低溫及貯藏年份對芍藥種子生根及其生理特性的影響

張梅娟，謝 軍, ，孫輯凱，沙 偉, ，張 捷，馬天意*

(1 齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江齊齊哈爾 161006; 2 東北林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院, 哈爾濱 150040; 3 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院, 黑龍江齊齊哈爾 161005)

芍藥(PaeonialactifloraPall.)屬于芍藥科(Paeoniaceae)芍藥屬，是中國傳統(tǒng)名花，觀賞價(jià)值極高且耐粗放管理，常被應(yīng)用于園林、醫(yī)藥等方面[1-2]。芍藥在園林應(yīng)用中需求量大，但由于芍藥種子具有特殊的上、下胚軸雙重休眠特性，導(dǎo)致其萌發(fā)率低，嚴(yán)重影響芍藥的產(chǎn)量，也對芍藥的栽培育種等工作產(chǎn)生阻礙[3-5]。雖然可采用其他方法對芍藥進(jìn)行營養(yǎng)繁殖，但播種繁殖是獲得實(shí)生苗的唯一途徑，且具有其他方法不可替代的重要地位，仍然是芍藥繁殖的主要方法[6]。

芍藥原產(chǎn)于俄羅斯的西伯利亞地區(qū)和中國北部[2]，很多原產(chǎn)溫帶和寒帶的植物種子都具有休眠特性[7]，芍藥也不例外。種子休眠是個(gè)對植物有利的特性，受到內(nèi)部和外部環(huán)境等因素的共同控制[7-8]。國內(nèi)外對芍藥種子休眠的原因與機(jī)理還沒有形成統(tǒng)一的認(rèn)識(shí)，但在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，芍藥種子休眠的內(nèi)部原因大體可以歸結(jié)為兩種，一是種子內(nèi)萌發(fā)抑制物質(zhì)的作用，二是種皮及其附屬物造成了萌發(fā)障礙[9]。而芍藥種子萌發(fā)時(shí)，根系生長與幼苗生長所需要的外界環(huán)境條件是不同的[3]，這是因?yàn)樯炙幏N子具有上下胚軸雙重休眠的特性，打破上下胚軸休眠所需的外部環(huán)境條件不同，因此需要分別進(jìn)行研究。

芍藥種子休眠的解除是其播種繁殖的基礎(chǔ)，因此，打破芍藥種子的休眠使其盡快萌發(fā)，對提高芍藥播種繁殖效率的意義重大。在打破芍藥種子休眠的過程中，必須先打破下胚軸休眠再打破上胚軸休眠，打破下胚軸休眠是解除芍藥休眠的第一步，是芍藥播種繁殖工作的重中之重[10]。在前人的研究中，打破芍藥種子下胚軸休眠的方法主要有：使用機(jī)械打磨或化學(xué)試劑對種皮進(jìn)行處理，降低種皮厚度；使用植物激素對芍藥種子進(jìn)行萌發(fā)誘導(dǎo)；改變萌發(fā)介質(zhì)條件等[11-13]，而關(guān)于不同溫度處理對芍藥種子下胚軸萌發(fā)影響的研究較少。岳樺等[13]曾采用先高溫再低溫的變溫處理方法，對沙藏生根過程中的芍藥種子進(jìn)行了溫度處理，發(fā)現(xiàn)25 ℃恒溫處理30 d后、15 ℃恒溫處理90 d的綜合變溫處理能夠顯著提高芍藥下胚軸破眠效果。然而，關(guān)于在沙藏前對芍藥種子進(jìn)行低溫處理的研究較少，沙藏前低溫處理對芍藥種子萌發(fā)生根的影響尚不明確。

