安寐丹干預(yù)斑馬魚(yú)睡眠剝奪模型晝夜節(jié)律及能量代謝作用機(jī)制研究＊

汪 卿，游秋云，丁 莉，夏 婧，王 平

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所 武漢 430065）

睡眠是生命活動(dòng)中不可缺少的一種生理現(xiàn)象，良好的睡眠有利于生長(zhǎng)發(fā)育、機(jī)體恢復(fù)以及保持心理健康等。但隨著現(xiàn)代人生活方式的變遷，尤其是新冠疫情引發(fā)的后續(xù)心理問(wèn)題，導(dǎo)致失眠癥的發(fā)病率逐年增高。中國(guó)睡眠研究會(huì)公布的中國(guó)成人失眠患病率已經(jīng)達(dá)到57%[1]。長(zhǎng)期失眠不僅會(huì)導(dǎo)致生活質(zhì)量下降，還會(huì)造成能量代謝紊亂，增加肥胖、糖尿病及代謝綜合征等疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。

研究表明，生物節(jié)律和內(nèi)穩(wěn)態(tài)是調(diào)控睡眠的兩大關(guān)鍵因素，二者又互為影響[3]。一方面生物鐘的節(jié)律表達(dá)參與了機(jī)體能量代謝的調(diào)控。全基因組基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，大約有15%的轉(zhuǎn)錄組基因呈周期性表達(dá)，其中大部分是參與編碼碳水化合物、脂肪酸代謝、膽固醇生物合成的重要調(diào)節(jié)劑[4]。另一方面晝夜節(jié)律的破壞是誘發(fā)代謝性疾病的危險(xiǎn)因素。如輪班工作者患二型糖尿病、胃腸疾病、肥胖、代謝紊亂等的發(fā)病率顯著升高[5]；小鼠時(shí)鐘基因（Clock）突變、時(shí)鐘管理基因（Bmal1）缺陷或SCN受損，都會(huì)引起葡萄糖耐受能力、胰島素敏感性降低，表現(xiàn)為食欲旺盛、晝夜飲食節(jié)律減弱，并且隨著年齡的增長(zhǎng)問(wèn)題更為突出[6]?？梢?jiàn)，生物鐘網(wǎng)絡(luò)和代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是交織在一起，提示我們可以通過(guò)研究生物鐘基因調(diào)控能量代謝的機(jī)制，來(lái)探索失眠防治的方向和路徑[7]。

相較于以中樞神經(jīng)系統(tǒng)鎮(zhèn)靜催眠為主的化學(xué)藥物長(zhǎng)時(shí)間使用會(huì)出現(xiàn)藥物依賴、呼吸抑制、損傷認(rèn)知和精神系統(tǒng)等副作用，中醫(yī)藥在失眠防治領(lǐng)域中顯示出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[8]。經(jīng)典古方安寐丹，出自清代陳士鐸《石室秘錄》一書(shū)。書(shū)云：“心經(jīng)之病，怔忡、不寐等癥，乃心血少矣……”方中人參益心氣，丹參、當(dāng)歸補(bǔ)心血，麥冬養(yǎng)心陰，菖蒲開(kāi)心竅，茯神、棗仁、甘草補(bǔ)心神，五味子斂心氣，諸藥合用，共奏益氣養(yǎng)心安神之功效。臨床用于治療虛證失眠并隨癥加減能收到良好效果[9]。課題組前期實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，安寐丹可通過(guò)修復(fù)線粒體分裂/融合失衡狀態(tài)、食欲素水平等改善睡眠剝奪（SD）模型大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡，恢復(fù)晝夜節(jié)律及學(xué)習(xí)記憶水平[10-11]。安寐丹浸泡給藥后能恢復(fù)光照SD斑馬魚(yú)幼魚(yú)晝夜節(jié)律，且鎮(zhèn)靜催眠效果隨劑量升高而增加，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MAPK/MNK/eIF4E通路相關(guān)[12]。本研究選用模式生物斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，采用咖啡因做誘導(dǎo)劑建立成年斑馬魚(yú)睡眠剝奪模型，觀察安寐丹浸泡給藥后對(duì)晝夜節(jié)律和能量代謝水平的影響，探討了安寐丹在調(diào)控斑馬魚(yú)睡眠中的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用斑馬魚(yú)為4月齡野生型AB系，購(gòu)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心并于湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)室繁殖飼養(yǎng)，參照Westerfield方法[13]，設(shè)置溫度為28℃，光黑交替循環(huán)為14 h：10 h，每天按時(shí)喂食豐年蝦兩次。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與儀器

