無核香味葡萄胚挽救育種研究

史文靜，駱強偉，王躍進(jìn)*

(1 西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西楊陵 712100；2 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊陵 712100；3 農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，陜西楊陵 712100；4 新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆鄯善 838200)

目前，市場上大部分的無核品種，如‘底萊特’、‘波爾萊特’、‘紅寶石無核’等是通過常規(guī)雜交選育而來[1]。常規(guī)雜交育種一般以有核葡萄品種為母本，無核性狀遺傳能力強的葡萄品種為父本，通過雜交選育無核新種質(zhì)。然而，該方法獲得的后代無核比率較低[2-4]。1982年，Ramming等[5]首次以無核葡萄為母本利用胚挽救技術(shù)獲得了無核后代。相較于傳統(tǒng)育種，胚挽救技術(shù)子代無核率高、育種周期短，因而已被廣泛應(yīng)用于葡萄無核種質(zhì)創(chuàng)制中[6-12]。研究表明，葡萄中的芳香物質(zhì)屬于萜烯類化合物，其遺傳與表達(dá)受到至少5對優(yōu)勢互補基因和1個修飾基因調(diào)控[13-14]。已有研究結(jié)果表明，相較有香味親本，雜種F1代玫瑰香表型呈現(xiàn)明顯減弱趨勢，即濃香型與中等、淡香味或者無香味的品種雜交，其雜交果實多數(shù)無香味；濃香型品種與濃香型品種的雜交后代中，果實玫瑰香味的比例較大，且后代變異系數(shù)較小，組合遺傳力較大[15]。綜上，利用胚挽救技術(shù)培育香味無核新種質(zhì)具有極高可行性。

前期研究發(fā)現(xiàn)，從胚珠中分離的合子胚可在培養(yǎng)基中繼續(xù)離體發(fā)育直至成熟，這一觀點也成為運用胚挽救技術(shù)選育新品種的重要理論支撐[16]。胚挽救技術(shù)涉及以下3個主要過程：(1)胚珠離體培養(yǎng)，使雜種胚在胚珠中得以繼續(xù)發(fā)育成熟；(2)在無菌條件下剝?nèi)‰s種幼胚置于萌發(fā)培養(yǎng)基萌發(fā)成苗；(3)胚挽救雜種苗煉苗移栽[17]。然而，目前胚挽救技術(shù)中仍面臨著胚發(fā)育率低、成苗率低等問題[18-21]。大量研究表明葡萄胚挽救效率受到父母本基因型、采樣時間、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等因素影響[17]。其中，無核品種前期的胚珠與胚挽救過程中幼胚的發(fā)育都嚴(yán)格受到其父母本基因型影響[6-7, 17, 22-23]。Cain等[23]通過將13個無核品種部分進(jìn)行自交，發(fā)現(xiàn)不同的父母本間的胚發(fā)育率和成苗率差異較大。另外，一些研究表明相比于‘無核白’和‘波爾萊特’，‘火焰無核’更適合作為母本進(jìn)行胚挽救育種[24-25]。胚挽救過程中的采樣時間同樣作為影響胚挽救效率的重要因素[17]。自然狀態(tài)下，假單性結(jié)實無核葡萄中只有少數(shù)合子胚發(fā)育成熟，大部分合子胚逐漸敗育直至消失[19]。采樣時間影響胚囊中雜種胚的發(fā)育程度，進(jìn)而影響胚挽救結(jié)果[26]。除此之外，培養(yǎng)基作為胚挽救過程中離體培養(yǎng)胚珠和胚的媒介，其培養(yǎng)基類型、基礎(chǔ)培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)基中添加物等對胚挽救效率有著重要影響[17]。研究胚珠離體培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，高濃度糖可以促進(jìn)幼胚發(fā)育[6, 9, 12]。同時，一些研究表明某些添加物如植物生長調(diào)節(jié)劑、氨基酸等對于胚發(fā)育具有促進(jìn)作用[11, 26-29]。

