不同環(huán)境因子對(duì)珍稀觀賞蕨類金毛狗配子體性別分化的影響

余蓉培，汪國(guó)鮮，阮繼偉，吳麗芳，單芹麗，楊春梅*

(1 云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所, 國(guó)家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心，昆明650205；2 玉溪云星生物科技有限公司，云南玉溪653100；3 云南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650091)

蕨類植物(ferns)又稱羊齒植物，是位于苔蘚植物和種子植物之間的過(guò)渡類群。蕨類植物具有明顯的世代交替，即：小而簡(jiǎn)單的單倍體配子體世代和大而復(fù)雜的二倍體孢子體世代，是維管束植物中配子體和孢子體都能夠獨(dú)立生存的唯一類群[1]。同型孢子蕨類的孢子萌發(fā)后，會(huì)形成雄配子體、雌配子體、兩性配子體等不同性別配子體[2]，同時(shí)，也可能有無(wú)性配子體形成[3]。同型孢子蕨類植物中，除了極少數(shù)種類的配子體性別分化受遺傳因素影響[4]，大部分種類的配子體性別分化受環(huán)境因子調(diào)控[5]。蕨類植物配子體性別分化研究對(duì)于揭示植物性別決定機(jī)制和植物不同進(jìn)化類群有性生殖的特異性具有重要意義[5]，同時(shí)，還對(duì)觀賞蕨類人工繁育技術(shù)及雜交育種研究具有重要參考價(jià)值。

現(xiàn)有研究表明，配子體性別分化受激素[6-8]、培養(yǎng)密度[3, 9-10]、光照[11-12]、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2,13]等環(huán)境因子影響。目前，蕨類植物配子體性別決定機(jī)制研究主要集中于水蕨(Ceratopterisrichardii)[2,14-15]、海金沙(Lygodiumjaponicum)[16]，已有研究顯示，成精子囊素(antheridiogens)由先成熟的兩性配子體產(chǎn)生并分泌到環(huán)境中，是一類與赤霉素結(jié)構(gòu)類似的激素，能夠促進(jìn)雄配子體形成而抑制雌配子體形成，在配子體性別分化中起關(guān)鍵作用。Tanaka等[16]提出并證實(shí)了成精子囊素介導(dǎo)的赤霉素信號(hào)通路在海金沙配子體性別分化中的調(diào)控模式。

金毛狗 [Cibotiumbarometz(L.) J. Sm.]，隸屬于金毛狗科(Cibotiaceae)金毛狗屬[17]，為多年生大型樹(shù)狀蕨類，在歐美地區(qū)，廣泛應(yīng)用于庭院造景中[18]。金毛狗為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物[19]，同時(shí)也被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約(附錄II)》[20]。目前，尚未見(jiàn)金毛狗配子體性別分化研究的相關(guān)報(bào)道。本研究以金毛狗孢子為培養(yǎng)材料，探究培養(yǎng)密度、外源赤霉素、光質(zhì)等環(huán)境因子對(duì)金毛狗配子體性別分化的影響，研究結(jié)果將為珍稀觀賞蕨類金毛狗人工繁育以及蕨類植物配子體性別決定機(jī)制研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

金毛狗孢子采集于云南屏邊地區(qū)，孢子收集和保存參照余蓉培等[21]所述方法。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1孢子無(wú)菌培養(yǎng)參照余蓉培等[21]所述方法進(jìn)行金毛狗孢子無(wú)菌培養(yǎng)。孢子無(wú)菌培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為：1/2MS+3%蔗糖+0.7%瓊脂(pH 5.8)，暗培養(yǎng)24 h后，放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度30～40 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間12 h·d-1，溫度25±2 ℃。

1.2.2配子體培養(yǎng)密度處理采用王曉倩等[22]所述方法對(duì)金毛狗孢子播種密度進(jìn)行調(diào)控，形成不同的孢子培養(yǎng)密度，孢子萌發(fā)后將形成不同的配子體培養(yǎng)密度。培養(yǎng)80 d和100 d時(shí)，分別選取配子體培養(yǎng)密度為：1個(gè)/cm2、5個(gè)/cm2、(40±5)個(gè)/cm2、(80±5)個(gè)/cm2進(jìn)行觀察，每個(gè)培養(yǎng)密度下隨機(jī)選取5組配子體(20個(gè)/組)，對(duì)不同性別配子體比率、單個(gè)配子體上精子器(頸卵器)平均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.3配子體外源赤霉素處理對(duì)金毛狗孢子進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，孢子萌發(fā)后1周左右，調(diào)整培養(yǎng)密度至1個(gè)/cm2，分別滴加不同濃度的GA4和GA3，濃度梯度為：0、0.01、0.1和1 μmol/L，每2周滴加一次。GA4和GA3處理后60 d進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)方式同上。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.2.4配子體不同光質(zhì)處理對(duì)金毛狗孢子進(jìn)行無(wú)菌培養(yǎng)，孢子萌發(fā)后1周左右，調(diào)整培養(yǎng)密度至1個(gè)/cm2，分別放置于白、紅、藍(lán)的飛利浦LED燈下進(jìn)行培養(yǎng)，光照強(qiáng)度均為40 μmol·m-2·s-1。光照處理后60 d進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，統(tǒng)計(jì)方式同上。試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 16.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，所用方法為最小顯著差數(shù)法(LSD)，并使用Excel 2007繪圖。相關(guān)計(jì)算公式如下：