1.2.1 主要藥物與試劑

安寐顆粒（湖北中醫(yī)藥大學(xué)老年醫(yī)學(xué)研究所提供[14]）；褪黑素（Sigma公司，批號(hào)：M5250）；咖啡因（巴菲爾公司，批號(hào)：58-08-2）；RNA提取液（批號(hào)：G3013）、RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批號(hào)：G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix （High ROX） [A Synthesis Kit（批號(hào)：G3322）]，以上試劑均由武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司提供；總蛋白定量測(cè)試盒考馬斯亮藍(lán)法（批號(hào)：A045-2）、超微量三磷酸腺苷（ATP）酶測(cè)試盒（批號(hào)：A070-6），以上試劑均由南京建成弘大生物科技有限公司提供；尼氏染色液（南京生航生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DL-082）。

1.2.2 主要儀器與設(shè)備

斑馬魚(yú)行為分析系統(tǒng)（法國(guó)View Point Life Science，Videotrack Track 3.5）、T迷宮（法國(guó) View Point Life Science，TF105B）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（Real time-PCR，美國(guó)Bio-Rad公司，CFX96）、超微量分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司，ND2000）、酶標(biāo)檢測(cè)儀（美國(guó)Biotek公司，Epoch）、病理包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司，RM2016）、切片機(jī)（德國(guó)Leica公司，RM2016）、熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司，IX71）。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1 分組及給藥

將斑馬魚(yú)隨機(jī)分成5組，分別為空白組、模型組、褪黑素組、安寐丹低劑量組、安寐丹高劑量組，每組15尾。空白組：正常飼養(yǎng)；模型組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡24 h[15]；褪黑素組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡給藥22 h后再轉(zhuǎn)移到0.464 mg·L-1褪黑素溶液中浸泡給藥2 h；安寐丹低組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡給藥22 h后再轉(zhuǎn)移到0.129 g·L-1安寐丹溶液中浸泡給藥2 h；安寐丹高組：用25 mg·L-1的咖啡因溶液浸泡給藥22 h后再轉(zhuǎn)移到0.514 g·L-1安寐丹溶液中浸泡給藥2 h。各組每日放入T迷宮中訓(xùn)練，以此循環(huán)4天。

1.3.2 樣本采集

行為學(xué)檢測(cè)結(jié)束后，將斑馬魚(yú)放入冰水混合物中處死，于冰上迅速分離腦、肝臟等組織，用于組織切片樣本固定于4%多聚甲醛溶液放于4℃冰箱備用，用于分子生物分析樣本裝于滅菌EP管放于-80℃冰箱備用。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 24 h行為學(xué)檢測(cè)

將各組斑馬魚(yú)置于斑馬魚(yú)行為分析系統(tǒng)中，根據(jù)成魚(yú)游動(dòng)速率設(shè)置參數(shù)范圍為：靜止（＜5 mm·s-1，黑色）、小運(yùn)動(dòng)（5-25 mm·s-1，綠色）、大運(yùn)動(dòng)（＞25 mm·s-1，紅色），監(jiān)測(cè)24 h內(nèi)斑馬魚(yú)不同狀態(tài)運(yùn)動(dòng)計(jì)數(shù)、運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離。儀器將自動(dòng)追蹤斑馬魚(yú)的行為軌跡，檢測(cè)結(jié)束后自動(dòng)產(chǎn)生數(shù)據(jù)記錄與行為軌跡圖。