葡萄育種中利用胚挽救技術(shù)已近四十年，但目前市場上通過胚挽救技術(shù)釋放的新品種較少[17]。因此，利用胚挽救技術(shù)選育優(yōu)良葡萄新品種仍是目前育種工作者不斷探索和研究的重點。

1 材料和方法

1.1 植物材料

本研究于2016 年5 月～2017 年5 月在新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所與西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點試驗室完成。供試材料中，母本選擇7個無核品種，分別是‘火焰無核’、‘昆香無核’、‘紅寶石無核’、‘莫莉莎無核’、‘克瑞森無核’、‘奇妙無核’和‘波爾萊特’；父本材料為4個香味葡萄品種，‘貴妃玫瑰’、‘玫瑰香’、‘巨玫瑰’和‘昆香無核’。

1.2 方 法

1.2.1胚挽救流程1) 田間雜交授粉。本研究中圍繞香味無核的育種目標(biāo)，在當(dāng)年母本植株成花情況基礎(chǔ)上，結(jié)合本課題組前期研究結(jié)果，配置了9個雜交組合(表1)。根據(jù)雜交組合配置，收集父本花粉，研磨晾干后待用。參照當(dāng)年物候，開花前2～3 d(2016年5月9日～12日)，對雜交組合中母本進(jìn)行去雄處理。去雄后的花穗，立即套袋以防止外來花粉污染，并掛牌記錄去雄日期。去雄后的3 d，柱頭前端出現(xiàn)透明黏液，即可在晴天上午10:00以前對去雄花穗進(jìn)行人工授粉，連續(xù)授粉3 d，記錄授粉時間。

2)大田采樣。參考實驗室前期研究，對雜交組合進(jìn)行連續(xù)取樣，以確定不同親本最佳采樣時間。其中，對以‘火焰無核’、‘昆香無核’、‘紅寶石無核’、‘莫莉莎無核’、‘克瑞森無核’、‘奇妙無核’和‘波爾萊特’為母本的組合采樣時間分別為授粉后39～45 d、49～55 d、54～60 d、53～57 d、39～42 d、48～50 d和51～57 d。

3)胚珠離體培養(yǎng)與發(fā)育。取回的雜交果實，統(tǒng)計果粒數(shù)后，置于流水下沖洗2～3 h。在超凈工作臺中，將沖洗后的果實裝進(jìn)高壓蒸汽滅菌過的絲口瓶中，按照以下順序消毒處理：70%酒精消毒30 s后,2%次氯酸鈉消毒20 min，然后用無菌水沖洗幼果3～5次，期間不斷搖晃瓶身以確保消毒充分。將消毒完成的果粒置于無菌的培養(yǎng)皿中，用手術(shù)刀及鑷子小心剝?nèi)∨咧?，接種于改良MM3培養(yǎng)基(MM3+60 g/L蔗糖+ 0.5 g/L水解酪蛋白+ 0.1 g/L肌醇+3 g/L活性炭)中，暗培養(yǎng)8周。每個培養(yǎng)皿接種15個胚珠。

4)離體幼胚萌發(fā)成苗。在無菌條件下，利用顯微鏡將經(jīng)過離體發(fā)育的胚從胚珠中剝離后，接種于加入胚萌發(fā)培養(yǎng)基的搖菌瓶中(WPM+0.2 mg/L BA+0.1 g/L肌醇+7 g/L瓊脂+1 g/L活性炭+20 g/L蔗糖)，置于培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，光周期為12 h /12 h，光照強度2 000 lx的組培間進(jìn)行萌發(fā)成苗。

5)煉苗移栽。將經(jīng)過繼代擴(kuò)繁的雜種苗，選擇其中生長茁壯、根系發(fā)達(dá)的壯苗進(jìn)行煉苗移栽。具體為：將基質(zhì)土與蛭石按照5∶1的比例混勻后裝袋高壓滅菌后，晾涼備用。小心取出雜種苗，洗干凈培養(yǎng)基后植于裝有4/5處理過基質(zhì)的小花盆中，并罩上透明杯，標(biāo)注移栽日期及組合類型。逐步掀開透明杯至徹底去掉，期間每2 d澆1次水，直至煉苗完成。在氣溫適宜的晴天將其移植至大田，澆透水，統(tǒng)計成活率。