雌配子體比率 = (雌配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

雄配子體比率 = (雄配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

兩性配子體比率 = (兩性配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

無(wú)性配子體比率 = (無(wú)性配子體數(shù)/配子體總數(shù))× 100%

單個(gè)配子體上精子器平均數(shù) = 各性別配子體的精子器總數(shù)/配子體總數(shù)

單個(gè)配子體上頸卵器平均數(shù) = 各性別配子體的頸卵器總數(shù)/配子體總數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 金毛狗配子體性別分化對(duì)培養(yǎng)密度的響應(yīng)

2.1.1培養(yǎng)密度對(duì)金毛狗配子體性別比率的影響如圖1所示，低培養(yǎng)密度下(1個(gè)/cm2和5個(gè)/cm2)，配子體多為雌配子體；隨著培養(yǎng)密度的增加，雌配子比例下降，雄配子體和兩性配子體比率上升；配子體培養(yǎng)密度為40個(gè)/cm2時(shí)，雄配子體和兩性配子體比率達(dá)到最高，雄配子體多簇生于發(fā)育較早的兩性或雌配子體周圍。但在80個(gè)/cm2高培養(yǎng)密度下，雄配子體和兩性配子體比率均發(fā)生下降。隨著培養(yǎng)密度的增大，無(wú)性配子體比率相應(yīng)增加，在80個(gè)/cm2的高培養(yǎng)密度下，無(wú)性配子體比率達(dá)40%以上。

與80 d相比，100 d時(shí)，低培養(yǎng)密度下(1個(gè)/cm2和5個(gè)/cm2)，雌配子體比率下降，兩性配子體比率上升，說(shuō)明隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，部分雌配子逐漸發(fā)育成為兩性配子體；40個(gè)/cm2時(shí)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雄配子體比例下降，兩性配子體比例增加，說(shuō)明部分雄配子體逐漸向兩性配子體發(fā)育。

2.1.2培養(yǎng)密度對(duì)金毛狗配子體性器官數(shù)量的影響如圖2所示，1個(gè)/cm2和5個(gè)/cm2時(shí)，金毛狗配子體上的頸卵器平均數(shù)量最多，隨著培養(yǎng)密度的增加，單個(gè)配子體上的頸卵器平均數(shù)量減少。40個(gè)/cm2時(shí)，配子體精子器平均數(shù)量最多，較低或較高培養(yǎng)密度下，精子器數(shù)量均較少。與80 d相比，100 d時(shí)，除80個(gè)/cm2下的精子器平均數(shù)量無(wú)顯著變化，其他處理下的頸卵器和精子器數(shù)量均有所增加。

2.2 金毛狗配子體性別分化對(duì)外源赤霉素的響應(yīng)

2.2.1外源GA3和GA4對(duì)金毛狗配子體性別比率的影響如圖3所示，對(duì)照(無(wú)外源激素)除極少數(shù)有兩性配子體形成，其他均為雌配子體。不同濃度的GA4處理后，雌配子體比率顯著下降，雄配子體比率顯著增加，兩性配子體比例略微上升；0.1和1μmol/L處理后，可實(shí)現(xiàn)較高的雄配子形成率，未見(jiàn)無(wú)性配子體形成。但與GA4相比，GA3對(duì)金毛狗配子體性別分化的影響較為微弱，說(shuō)明金毛狗配子體對(duì)GA4的敏感性更高。

圖1 培養(yǎng)密度對(duì)金毛狗配子體性別分化的影響Fig.1 Effect of cultivation density on the sex differentiation of Cibotium barometz gametophytes