1.4.2 T迷宮實(shí)驗(yàn)

T型迷宮由水平等長(zhǎng)的左右臂和垂直起始臂組成，在起始臂的最前端設(shè)置一個(gè)可控的擋板隔開(kāi)，根據(jù)斑馬魚(yú)顏色偏好[16]，右臂標(biāo)記綠色，并在深水區(qū)放置孵化的豐年蝦食物設(shè)為營(yíng)養(yǎng)富集區(qū)（EC區(qū)），左臂標(biāo)記紅色，不放置食物。

實(shí)驗(yàn)測(cè)試包括3個(gè)階段：第1個(gè)階段是適應(yīng)階段。將所有斑馬魚(yú)都放入T迷宮中自由游動(dòng)，以適應(yīng)新環(huán)境，為期2天。第2階段是訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)。將每組斑馬魚(yú)分別放在T迷宮的起始區(qū)域，待魚(yú)適應(yīng)穩(wěn)定30 s后，輕輕抽出隔板，記錄斑馬魚(yú)在T迷宮中探索6 min的行動(dòng)軌跡，分別記錄第1次進(jìn)入EC區(qū)的時(shí)間以及在EC區(qū)停留的總時(shí)間，未進(jìn)入者記為0 min，超過(guò)6 min記為6 min。測(cè)試時(shí)間內(nèi)沒(méi)有進(jìn)入EC區(qū)的將被人為引導(dǎo)到EC區(qū)，并讓它在其中停留1 min。訓(xùn)練測(cè)試連續(xù)4天每天1次。第3階段是正式實(shí)驗(yàn)。在最后1次訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)的第2天進(jìn)行記憶能力正式實(shí)驗(yàn)，但不以食物作為獎(jiǎng)勵(lì)，以評(píng)估學(xué)習(xí)記憶情況。配合斑馬魚(yú)行為分析系統(tǒng)記錄并分析每尾斑馬魚(yú)的行為軌跡。

1.4.3 尼氏染色觀察中腦神經(jīng)元形態(tài)

全腦經(jīng)4%多聚甲醛固定后，用PBS沖洗組織表面，切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，PBS洗片3次，將切片放入1%尼氏染色液染色中浸染10 min。然后使用蒸餾水沖洗，用分色液分化10 s以清除背景。梯度乙醇脫水，再用二甲苯透明。最后中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下進(jìn)行拍照，觀察中腦神經(jīng)元及尼氏小體變化。

1.4.4 Real time-PCR檢測(cè)clocka、bmal1、晶體蛋白基因（Cry）1a、系列周期基因（Per）1a、per2mRNA表達(dá)水平

取斑馬魚(yú)腦組織，使用TRIzol提取總RNA溶于15 μL ddH2O并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，而后使用Real time-PCR反應(yīng)，以rpl13a為內(nèi)參測(cè)定時(shí)鐘基因clocka、bmal1、cry1a、per1a和per2的相對(duì)量。結(jié)果采用 2-ΔΔCT法表示各mRNA表達(dá)。引物設(shè)計(jì)均由武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司代合成，引物序列見(jiàn)表1。

1.4.5 定磷法測(cè)定肝臟中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活力

由于ATP酶可分解ATP生成二磷酸腺苷和無(wú)機(jī)磷，因此測(cè)定無(wú)機(jī)磷含量可間接判斷ATP酶的活性。首先，取斑馬魚(yú)肝臟，準(zhǔn)確稱取組織重量進(jìn)行勻漿，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定斑馬魚(yú)肝臟蛋白濃度。然后采用定磷法按照超微量Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、總ATP酶測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算公式：組織中ATPase活力（U·mg-1）=（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）（/標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.02 μmol·mL-1）×6*×7.8**/待測(cè)樣本蛋白濃度（mg·mL-1），注：6*：定義上為每小時(shí)，實(shí)際操作為10 min反應(yīng)，所以必須乘6；7.8**：反應(yīng)體系中7.8倍稀釋

