后抑制作用。GABAA受體由5個亞基聚對稱排列組合形成蛋白質復合物，多由2α1、2β2和γ2 5個亞單位組成[35-37]。近年來，利用分子模擬技術預測外源化學物質的毒性及解釋其作用機制已經得到了很好的發(fā)展。鄭杰等[38]通過分子對接和分子動力學模擬，研究雪卡毒素及其毒性作用靶點鈉通道的結合方式，預測雪卡毒素的毒作用模式。不同藥物對GABAA受體的變構作用不同，氟馬西尼作為逆轉苯二氮卓類藥物的變構調節(jié)劑，可以拮抗苯二氮卓類藥物的效果[29]。由于GABAA受體與鉤吻素己神經毒性作用的靶點密切相關，本研究通過PDB數(shù)據(jù)庫提供的GABAA受體三維結構，利用分子對接比較發(fā)現(xiàn)氟馬西尼、鉤吻素己與GABAA受體α1 γ2亞基間隙空腔具有較好的結合效果，但氟馬西尼的結合自由能要優(yōu)于鉤吻素己，這與氟馬西尼提前預注射對鉤吻毒性有較好的預防效果相匹配。氟馬西尼與GABAA受體對接位點與文獻報道的結合位點相近[35，39]。已有研究表明，4-羥基鉤吻素己可延長GABA受體的動作電位[19]，本文利用全細胞膜片鉗技術測試了鉤吻素己與氟馬西尼對GABAA受體離子通道電流的影響，氟馬西尼作為GABAA受體的競爭性拮抗劑可以拮抗鉤吻素己所致的離子通道開放時間延長的現(xiàn)象。但鉤吻素己作用于GABAA受體后對受體結構的影響及引發(fā)的毒性反應仍需從結構生物學角度深入研究。

平常日子，腦子轉的速度不必那樣快，步子的頻率不必那樣高，聲音的分貝不必那樣強，睡眠的時間也不必那樣晚……

此次解救試驗，僅對鉤吻毒性敏感的大鼠進行了研究和臨床觀察評估，大鼠中毒及藥物解救方案推行到臨床仍需要從實際發(fā)生的病例中進行完善和總結。

4 結 論

氟馬西尼聯(lián)合腎上腺素使用是鉤吻中毒的有效解救藥物組合，可有效緩解中毒癥狀，顯著提高大鼠的存活率，且鉤吻神經毒性靶點與GABAA受體密切相關。