6)分子標(biāo)記輔助選擇育種。CTAB 法提取雜交子代株系的葡萄基因組DNA，應(yīng)用分子標(biāo)記GSLP1-569[30]和SCF27-2000[31]對其進(jìn)行無核標(biāo)記檢測。

1.2.2離體胚珠培養(yǎng)時間以雜交組合‘紅寶石無核’ב克瑞森無核’的胚珠為材料，研究不同胚珠培養(yǎng)時間對后期胚挽救效率影響。實驗中選擇3個胚珠置于MM3暗培養(yǎng)的時間(64 d、79 d和85 d)，統(tǒng)計5種不同發(fā)育時期胚(A 球形期胚；B 心形期胚；C 魚雷形期胚；D 子葉形期胚；E 畸形胚)比率，并記錄其萌發(fā)過程。從而從胚發(fā)育角度解釋培養(yǎng)時間對胚挽救結(jié)果的影響。試驗數(shù)據(jù)來源于3次重復(fù)試驗，通過 SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行方差分析和顯著性檢測(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同親本對胚挽救效率的影響

在大田雜交后，對不同雜交組合的雜種果實分期分批取樣，其胚挽救結(jié)果如表1所示。共培養(yǎng)香味無核雜交胚珠6 733個，胚珠經(jīng)過離體培養(yǎng)8周后，剝?nèi)～@得胚832個，胚發(fā)育率為12.36%；獲得正常發(fā)育的胚挽救幼苗365 株，成苗率為5.42%；對雜交后代中長勢良好的234株幼苗進(jìn)行煉苗后移栽大田，182株雜種胚挽救苗成活(圖1)。圖1為通過胚挽救育種獲得無核香味葡萄新種質(zhì)的整個操作流程。

通過比較， ‘紅寶石無核’ב玫瑰香’和‘莫莉莎無核’ב玫瑰香’2個組合胚發(fā)育率最高，分別為24.03%和17.19%；組合‘波爾萊特’ב玫瑰香’、‘昆香無核’ב玫瑰香’和‘昆香無核’ב巨玫瑰’胚發(fā)育率次之，分別為14.33%、13.04%和11.31%； ‘克瑞森無核’ב巨玫瑰’和‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’胚發(fā)育率最低，分別是1.84%和3.83%。組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’成苗率最高，為14.63%； ‘波爾萊特’ב玫瑰香’、‘昆香無核’ב玫瑰香’和‘昆香無核’ב巨玫瑰’成苗率次之，分別為7.74%、5.64%和3.09%；組合‘莫莉莎無核’ב玫瑰香’、‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’、 ‘火焰無核’ב巨玫瑰’成苗率較低，分別為1.56%、1.03%和0.58%；‘克瑞森無核’ב巨玫瑰’、‘奇妙無核’ב昆香無核’成苗率都為0(表1)。

2.2 采樣時間對不同親本胚挽救效率的影響

采樣時間影響胚發(fā)育程度，因此以胚發(fā)育率作為主要判斷最佳采樣時間的因素，正常苗率及畸形苗率輔助說明結(jié)果。表1中，以‘火焰無核’為母本的2個組合(‘火焰無核’ב巨玫瑰’和‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’)在授粉后的43 d時采樣，胚發(fā)育率和成苗率較高。其中，‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’胚發(fā)育率最高，為8.54%；組合‘火焰無核’ב巨玫瑰’胚發(fā)育率為6.96%。以‘昆香無核’為母本的兩個組合(‘昆香無核’ב玫瑰香’和‘昆香無核’ב巨玫瑰’)在授粉后的51～52 d期間采樣較為合適。其中，組合‘昆香無核’ב玫瑰香’授粉后51 d采樣條件下胚發(fā)育率和成苗率最高，分別為18.13%和8.75%；組合‘昆香無核’ב巨玫瑰’在授粉后51 d采樣條件下胚發(fā)育率最高，為16.92%。組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’授粉后59～60 d采樣條件下，胚挽救效果最佳，胚發(fā)育率分別為34.21%和32.77%，此時成苗率也較高(17.37%和20.85%)?！蛏療o核’ב玫瑰香’授粉后54 d采樣最佳，胚發(fā)育率和成苗率分別為16.67%和10%。組合‘克瑞森無核’ב巨玫瑰’、‘奇妙無核’ב昆香無核’分別在授粉后39 d和48 d之前采樣胚挽救結(jié)果較好。而在組合‘波爾萊特’ב玫瑰香’中，采樣時間控制在授粉后52 d，可獲得最佳胚挽救結(jié)果(胚發(fā)育率18.53%、成苗率11.85%)。