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件處理所有采集數(shù)據(jù)，運(yùn)用Graphpad Prism 6.0繪制圖形。數(shù)據(jù)通過(guò)單因素方差分析，使用LSD、沃德-鄧肯法對(duì)組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)評(píng)估，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，當(dāng)結(jié)果P＜0.05時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 安寐丹對(duì)SD斑馬魚(yú)24 h自主活動(dòng)的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比，SD斑馬魚(yú)靜止?fàn)顟B(tài)總計(jì)數(shù)、持續(xù)時(shí)長(zhǎng)、覆蓋距離減少，大運(yùn)動(dòng)狀態(tài)總計(jì)數(shù)、持續(xù)時(shí)長(zhǎng)、覆蓋距離增加，24 h晝夜節(jié)律變化幅度特征降低，但未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與模型組相比，藥物干預(yù)能恢復(fù)模型晝夜節(jié)律特征，其中褪黑素、安寐丹高劑量可增加靜止?fàn)顟B(tài)計(jì)數(shù)（P＜0.05）、減少大運(yùn)動(dòng)狀態(tài)計(jì)數(shù)（P＜0.05），安寐丹低劑量增加靜止?fàn)顟B(tài)計(jì)數(shù)（P＜0.05）（圖1，表2）。

2.2 安寐丹對(duì)SD斑馬魚(yú)學(xué)習(xí)記憶能力的影響

除模型組外，各組隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)第1次進(jìn)入EC區(qū)時(shí)間均有不同程度的縮短。正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組第1次進(jìn)入EC區(qū)的時(shí)間顯著增加（P＜0.05），多在主臂徘徊，少數(shù)斑馬魚(yú)進(jìn)入EC區(qū)后又游出，累計(jì)停留時(shí)間減少。與模型組相比，褪黑素組斑馬魚(yú)第1次進(jìn)入EC區(qū)的時(shí)間顯著縮短（P＜0.05），EC區(qū)的停留時(shí)間顯著增加（P＜0.05），安寐丹組也出現(xiàn)改善效果，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2，表3、4）。

圖1 安寐丹對(duì)SD斑馬魚(yú)24 h自主活動(dòng)的影響（n=4）

表2 各組24 h不同狀態(tài)總計(jì)數(shù)（n=4）

圖2 正式實(shí)驗(yàn)各組T迷宮軌跡圖（n=5）

2.3 安寐丹對(duì)斑馬魚(yú)中腦神經(jīng)元的影響

尼氏染色是觀察神經(jīng)細(xì)胞改變的一種檢測(cè)方法，染色結(jié)果顯示，空白組斑馬魚(yú)中腦組織神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目正常，視蓋區(qū)細(xì)胞集中分布在中央灰質(zhì)層，尼氏小體多見(jiàn)，著色顯著，核相對(duì)完整。與空白組比較，模型組中腦神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞周圍裂隙增寬，尼氏小體明顯減少，著色淺。經(jīng)安寐丹干預(yù)后，SD斑馬魚(yú)神經(jīng)元胞體較為飽滿，丟失情況明顯好轉(zhuǎn)，尼氏小體部分可見(jiàn)，著色加深，且高劑量效果優(yōu)于低劑量組。褪黑素組同樣可見(jiàn)中腦神經(jīng)元數(shù)目增加，損傷減輕（圖3）。

2.4 安寐丹對(duì)腦組織clocka、bmal1、cry1a、per1a、per2 mRNA表達(dá)的影響

Real time-PCR結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組bmal1和cry1a基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.01）。與模型組比較，褪黑素及安寐丹處理后能降低bmal1和cry1amRNA相對(duì)表達(dá)量（P＜0.01）（表 5）。