種子在不同萌發(fā)階段的生理生化變化可以反映種子萌發(fā)過程中的內(nèi)在機(jī)制，對萌發(fā)過程中生理生化變化的研究有利于探索芍藥種子破眠的條件。關(guān)雪蓮等[14]以沙藏過程中新疆塊根芍藥(Paeoniaanomala)種子為實(shí)驗(yàn)材料，采用5種不同的沙藏和赤霉素(gibberellic acid 3, GA3)處理，發(fā)現(xiàn)在不同處理中可溶性糖、可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，且GA3與沙藏相結(jié)合處理種子的可溶性糖、可溶性蛋白增加量明顯高于單獨(dú)沙藏處理。孫曉梅等[15]著重分析了超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化物酶(peroxidase, POD)和過氧化氫酶(catalase, CAT)在芍藥種子吸脹及沙藏過程中的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在吸脹12 h時(shí)芍藥種子開始萌發(fā)，SOD發(fā)揮作用時(shí)期較早，SOD和POD的活性與種子萌發(fā)呈負(fù)相關(guān)，CAT活性與萌發(fā)呈正相關(guān)。李敏[16]報(bào)道，GA3處理芍藥種子生根過程中SOD、POD、CAT的活性隨著芍藥種子沙藏時(shí)間的延長而增強(qiáng)，而丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量下降，苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)和蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性先增強(qiáng)后減弱。這些研究為不同條件下芍藥種子萌發(fā)過程中的內(nèi)在變化機(jī)制的解釋提供了支撐，但芍藥種子生根不同階段中更詳細(xì)完備的生理生化信息還需要大量的工作來補(bǔ)充完善。

因此，本研究對芍藥種子先后進(jìn)行了低溫和沙藏處理，在低溫處理中設(shè)置了-20 ℃和-40 ℃2種溫度梯度，以及15、30、45、60 d的處理時(shí)間梯度，以更加細(xì)致地探討低溫對解除芍藥種子下胚軸休眠的作用；同時(shí)，本研究還采用3個(gè)不同貯藏年份的芍藥種子作為實(shí)驗(yàn)材料，考察了芍藥種子在存放不同年份時(shí)低溫處理對其生根的影響，并對不同貯藏年份芍藥種子生根不同階段的生理生化變化進(jìn)行了測定，以期更好地解釋貯藏年份對芍藥種子下胚軸休眠解除的影響機(jī)制。本研究結(jié)果將為芍藥種子的采收、栽培、育種奠定理論基礎(chǔ)和方法學(xué)指導(dǎo)，以加速芍藥種子萌發(fā)，增加芍藥的產(chǎn)量，促進(jìn)芍藥更好地在園林觀賞中應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選取當(dāng)年采收和采后存放1年、2年的芍藥種子為實(shí)驗(yàn)材料。當(dāng)年采收的芍藥種子采收時(shí)間為2016年8月；貯藏1年和2年的芍藥種子采收時(shí)間分別為2015年8月和2014年8月，采集地點(diǎn)均為齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院芍藥圃。芍藥種子采收后放入密封容器置于4 ℃冰箱中，低溫密閉貯存，從貯存之日起1年或2年后取出用于試驗(yàn)分析。種子用清水沖洗后，取大小均勻，下沉的飽滿種子用于生根實(shí)驗(yàn)。

1.2 種子萌發(fā)過程觀察

選取整齊度一致的新鮮芍藥種子，在室溫條件下同時(shí)對不同貯藏年份的芍藥種子先分別于清水中浸泡30 min，選取下沉的種子20粒，用0.5%高錳酸鉀溶液浸泡20 min消毒后沖洗凈，然后進(jìn)行室溫沙藏。沙藏時(shí)將高溫滅菌20 min的河沙與種子按3∶1的體積比混勻，沙子濕度為沙子最大持水量的50%。在芍藥種子室溫沙藏過程中，對萌發(fā)不同天數(shù)的芍藥種子進(jìn)行形態(tài)觀察，觀察時(shí)將種子從沙中取出洗凈后進(jìn)行圖像采集，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 持續(xù)低溫處理下種子生根指標(biāo)測定

為研究不同貯藏年份芍藥種子在不同程度和時(shí)長低溫處理下的生根情況，將不同貯藏年份的芍藥種子于清水中浸泡30 min，分別取下沉的種子各20粒，使用0.5%高錳酸鉀溶液浸泡20 min消毒后沖洗凈，于-20 ℃或-40 ℃冰箱中分別處理15、30、45和60 d，以室溫(20～25 ℃)條件下生長的芍藥種子作為對照，每種處理分別進(jìn)行3次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)。所有處理后的種子同時(shí)在室溫條件下進(jìn)行沙藏。在芍藥種子低溫處理后室溫沙藏期間，每7 d觀察并記錄一次種子的生根情況，實(shí)驗(yàn)總天數(shù)為84 d。生根實(shí)驗(yàn)結(jié)束后比較生根結(jié)果，計(jì)算不同處理下芍藥種子的首粒生根時(shí)間、生根指數(shù)、生根率。生根率和生根指數(shù)的計(jì)算方法分別為：