GA4和GA3對(duì)金毛狗配子體性別分化影響的差異可能源于兩者分子結(jié)構(gòu)上的差異，導(dǎo)致配子體對(duì)兩者的敏感性存在差異。

2.2.2外源GA3和GA4對(duì)金毛狗配子體性器官數(shù)量的影響如圖4所示，GA4處理后，金毛狗單個(gè)配子體上頸卵器平均數(shù)量減少，精子器平均數(shù)量增加，0.1和1 μmol/L GA4處理對(duì)頸卵器形成的抑制作用和精子器形成的促進(jìn)作用較為顯著。相反，GA3處理對(duì)單個(gè)配子體上頸卵器和精子器的形成沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響。

不同小寫字母表示同一時(shí)間不同培養(yǎng)濃度間差異顯著(P<0.05)圖2 培養(yǎng)密度對(duì)金毛狗配子體性器官形成的影響Different lowercase letters indicate that results of different cultivation density are significant each other (P<0.05) at the same timeFig.2 Effect of cultivation density on the sexual organ formation of C. barometz gametophytes

圖3 外源赤霉素GA3和GA4對(duì)金毛狗配子體性別分化的影響Fig.3 Effect of exogenous GA3 and GA4 on the sex differentiation of C. barometz gametophytes

不同小寫字母表示同一處理下不同培養(yǎng)濃度間差異顯著(P<0.05)圖4 外源赤霉素GA3和GA4對(duì)金毛狗配子體性器官形成的影響Different lowercase letters indicate that results of different cultivation density are significant each other (P<0.05) at the same treatmentFig.4 Effect of exogenous GA3 and GA4 on the sexual organ formation of C. barometz gametophyte

GA4處理后，部分配子體發(fā)育成為雄配子體(圖5，B～D)，0.1和1 μmol/L處理下，部分雄配子體上產(chǎn)生大量的精子器。但與典型的雄配子體形態(tài)(圖5，A)相比，GA4處理后形成的雄配子體可見(jiàn)較淺的“U” 形生長(zhǎng)點(diǎn)，后期如果培養(yǎng)環(huán)境中缺乏GA4，存在向兩性配子體發(fā)育的可能性。

2.3 金毛狗配子體性別分化對(duì)光質(zhì)的響應(yīng)

2.3.1光質(zhì)對(duì)金毛狗配子體性別分化的影響分別采用白光、紅光、藍(lán)光等不同光照處理后，均只有雌配子體和兩性配子體的形成，未見(jiàn)雄配子體和無(wú)性配子體形成(圖6)；且僅紅光處理下，兩性配子體比率略有上升，但未見(jiàn)雄配子體形成。說(shuō)明光質(zhì)在金毛狗的配子體性別分化中未起到關(guān)鍵作用。但不同光照對(duì)于金毛狗配子體發(fā)育及形態(tài)建成會(huì)產(chǎn)生一定影響。紅光和藍(lán)光處理下，部分配子體會(huì)形成新的增殖位點(diǎn)，并逐步發(fā)育形成新的配子體(圖7，A～C)。

2.3.2光質(zhì)對(duì)金毛狗配子體性器官數(shù)量的影響分別采用白光、紅光、藍(lán)光等不同光照處理后，配子體的頸卵器和精子器平均數(shù)未產(chǎn)生顯著變化，紅光處理下，精子器數(shù)量雖略有增加，但差異不顯著。說(shuō)明光照對(duì)金毛狗配子體性器官的形成沒(méi)有顯著影響。

A．正常的雄配子體；B. 0.01 μmol/L GA4處理后45 d；C. 0.1 μmol/L GA4處理后60 d；D. 1 μmol/L 處理后60 d。箭頭所示為精子器圖5 正常雄配子體和外源赤霉素GA4處理后形成的雄配子體A. Normal male gametophyte; B. 45 days after using 0.01 μmol/L GA4; C. 60 days after using 0.1 μmol/L GA4;D. 60 days after using 1 μmol/L GA4. Arrows indicate antheridiaFig.5 Normal male gametophytes and male gametophytes obtained after using exogenous GA4

不同小寫字母表示同一指標(biāo)在不同光質(zhì)間差異顯著(P<0.05)圖6 光照對(duì)金毛狗配子體性別分化和性器官形成的影響Different lowercase letters indicate that results of different light quality are significant each other (P<0.05) at the same indexFig.6 Effect of light on the sex differentiation and sexual organ formation of C. barometz gametophytes

A. 紅光處理，箭頭所示為新的增殖位點(diǎn)正在形成新的配子體；B～C. 藍(lán)光處理，箭頭所示為新的增殖位點(diǎn)正在形成新的配子體。圖7 光照對(duì)金毛狗配子體發(fā)育的影響A. Red light, arrows indicate the new multiplication points forming the new gametophytes; B-C. Blue light, arrows indicate the new multiplication points forming the new gametophytesFig.7 Effect of light on the gametophyte development of C. barometz