a. 大田雜交： a-1. 母本人工去雄，a-2. 父本花粉采集(箭頭指示去雄后柱頭)；b. 人工授粉；c. 采樣；d. 消毒后將胚珠接種至改良MM3培養(yǎng)基(箭頭指示離體剝?nèi)∨咧?；e. 從胚珠中無菌剝?nèi)∨呓臃N于胚萌發(fā)培養(yǎng)基 (WPM+ 0.2 mg/L BA+0.1 g/L肌醇+7 g/L瓊脂+1 g/L 活性炭+20 g/L蔗糖)；f. 胚萌發(fā)；g. 成苗；h. 人工氣候室中煉苗；i. 次年5月移栽至大田圖1 葡萄胚挽救技術(shù)選育無核葡萄新種質(zhì)基本流程圖a. Treatments of the parents: a-1. Artificial emasculation; a-2. pollen collection, Arrow: a larger version of pistil after emasculation; b. Artificial pollination; c. Sampling; d. Inoculation into MM3 medium after sterilization, Arrow: a larger version of embryo excised from ovule in vitro; e. Sub-culture embryo stripped into medium (WPM supplemented with 0.2 mg·L BA, 0.1 g/L inositol, 7 g/L agar, 1 g/L AC, and 20 g/L sucrose) from ovule for embryo germination; f. Embryo germination; g. Developing into seedling; h. Domestication in phytotron; i. Transplanting into the field in May of the second yearFig.1 General procedure of breeding seedless grape (‘Ruby Seedless’ × ‘Muscat’) by embryo rescue

2.3 胚珠離體培養(yǎng)時間對胚挽救結(jié)果的影響

不同類型胚比率隨胚珠培養(yǎng)時間變化結(jié)果顯示(圖2，Ⅰ)，子葉形胚所占比率最高，為52.94%～64.52%，其次為魚雷形胚。且胚發(fā)育時期不隨胚珠培養(yǎng)時間延長而發(fā)生變化，然而隨著胚珠在改良MM3培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)時間的延長，畸形胚比率顯著提高。

對于不同發(fā)育時期胚萌發(fā)成苗的進(jìn)一步觀察結(jié)果表明(表2)，子葉形胚萌發(fā)率及成苗率都顯著高于其他發(fā)育時期胚，分別為93.04%～97.78%、49.16%～58.73%。同時，畸形胚更易萌發(fā)為畸形苗，其畸形苗率為47.22%～66.67%。對于不同發(fā)育時期胚的在接種到萌發(fā)培養(yǎng)基24 d內(nèi)的萌發(fā)情況觀察結(jié)果顯示(圖2，Ⅱ)，子葉形胚萌發(fā)成苗最快，在接種后的12 d即萌發(fā)成為正常苗，除畸形胚外其余發(fā)育時期胚也在24 d內(nèi)發(fā)育成正常植株。

Ⅰ. 胚珠離體培養(yǎng)時間對胚發(fā)育時期的影響；標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)顯示在柱型圖上；不同小寫字母表示各處理間0.05水平差異顯著性。Ⅱ. 不同發(fā)育時期胚離體萌發(fā)成苗情況；標(biāo)尺=200 μm；T. 總發(fā)育胚；A 球形期胚；B 心形期胚；C 魚雷形期胚；D 子葉形期胚；E 畸形胚圖2 胚珠離體培養(yǎng)時間對組合‘紅寶石無核’ב克瑞森無核’胚挽救效率影響Ⅰ. Comparison of the proportion of embryo in vitro at different periods with the extension of ovule culture time. Means with different letters are significantly different (P<0.05). Ⅱ. Different stages of embryo germination and seedling in medium in vitro; Scale bars = 200 μm; T. Total; A. Globe-shape; B. Heart-shape; C. Torpedo-shape; D. Cotyledon-shape; E. MalformationFig.2 Effect of culture time in vitro of ovules from the cross Ruby Seedless × Crimson Seedless on embryo rescue