生根率=(正常生根種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%[17]

生根指數(shù)(GI)=∑(Gt/Dt)，

式中Gt為第t天生根種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的種子生根天數(shù)[14]。

1.4 不同貯藏年份種子生理指標(biāo)測定

根據(jù)芍藥種子生根過程中的形態(tài)變化，將芍藥種子的生根過程劃分為3個(gè)階段，分別為萌前階段、露白至生根階段和生根3～5 cm階段，各貯藏年份的種子分別在此3個(gè)階段取樣進(jìn)行生理指標(biāo)測定。

1.4.1種子含水量采用低恒溫烘干法進(jìn)行含水量測定[18]，含水量(%)=(M2-M3)/(M2-M1)。M1為培養(yǎng)皿重量(g)，M2為培養(yǎng)皿和樣品的烘前重量(g)，M3為培養(yǎng)皿和樣品的烘后重量(g)。將不同貯藏年份種子橫切后放入培養(yǎng)皿中，放入(103±2)℃的烘箱內(nèi)18 h，冷卻30 min后進(jìn)行測定，每組樣品進(jìn)行獨(dú)立的3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4.2可溶性糖含量采用改良的蒽酮比色法[19]進(jìn)行種子可溶性糖含量測定。將不同貯藏年份芍藥種子研磨成粉，取50～100 mg種子粉末，加入4 mL 80%乙醇溶液后，80 ℃水浴加熱40 min，3 500 r/min離心10 min后收集上清液，將對沉淀進(jìn)行第2次提取，合并上清液，定容至25 mL，即得樣品提取液。取1 mL樣品提取液，加入0.5 mL 2%蒽酮試劑，緩慢加入5 mL濃硫酸，充分搖勾，沸水浴10 min。加熱后投入清水中冷卻，20 min后使用分光光度計(jì)測定620 nm處吸光度(OD)值，使用事先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線[19]進(jìn)行可溶性糖含量的計(jì)算。每組樣品進(jìn)行獨(dú)立的3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4.3淀粉含量采用高氯酸蒽酮比色法進(jìn)行種子淀粉含量測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制后[20]，進(jìn)行提取液制備：向提取過可溶性糖的材料沉淀中加入5 mL 9.2 mol/L高氯酸，快速振蕩搖勻后靜置反應(yīng)5 min，10 000 r/min離心3 min，將上清移液入100 mL容量瓶，重復(fù)3次，用5 mL蒸餾水洗滌沉淀2次，離心3 min，將上清液移入容量瓶定容，搖勻后得到供試液。使用紫外分光光度計(jì)測定淀粉含量，測定方法同1.4.2。

1.4.4可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法[21]進(jìn)行測定。稱取0.3 g種子粉末，加入5 mL蒸餾水研磨均勻后并轉(zhuǎn)移至離心管中，6 000 r/min離心20 min，所得上清液置于50 mL容量瓶中。向離心管中沉淀加入5 mL蒸餾水，進(jìn)行二次提取，離心后合并上清液，使用蒸餾水定容至50 mL，得到待測液。吸取1 mL待測液于試管中，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)染液，充分混合后靜置3 min，使用分光光度計(jì)測定595 nm處OD值，使用事先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線[21]進(jìn)行可溶性蛋白質(zhì)含量的計(jì)算。每組樣品進(jìn)行獨(dú)立的3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4.5過氧化物酶和過氧化氫酶活性不同貯藏年份種子切碎后加入適量的磷酸緩沖液[22]冰浴下研磨成勻漿，3000 r/min離心10 min后將上清液轉(zhuǎn)入25 mL容量瓶中。使用5 mL磷酸緩沖液對沉淀再次提取兩次，將上清液并入容量瓶中，定容至刻度后獲得待測酶液，4 ℃低溫下保存?zhèn)溆?，進(jìn)行過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性測定。

(1) POD活性。采用愈創(chuàng)木酚法[22]測定。將2.9 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液、1.0 mL 2% H2O2、1.0 mL 0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚和0.1 mL待測酶液作為實(shí)驗(yàn)組，用加熱煮沸5 min的待測酶液為對照，立即對實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品進(jìn)行15 min 37 ℃水浴，然后迅速轉(zhuǎn)入冰浴，并加入2.0 mL 20%三氯乙酸終止反應(yīng)，離心10 min后適當(dāng)稀釋，使用分光光度計(jì)測定4 nm處OD值，使用事先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線[22]計(jì)算POD活性。每組樣品進(jìn)行獨(dú)立的3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