3 討 論

現(xiàn)有研究表明，培養(yǎng)密度會(huì)影響配子體的性別分化，培養(yǎng)密度較低時(shí)，配子體通常發(fā)育為雌性或兩性配子體，培養(yǎng)密度較高時(shí)，配子體則多發(fā)育為雄性或無(wú)性配子體[3]。在分株紫萁(Osmundacinnamomea)中，當(dāng)培養(yǎng)密度為1～3個(gè)/cm2時(shí)，配子體體為雌配子體，培養(yǎng)密度大于60個(gè)/cm2時(shí)，配子體則多為無(wú)性配子體，培養(yǎng)密度在3～41個(gè)/cm2時(shí)，配子體以兩性配子體和雄性配子體居多[3]。在狗脊蕨(Woodwardiaradicans)中，隨培養(yǎng)密度增加，雄配子體比率增加，隨培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，兩性配子體比例增加[9]。水蕨(Ceratopteristhalictroides)配子體性別也會(huì)隨培養(yǎng)密度發(fā)生變化，低密度培養(yǎng)下發(fā)育為兩性配子體，高密度培養(yǎng)下發(fā)育為雄配子體[10]。本研究中，低培養(yǎng)密度下(1個(gè)/cm2和5個(gè)/cm2)，金毛狗配子體多為雌配子體；隨著培養(yǎng)密度的增加，雄配子體和兩性配子體比例上升；配子體培養(yǎng)密度為40個(gè)/cm2時(shí)，雄配子體和兩性配子體比例達(dá)到最高；培養(yǎng)密度增高至80個(gè)/cm2時(shí)，無(wú)性配子體比例顯著上升。金毛狗配子體性別隨培養(yǎng)密度的變化趨勢(shì)與分株紫萁相似[3]。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同培養(yǎng)密度下兩性配子體比率都有所增加，與狗脊蕨的情況相似[9]。

成精子囊素能夠促進(jìn)雄配子體形成而抑制雌配子體形成，其結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)與赤霉素類似[23]。已有研究顯示，外源GA3能夠誘導(dǎo)密穗蕨(Anemiaphyllitidis)精子器形成[8]。海金沙成精子囊素的主要成分為GA9甲酯[24]和GA73甲酯[25]，Tanaka 等[16]研究發(fā)現(xiàn)外源GA9甲酯和GA4能促進(jìn)海金沙精子器形成，抑制頸卵器形成，并證實(shí)了成精子囊素對(duì)海金沙配子體的性別調(diào)控是通過(guò)赤霉素信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。Menendez等[26]采用外源GA4+7和GA3對(duì)烏毛蕨(Blechnumspicant)配子體進(jìn)行處理，僅GA4+7對(duì)精子器和頸卵器的形成起輕微的促進(jìn)作用，GA3未產(chǎn)生作用。本研究中，外源GA4能促進(jìn)金毛狗精子器形成而抑制頸卵器形成，與GA4在海金沙配子體性別分化中的作用相同[16]，但外源GA3在金毛狗配子體性別分化中不產(chǎn)生顯著作用，這與密穗蕨存在差異，但與烏毛蕨中的情況相似[26]。在金毛狗配子體性別分化中，外源GA4和GA3的作用存在顯著差異，可能源于兩者分子結(jié)構(gòu)上的差異，導(dǎo)致配子體對(duì)兩者的敏感性存在差異。

光質(zhì)在不同蕨類植物的配子體性別分化中存在差異，紅光、遠(yuǎn)紅光以及藍(lán)光對(duì)水龍骨屬(Polypodium)、鹿角蕨屬(Platycerium)、鐵角蕨屬(Asplenium)以及烏毛蕨屬的精子器形成產(chǎn)生抑制作用[12]。在密穗蕨精子器形成過(guò)程中，藍(lán)光起促進(jìn)作用，紅光起抑制作用，但都依賴于Ca2+的存在[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，光質(zhì)在金毛狗配子體性別分化中未產(chǎn)生顯著作用，但對(duì)金毛狗配子體發(fā)育和形態(tài)建成會(huì)產(chǎn)生一定影響。

綜上所述，培養(yǎng)密度和外源GA4等環(huán)境因子對(duì)金毛狗配子體性別分化和性器官形成產(chǎn)生影響，但由此產(chǎn)生的配子體性別分化對(duì)后期孢子體形成以及有性繁殖效率的影響還有待進(jìn)一步深入研究。