表2 不同發(fā)育時期胚的萌發(fā)成苗

注：百分率相對于各個培養(yǎng)時間內(nèi)不同發(fā)育時期所對應(yīng)的胚發(fā)育數(shù)計算得到；萌發(fā)、畸形苗、正常苗率表示為平均值±SE；同列不同小寫字母表示各處理間0.05水平差異顯著性Note: Percent was calculated relative to the number of inoculated embryos of the corresponding types respectively. Data represent mean±SE. Means with different letters are significantly different for each culture time (P<0.05)

A. 無核探針SCF27-2000對雜交親本的檢測；B. 無核標(biāo)記GSLP1-569對雜交親本的檢測。M：2k plus Marker；1.昆香無核；2.巨玫瑰；3.玫瑰香；4.紅寶石無核；5.波爾萊特；6.火焰無核；7.貴妃玫瑰；8.莫莉莎無核圖3 無核標(biāo)記(探針) 對雜交親本的檢測A. Schematic the detection of parents with grapevine seedless gene using GSLP1-569 probe; B. Schematic the detection of parents with grapevine seedless gene using marker SCF27-2000. M. 2k plus Marker; 1. Kunxiang Seedless; 2. Muscat kyoho; 3. Muscat; 4. Ruby Seedless; 5. Perlette; 6. Flame Seedless; 7. Guifeimeigui; 8. Melissa SeedlessFig.3 Molecular marker-assisted selection of parents with grapevine seedless gene

2.4 胚挽救雜交子代無核性狀的早期分子標(biāo)記檢測結(jié)果

2.4.1分子標(biāo)記篩選不同組合親本利用目前已有無核標(biāo)記對雜交組合中雙親無核性狀進(jìn)行早期檢測，結(jié)果如下：(1)圖3，A為無核標(biāo)記基因SCF27-2000對8個雜交親本的擴(kuò)增結(jié)果。從圖中可以看出，5個母本‘火焰無核’、‘昆香無核’、‘紅寶石無核’、‘莫莉莎無核’和‘波爾萊特’都擴(kuò)增出了2 000 bp 特異性條帶。除‘昆香無核’以外其余3個父本‘貴妃玫瑰’、‘玫瑰香’、‘巨玫瑰’均未在2 000 bp 處出現(xiàn)特異性條帶。因此用SCF27-2000 無核標(biāo)記對3個雜交組合‘昆香無核’ב玫瑰香’、‘昆香無核’ב巨玫瑰’和‘紅寶石無核’ב玫瑰香’的胚挽救雜交后代進(jìn)行無核性狀檢測；(2)無核探針GSLP1-569對8 個雜交親本擴(kuò)增結(jié)果如圖3,B所示，母本‘火焰無核’擴(kuò)增出569 bp特異條帶，而在其他無核親本中并沒有擴(kuò)增出569 bp 特異條帶，因此以‘火焰無核’為母本的雜交組合(‘火焰無核’ב巨玫瑰’和‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’)可以選擇無核基因探針GSLP1-569 對其雜交后代進(jìn)行無核性狀的早期鑒定。

2.4.2無核標(biāo)記(或探針)對雜交子代的檢測1)無核標(biāo)記SCF27-2000對雜交子代的檢測。無核標(biāo)記SCF27-2000 對雜交組合‘昆香無核’ב玫瑰香’、‘昆香無核’ב巨玫瑰’和‘紅寶石無核’ב玫瑰香’雜交子代的60 個株系進(jìn)行無核性狀的檢測。結(jié)果如圖4,A、B，其中組合‘昆香無核’ב玫瑰香’的15個株系中有11個株系在2 000 bp處擴(kuò)增出特異性條帶；‘昆香無核’ב巨玫瑰’15個株系中有13個株系具有2 000 bp 特異性條帶；組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’30個株系中有14個株系在2 000 bp 處出現(xiàn)特異性條帶。