(2)CAT活性。取2支10 mL試管，其中一支為對照組，另一支為待測組。分別向待測組試管內(nèi)先后加入0.2 mL待測酶液、1.5 mL 0.2 mol/L (pH 7.8)的磷酸緩沖液和1 mL的蒸餾水；同時(shí)在對照組試管中加入煮沸的待測酶液。25 ℃預(yù)熱后，向每個(gè)試管中加入0.3 mL 0.1 mol/L的H2O2，每次加入后立即計(jì)時(shí)，并迅速倒入石英比色杯中，測定240 nm波長下的OD值，每隔1 min讀數(shù)1次，共測4 min。每組樣品進(jìn)行獨(dú)立的3次生物學(xué)重復(fù)，使用事先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線[22]計(jì)算CAT活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析方法采用SPSS 17.0進(jìn)行差異性分析和標(biāo)準(zhǔn)誤差分析，采用LSD方法進(jìn)行多重比較(a=0.05)；使用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫和貯藏年份對芍藥種子生根的影響

單因素方差分析結(jié)果(表1)顯示，貯藏年份、處理溫度和處理天數(shù)3個(gè)因素對芍藥首粒種子生根時(shí)間、生根指數(shù)、生根率均有極顯著的主效應(yīng)，說明3因素單獨(dú)對各生根指標(biāo)都有極顯著的影響，其中貯藏年份F值最大，對種子生根的影響力最大；主體間效應(yīng)的多因素方差分析結(jié)果表明，3個(gè)因素的交互作用對芍藥首粒種子生根時(shí)間有顯著影響，但對其他指標(biāo)的影響均不顯著；同時(shí)任意2個(gè)因素的交互作用對芍藥種子生根的3個(gè)參數(shù)均無明顯影響(表1)。因此，以后著重分析貯藏年份對芍藥種子生根及生理指標(biāo)的影響。

2種低溫(-20 ℃和-40 ℃)對芍藥種子進(jìn)行不同天數(shù)處理后，不同貯藏年份芍藥種子的生根情況如表2所顯示。首先，各個(gè)貯藏年份芍藥種子在2種低溫處理15～60 d后，其首粒種子生根時(shí)間比室溫對照組明顯縮短，生根指數(shù)和生根率均比室溫對照組明顯提高，說明各貯藏年份芍藥種子在沙藏前進(jìn)行-20 ℃和-40 ℃低溫處理均有助于打破下胚軸休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)。但不同的低溫處理溫度、低溫處理時(shí)間和貯藏年份對打破下胚軸休眠的效果不同，其中貯藏一年種子在沙藏前進(jìn)行-40 ℃、30 d的處理效果最佳，首粒種子生根時(shí)間最短，只需21d，生根指數(shù)最高(1.482)，生根率最高(88.33%)，而對照組的生根率僅45.00%，最佳處理組生根率比對照組高43.33%(表2)。其次，在相同低溫溫度和處理時(shí)間條件下，貯藏1年的芍藥種子首粒種子生根時(shí)間、生根指數(shù)和生根率等指標(biāo)均優(yōu)于當(dāng)年采收的芍藥種子，當(dāng)年采收種子又優(yōu)于貯藏2年的芍藥種子，說明采收后存放1年的芍藥種子最容易萌發(fā)生根。同時(shí)，相同低溫處理溫度和種子貯藏年份條件下，隨著低溫處理時(shí)間的延長，首粒種子生根時(shí)間呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢，最小值出現(xiàn)在低溫處理30 d；其生根指數(shù)和生根率呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，最大值都出現(xiàn)在低溫處理30 d，說明低溫處理的最佳時(shí)間是30 d。此外，在控制低溫處理時(shí)間和種子貯藏年份不變時(shí)，芍藥種子生根數(shù)據(jù)指標(biāo)在-40 ℃低溫環(huán)境下均優(yōu)于-20 ℃低溫環(huán)境。

表1 不同低溫處理下芍藥種子生根影響因素的主體間效應(yīng)檢驗(yàn)

注：**和*表示分別達(dá)到0.01和0.05差異顯著性水平Note: ** and * mean significant difference at 0.01 and 0.05 level，respectively

表2 不同低溫和處理時(shí)間下各貯藏年份芍藥種子生根情況

2.2 芍藥種子生根過程

為確定生理實(shí)驗(yàn)測定的具體取材時(shí)間，我們對芍藥種子生根過程中的形態(tài)變化進(jìn)行了觀察分析，將芍藥種子的生根過程劃分為3個(gè)階段，分別為萌前階段、露白至生根階段和生根3～5 cm階段。當(dāng)胚根伸長到種子長度的1/2以后，可以確定種子已萌發(fā)生根[23]，在時(shí)長為84 d的生根實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到沙藏處理后的芍藥種子在一段時(shí)間后，下胚軸休眠可以被打破，種皮在種臍處開裂，之后胚根不斷生長伸長，此時(shí)芍藥種子進(jìn)入露白至生根階段，在此之前為萌前階段。隨后胚根繼續(xù)不斷伸長，達(dá)到平均根長為3～5 cm，此時(shí)為芍藥種子生根3～5 cm階段(圖1)，此時(shí)我們認(rèn)為芍藥種子下胚軸的休眠被完全打破，根進(jìn)入正常生長階段。

2.3 各貯藏年份芍藥種子在不同生根階段生理生化指標(biāo)分析

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，盡管不同的低溫處理可以促進(jìn)芍藥種子的生根效率，但最顯著的影響因素卻是芍藥種子貯藏年份，即種子采收后的存放時(shí)長。為能初步解釋不通貯藏年份對芍藥種子生根的機(jī)制，我們對不同貯藏年份芍藥種子在生根不同階段的生理生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測分析。

2.3.1含水量在種子生根過程中，各貯藏年份的芍藥種子含水量均呈現(xiàn)出相同的逐漸上升趨勢，且始終表現(xiàn)為當(dāng)年采收種子>貯藏1年的種子>貯藏2年種子(圖2)。其中，當(dāng)年采收、貯藏1年和貯藏2年芍藥種子含水量在萌前階段至露白生根階段均上升幅度較大，增幅分別為28.74%、36.06%和38.14%；在隨后生根過程中種子含水量緩慢上升，變化幅度較小，三者分別上升了2.29%、2.40%和7.70%。可見，采收后貯藏時(shí)間越長的芍藥種子在生根時(shí)含水量越低，但上升幅度越大。

2.3.2可溶性糖和可溶性蛋白含量不同貯藏年份芍藥種子可溶性糖含量在其生根過程中都呈現(xiàn)先上升再下降的變化趨勢，并均在露白生根階段達(dá)到峰值，而當(dāng)根系不斷伸長時(shí)可溶性糖含量又逐漸減少(圖3)。其中，在種子生根過程中，當(dāng)年采收、貯藏1年和貯藏2年的芍藥種子可溶性糖含量先從萌前階段的10.35%、16.91%和9.29%分別上升至露白生根階段的12.30%、19.17%和16.40%，然后它們又分別下降至生根3～5 cm階段的7.91%、14.59%和10.69%；芍藥種子可溶性糖含量基本表現(xiàn)為貯藏1年最高，貯藏2年居中，當(dāng)年采收最低?？梢?，芍藥種子可溶性糖含量在貯藏1年時(shí)最高，且其在生根過程中的變化幅度隨貯藏年份延長而增加。

A. 萌前階段; B、C. 露白至生根階段; D. 生根3～5 cm階段圖1 芍藥種子生根過程的不同階段A. Before germination; B, C. Exposing stage to rooting stage; D. Rooting to 3-5 cm stage.Fig.1 Different stages of peony seed rooting process

另外，不同貯藏年份的芍藥種子可溶性蛋白含量在生根過程中均呈現(xiàn)先下降之后上升的趨勢，并均在露白生根階段可溶性蛋白含量達(dá)到最低點(diǎn)(圖3)。其中，在種子生根過程中，當(dāng)年采收、貯藏1年和貯藏2年的芍藥種子可溶性蛋白含量從萌前到露白生根階段分別下降了23.57%、30.06%和16.18%，之后到生根3～5 cm階段它們又分別上升了16.49%、14.04%和17.93%。貯藏2年的芍藥種子可溶性蛋白含量降幅最小，而增幅最大，始終高于其余貯藏年份種子；而貯藏1年種子降幅最大，升幅最小，變化較大，生根后處于較低水平。

誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差; 小寫字母表示差異顯著水平(P<0.05)；下同圖2 不同貯藏年份芍藥種子不同生根階段中的含水量變化Error bars indicate standard deviations, the normal letters indicate different significant levels (P<0.05)；The same as belowFig.2 The changes in water content of peony seeds harvested in different years at different rooting stages

2.3.3淀粉含量當(dāng)年采收、貯藏1年、貯藏2年的芍藥種子在生根階段的淀粉含量和變化趨勢相似，均呈現(xiàn)逐漸迅速下降的趨勢(圖4)。其中，它們先從萌前階段的12.97%、13.00%和13.73%分別下降到露白生根階段的9.75%、10.64%和10.12%，然后繼續(xù)下降至生根3～5 cm階段的6.78%、6.98%和5.59%，最終比萌前階段分別下降了47.73%、46.31%和59.29%，即貯藏2年的芍藥種子降幅最大。

2.3.4過氧化物酶和過氧化氫酶活性如圖5所示，各貯藏年份芍藥種子POD在生根過程中均先升后降，而其CAT活性均先降后升，并分別在露白生根階段達(dá)到最大值和最低值。其中，當(dāng)年采收、貯藏1年、貯藏2年的芍藥種子POD活性從萌前到露白生根階段分別大幅上升了85.89%、76.19%和112.24%，后從露白生根到生根3～5 cm階段又分別大幅下降了52.85%、92.57%和85.10%，且最終均低于萌前水平期間種子POD活性始終表現(xiàn)為貯藏1年<當(dāng)年采收<貯藏2年；同時(shí)，當(dāng)年采收、貯藏1年、貯藏2年的芍藥種子CAT活性從萌前到露白生根過程中分別下降了51.35%、24.24%和31.25%，從露白生根到生根3～5 cm過程中又分別上升了72.22%、27.27%和18.18%，期間種子CAT活性始終表現(xiàn)為貯藏1年>當(dāng)年采收>貯藏2年?？梢姡谏炙幏N子生根過程中，各貯藏年份種子中POD活性變化趨勢與其CAT活性在某種程度上正好相反，可能在發(fā)揮共同的生理作用時(shí)表現(xiàn)出互補(bǔ)的功能。

圖4 不同貯藏年份芍藥種子不同生根階段中的淀粉含量變化Fig.4 The changes in starch content of peony seeds harvested in different years at different rooting stages

圖3 不同貯藏年份芍藥種子不同生根階段中的可溶性糖和可溶性蛋白含量變化Fig.3 The changes in soluble sugar and protein contents of peony seeds harvested in different years at different rooting stages

圖5 不同貯藏年份芍藥種子不同生根階段中過氧化物酶和過氧化氫酶活性變化Fig.5 The changes in peroxidase and catalase activities of peony seeds harvested in different years at different rooting stages

3 討 論

3.1 芍藥種子的生根過程

在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，芍藥種子的萌發(fā)與牡丹相似，可分為萌前期、生根期和發(fā)芽期3個(gè)階段，其中芍藥種子的生根期又能分為露白和根長3～4 cm 2個(gè)階段[14]。芍藥種子的生根過程是連續(xù)的，當(dāng)下胚軸的休眠被打破，胚開始萌動(dòng)，白色胚根從種臍處伸出，并不斷伸長。在本研究中，為便于生理生化指標(biāo)分析取材時(shí)間掌控及種子萌發(fā)過程中不同階段的詳細(xì)描述，將芍藥種子的生根過程分為萌前階段、露白至生根階段和生根3～5 cm階段，以避免芍藥種子生根過程中具有爭議的過渡階段。