2)無核探針GSLP1-569對雜交子代的檢測(圖4,C)。無核探針GSLP1-569 對雜交組合‘火焰無核’ב巨玫瑰’和‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’的12個株系進(jìn)行無核檢測，其中‘火焰無核’ב巨玫瑰’7株系，有4個株系具有569 bp 特異性條帶；‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’5個株系中，4個株系擴(kuò)增出569 bp的特異性條帶。

3 討 論

胚挽救育種過程中，親本基因多樣性是導(dǎo)致表型、胚珠及胚發(fā)育、成苗等方面差異的首要因素。1982年以來，國內(nèi)外育種工作者不斷嘗試各種無核或有核品種以期獲得更高的胚挽救效率，從而得到較多胚挽救雜種后代[17]。胚挽救結(jié)果受母本基因型影響較多，同時父本也對胚挽救效率有一定影響[17]。Emershad等[4]在研究中以‘無核白’為親本，成苗率僅為10%～15%。前期研究中，以‘底萊特’為母本的雜交組合胚挽救效率較高，其胚發(fā)育率高于母本材料為‘紅臉無核’的組合[19]。以 ‘火焰無核’、‘愛神玫瑰’、‘無核白雞心’和‘紅寶石無核’為母本，父本為‘雙優(yōu)’、 ‘北醇’的雜交組合成苗率相對較高[18, 25]。本文試驗中，同樣培養(yǎng)條件下，母本為‘紅寶石無核’、‘火焰無核’、‘昆香無核’的雜交組合胚挽救效果較好，其中‘紅寶石無核’為母本的組合成苗較高(14.63%)，是胚挽救中很好的母本材料，這與前人結(jié)果一致[32-33]。香味品種中‘玫瑰香’更適合作為父本材料來選育香味無核種質(zhì)。

M. 2k plus Marker；A. 無核標(biāo)記SCF27-2000 檢測組合‘昆香無核’ב玫瑰香’和‘昆香無核’ב巨玫瑰’子代無核性狀: 1和18. 昆香無核；2. 玫瑰香；3～17. 雜交組合‘昆香無核’ב玫瑰香’不同雜交株系；19. 巨玫瑰；20～34. 雜交組合‘昆香無核’ב巨玫瑰’不同雜交株系。B. 無核標(biāo)記SCF27-2000 檢測組合‘紅寶石無核’ב玫瑰香’子代無核性狀:1和18. 紅寶石無核；2和19. 玫瑰香；3～17和20～34. 雜交組合‘昆香無核’ב玫瑰香’不同雜交株系。C. 無核探針GSLP1-569檢測組合‘火焰無核’ב巨玫瑰’和‘火焰無核’ב貴妃玫瑰子代無核性狀:1和10. 火焰無核；2. 巨玫瑰；3～9. 雜交組合‘火焰無核’ב巨玫瑰’不同雜交株系；11. 貴妃玫瑰；12～16. 雜交組合‘火焰無核’ב貴妃玫瑰’不同雜交株系圖4 利用無核標(biāo)記SCF27-2000和無核基因探針GSLP1-569鑒定胚挽救雜交苗無核性狀M. 2k plus Marker; A. Schematic the detection of hybrid progeny seedlings with grapevine seedless gene using marker SCF27-2000: 1 and 18. Kunxiang Seedless; 2. Muscat; 3-17. hybrid progeny seedlings of the cross Kunxiang Seedless × Muscat; 18. Kunxiang Seedless; 19. Muscat kyoho; 20-34. hybrid progeny seedlings of the cross Kunxiang Seedless × Muscat kyoho. B. Schematic the detection of hybrid progeny seedlings with grapevine seedless gene using marker SCF27-2000: 1 and 18. Ruby Seedless; 2 and 19. Muscat; 3-17 and 20-34. hybrid progeny seedlings of the cross Ruby Seedless × Muscat. C. Schematic the detection of hybrid progeny seedlings with grapevine seedless gene using GSLP1-569 probe: 1 and 10. Flame Seedless; 2. Muscat kyoho; 3-9. hybrid progeny seedlings of the cross Flame Seedless × Muscat kyoho; 11. Guifeimeigui; 12-17. hybrid progeny seedlings of the cross Flame Seedless × GuifeimeiguiFig.4 Molecular marker-assisted selection of hybrid progeny seedlings with grapevine seedless gene