3.2 低溫處理下不同貯藏年份芍藥種子生根狀況

在本研究的8組低溫處理和1組對照的芍藥種子生根實(shí)驗(yàn)中，低溫處理組芍藥種子的生根指數(shù)和生根率均高于對照組，同時(shí)低溫組的首粒種子生根時(shí)間均低于對照組，各種低溫處理下芍藥種子的生根效果均優(yōu)于對照，這說明在種子沙藏前進(jìn)行低溫處理有助于解除芍藥種子的下胚軸休眠，促進(jìn)生根。其中，在同一低溫處理下，采收后貯藏1年的芍藥種子的首粒種子生根時(shí)間最短、生根指數(shù)及生根率最高，生根結(jié)果優(yōu)于當(dāng)年采收和貯藏2年的芍藥種子。這可能是由于隨著貯藏時(shí)間的延長，種子完成了生理后熟，使得生根率大幅度提高，故貯藏1年種子的生根效果優(yōu)于當(dāng)年采收的種子。但是如果貯藏時(shí)間繼續(xù)延長，種子中的水分和營養(yǎng)物質(zhì)逐漸流失，種子的生活力漸漸下降，失活種子增多，導(dǎo)致生根率下降迅速，因此貯藏2年的芍藥種子生根結(jié)果低于當(dāng)年采收的芍藥種子且遠(yuǎn)低于貯藏1年的芍藥種子。同時(shí)，在各種低溫處理中，同一貯藏年份下-40 ℃處理后的種子生根效果優(yōu)于-20 ℃處理，其中又以-40 ℃處理30 d的生根結(jié)果最好，其首粒種子生根時(shí)間短，生根指數(shù)高，生根率高?？梢?，低溫可以加速打破芍藥種子下胚軸休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)生根，同時(shí)更低的溫度更有助于打破休眠，在本研究中以-40 ℃低溫、處理天數(shù)30 d時(shí)效果最好。另外，本試驗(yàn)中多因素方差分析發(fā)現(xiàn)，盡管不同低溫處理可以促進(jìn)芍藥種子的生根效率，但影響種子生根最顯著的因素卻是芍藥種子貯藏年份，即種子采收后的存放時(shí)長。

3.3 不同貯藏年份的芍藥種子生根過程中的生理生化變化特征

3.3.1芍藥種子中相關(guān)物質(zhì)含量的變化首先，在芍藥種子貯藏過程中，種子中的水分會(huì)不斷減少，因此，貯藏時(shí)間越長的芍藥種子萌前階段含水量越少；與當(dāng)年采收的芍藥種子萌前含水量(27.81%)相比，貯藏1年(17.20%)和貯藏2年(7.69%)的芍藥種子萌前含水量分別減少了10.61%和9.51%。我們發(fā)現(xiàn)種子含水量的這種變化趨勢與室溫條件下不同貯藏年份芍藥種子的首粒種子生根時(shí)間成正相關(guān)，由此我們推測正常條件下種子的含水量一定程度上可能決定芍藥種子開始生根的最短時(shí)間。

其次，從萌前階段到露白生根階段，在適宜的外界條件下，芍藥種子的休眠逐漸解除，胚開始萌動(dòng)，此時(shí)可能由于種子中蛋白質(zhì)、淀粉等不溶的大分子逐漸分解成小分子的可溶性糖，種子可溶性糖含量會(huì)逐漸上升；而在露白生根到生根3～5 cm階段，我們推測因?yàn)楦抵饾u伸展延長，生理活動(dòng)消耗了大量可溶性糖，因此種子可溶性糖含量逐漸減少。同樣是從萌前到露白生根階段，芍藥種子分解了大量的淀粉用于產(chǎn)生可溶性糖，為種子的萌發(fā)生根提供最初的動(dòng)力和能量，因此該階段種子淀粉含量應(yīng)逐漸減少[24]；在露白生根到生根3～5 cm階段，可能由于根系逐漸伸長，植物體需要繼續(xù)消耗能量，而此時(shí)還沒有葉片能進(jìn)行光合作用形成淀粉等物質(zhì)，因此該階段種子淀粉含量會(huì)減少。我們推測芍藥種子中可溶性糖含量在一定程度上決定其生根率，種子的成功生根需要消耗能量，而作為直接能源物質(zhì)的可溶性糖的含量總體上可能影響芍藥種子的生根率。在萌前階段，貯藏1年的芍藥種子中可溶性糖含量遠(yuǎn)高于當(dāng)年采收和貯藏2年的芍藥種子，這種趨勢與各種處理下不同貯藏年份種子的生根率和生根指數(shù)的變化趨勢基本一致，同時(shí)不同貯藏年份種子的可溶性糖含量比例與生根率之間的比例也較為相似。因此，我們猜測萌前階段芍藥種子的可溶性糖含量與其萌發(fā)能力可能有密切的關(guān)系。

再次，不同貯藏年份芍藥種子的可溶性蛋白質(zhì)含量均在生根階段都是先下降再上升。從萌前到露白生根階段，種子可溶性蛋白質(zhì)含量不斷減少，說明在生根階段可能有大量的蛋白質(zhì)被分解成營養(yǎng)物質(zhì)，為生根提供營養(yǎng)和最初的動(dòng)力。之后，種子可溶性蛋白質(zhì)含量又不斷增加，這可能是由于在這個(gè)階段根系不斷伸長且植物體開始形成新的組織，細(xì)胞開始不斷合成新的蛋白質(zhì)而導(dǎo)致[25]。萌前階段各儲(chǔ)藏年份間芍藥種子的可溶性蛋白質(zhì)含量的比例與含水量和首粒種子萌發(fā)時(shí)間相似，推測芍藥種子萌前階段可溶性蛋白質(zhì)含量與其萌發(fā)的速度可能也存在正相關(guān)的聯(lián)系。

3.3.2芍藥種子中抗氧化酶活性的變化各貯藏年份芍藥種子POD活性在生根階段均先增加再降低。從萌前到露白生根是種子生根啟動(dòng)階段，種子POD活性在這一階段升高，可能影響到了磷酸戊糖途徑，促進(jìn)種子解除休眠，加速萌發(fā)生根[26]。而種子萌發(fā)后，根系不斷伸長，種子POD活性開始逐漸降低。同時(shí)，CAT可以清除過氧化氫及其他自由基，是細(xì)胞新陳代謝的標(biāo)志[27]。一般CAT活性越高，細(xì)胞中過氧化氫含量越少，生活力越高[28]。各貯藏年份芍藥種子CAT活性從萌前到露白生根的過程中逐漸降低，說明細(xì)胞新陳代謝逐漸減弱，而CAT活性從露白生根至生根3～5 cm階段又逐漸升高，說明此階段細(xì)胞新陳代謝逐漸增強(qiáng)，細(xì)胞代謝產(chǎn)生的大量過氧化氫被CAT清除，此時(shí)細(xì)胞的生活力較高。

有趣的是，在我們的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)POD和CAT在芍藥種子不同萌發(fā)階段酶活性的變化趨勢正好相反，這可能是因?yàn)樵谇宄钚匝踝杂苫拿赶到y(tǒng)中存在著生理生化功能的重疊和互補(bǔ)，POD和CAT在同一萌發(fā)時(shí)期酶活性變化相反的現(xiàn)象可能也是由此引起，而超活性氧自由基還存在其它很多清除劑，在芍藥種子萌發(fā)過程中超活性氧自由基相關(guān)的生理生化變化還需要后期更完整的分析。此外，貯藏1年的芍藥種子在整個(gè)萌發(fā)過程中，POD酶活性均低于另外兩個(gè)貯藏時(shí)間，CAT酶活性均高于另兩個(gè)貯藏時(shí)間，總是處于最大值或最小值的情況，這個(gè)特點(diǎn)與其生根率情況相同，推測這個(gè)特點(diǎn)可能在某方面決定芍藥種子的總體生根情況。

綜上所述，芍藥種子沙藏前進(jìn)行低溫處理有助于解除種子下胚軸休眠，促進(jìn)生根。同時(shí)，芍藥種子在沙藏前進(jìn)行低溫處理可以有效減少首粒種子生根時(shí)間，使首粒種子生根時(shí)間提前，生根率提高，有助于加快芍藥的育種、栽培；其中，-40 ℃低溫處理的效果優(yōu)于-20 ℃處理，并以-40 ℃下冷藏30 d后再沙藏芍藥種子的生根結(jié)果最好，首粒種子生根時(shí)間最短、生根指數(shù)和生根率最高。采收后芍藥種子的存放時(shí)間對生根影響較大，這種影響的效果甚至大于試驗(yàn)中采用的處理溫度、處理時(shí)間等因素，且采收后存放1年的芍藥種子生根效果優(yōu)于當(dāng)年采收和貯藏2年的芍藥種子。在不同儲(chǔ)藏年份芍藥種子的生根過程中，種子含水量、萌前階段可溶性蛋白質(zhì)含量與首粒種子生根時(shí)間變化趨勢正相關(guān)；可溶性糖含量、CAT酶活性與生根率變化趨勢正相關(guān)，POD酶活性與生根率變化趨勢負(fù)相關(guān)，推測這些生理生化變化可能分別決定著芍藥種子生根的速度和生根率。在生產(chǎn)實(shí)踐中，可以將采收后的芍藥種子貯藏1年，在沙藏前進(jìn)行-40 ℃處理30 d后進(jìn)行播種，以獲得最佳的生根結(jié)果，得到最短的首粒種子生根時(shí)間和最高的生根率。