采樣時間同樣對胚挽救結(jié)果有著重要的影響，采樣過早胚發(fā)育不成熟，而采樣過晚胚已經(jīng)敗育，最終導(dǎo)致胚挽救成苗率低[26]。而判斷采樣時間是否合適的標(biāo)準(zhǔn)則是胚發(fā)育率，從胚珠中剝?nèi)∮着叩臄?shù)量即胚發(fā)育率[11]。李桂榮等[18]2010年胚挽救結(jié)果表明，‘火焰無核’、‘克瑞森無核’、‘紅寶石無核’的最佳采樣時期分別為授粉后45 d、60 d和65 d。本研究在2015年以‘火焰無核’、‘克瑞森無核’和‘紅寶石無核’為母本的雜交組合分別在授粉后的43 d、39 d前、59～60 d采樣，胚發(fā)育率和成苗率較高。本試驗結(jié)果與之前研究有所差異，可能是由于不同年份、不同地區(qū)物候不同引起胚發(fā)育差異。試驗中相同母本最佳采樣時間相同或相近，表明母本材料對采樣時間的確定影響較大，而父本基因型對其也有一定影響[19]。

通過胚挽救獲得的植株只能在其結(jié)實后確定是否為雜種后代，而胚挽救過程中利用分子標(biāo)記輔助可更早對后代表型進(jìn)行早期判斷，是生物技術(shù)與育種的完美結(jié)合。Mejia和王躍進(jìn)等[30-31]分別開發(fā)出無核標(biāo)記SCF27-2000和無核探針GSLP1-569，為分子標(biāo)記篩選、檢測無核性狀奠定了基礎(chǔ)。然而利用無核標(biāo)記SCF27-2000 檢測雜交子代時，若存在等位基因，檢測結(jié)果會受到影響，并且不能很好區(qū)分親本的有核、軟核、無核性狀[19]。前期研究發(fā)現(xiàn)無核探針GSLP1-569檢測有些無核親本如‘愛莫無核’和‘紅寶石無核’時，在569 bp處未出現(xiàn)特異性條帶[20, 34]。本試驗選擇無核探針GSLP1-569和無核標(biāo)記SCF27-2000 對親本和子代無核性狀進(jìn)行檢測。親本中只有‘火焰無核’在569 bp處出現(xiàn)特異條帶，因此無核探針GSLP1-569可對以‘火焰無核’為親本的組合雜交后代進(jìn)行無核性狀的早期鑒定；無核標(biāo)記SCF27-2000檢測親本無核性時，5 個親本(‘火焰無核’‘昆香無核’‘紅寶石無核’‘莫莉莎無核’‘克瑞森無核’和‘波爾萊特’)擴(kuò)增出2 000 bp 特異性條帶，可用于對3個組合‘昆香無核’ב玫瑰香’、‘昆香無核’ב巨玫瑰’和‘紅寶石無核’ב玫瑰香’的雜交后代的檢測。檢測的72個雜交株系中46個株系有特異條帶，初步確定為無核株系。標(biāo)記檢測過的幼苗，煉苗移栽后加速雜種苗的生長發(fā)育，促進(jìn)雜種苗盡快進(jìn)入結(jié)果期以觀察其性狀表現(xiàn)。

綜上，本研究在利用胚挽救技術(shù)創(chuàng)制無核香味葡萄新種質(zhì)的同時，對影響葡萄胚挽救效率的親本基因型、取樣時間、胚珠培養(yǎng)時間與胚發(fā)育時期等進(jìn)行研究，為后期葡萄胚挽救育種提供參考。