表3 各組第一次進(jìn)入EC區(qū)時(shí)間（n=5）

表4 各組在EC區(qū)累計(jì)停留時(shí)間（n=5）

表5 各組斑馬魚(yú)腦組織clocka、bmal1、cry1a、per1a、per2 mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=3）

表6 各組斑馬魚(yú)肝臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、總ATP酶活力（n=6）

2.5 安寐丹對(duì)肝臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活力的影響

模型組肝臟Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活性均較正常斑馬魚(yú)減少，但差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。安寐丹干預(yù)后，高劑量組三種酶的活性均顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；低劑量組總ATP酶活力顯著增加（P＜0.05）。褪黑素組總ATP酶及Na+-K+-ATP酶活力顯著增加（P＜0.01）（表6）。

3 討論

睡眠剝奪是一種造成動(dòng)物失眠的有效方式[17]，咖啡因是制造SD模型的常用中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，通過(guò)結(jié)合神經(jīng)遞質(zhì)腺苷A2A受體抑制睡眠，增強(qiáng)覺(jué)醒。我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)咖啡因能有效誘導(dǎo)斑馬魚(yú)SD模型[18]，尤其是高劑量的咖啡因，可以通過(guò)影響海馬神經(jīng)元凋亡加重SD模型認(rèn)知損傷[19]。故本實(shí)驗(yàn)采用模式生物斑馬魚(yú)為研究對(duì)象，選取咖啡因誘導(dǎo)建立斑馬魚(yú)SD模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與空白組相比，模型組24 h行為學(xué)節(jié)律特征降低，靜止?fàn)顟B(tài)總計(jì)數(shù)、持續(xù)時(shí)長(zhǎng)、覆蓋距離均減少，運(yùn)動(dòng)狀態(tài)則顯著增加，并且以大運(yùn)動(dòng)為主；睡眠還可以幫助記憶信息存儲(chǔ)，SD則會(huì)影響大腦編碼神經(jīng)元整合信息，降低學(xué)習(xí)記憶水平[17]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SD模型學(xué)習(xí)記憶能力受損，隨著訓(xùn)練時(shí)間延長(zhǎng)第1次進(jìn)入EC區(qū)的時(shí)間未見(jiàn)縮短，與空白組相比，正式實(shí)驗(yàn)中進(jìn)入EC區(qū)時(shí)間顯著增加（P＜0.05），累計(jì)停留時(shí)間減少；與人腦不同，魚(yú)腦的形態(tài)是原始的，與視器有關(guān)的中腦占主要地位，通過(guò)發(fā)達(dá)的視網(wǎng)膜接收區(qū)來(lái)控制運(yùn)動(dòng)行為[20]。尼氏染色顯示SD模型中腦神經(jīng)細(xì)胞、尼氏小體數(shù)目減少，裂隙增寬，著色變淺，提示模型的行為學(xué)變化與神經(jīng)細(xì)胞受損密切相關(guān)。

晝夜節(jié)律的產(chǎn)生依賴于生物體自身的生物鐘系統(tǒng)以及鐘控基因組建的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中CLOCK和Bmal1形成異源二聚體誘導(dǎo)鐘控基因PER和CRY的轉(zhuǎn)錄，并隨著誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)移增多形成負(fù)反饋，構(gòu)成了節(jié)律震蕩最為重要的驅(qū)動(dòng)回路[21]。因此我們從鐘控基因入手繼續(xù)探討了造成模型行為學(xué)改變的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)SD模型的核心生物鐘基因clocka、bmal1（P＜0.01）、cry1a（P＜0.01）、per1a、per2mRNA表達(dá)水平較空白組升高，提示SD導(dǎo)致內(nèi)源性生物鐘紊亂，這可能是引起睡眠-覺(jué)醒周期異常的重要原因。

同時(shí)生物鐘參與了機(jī)體能量代謝的調(diào)控并依賴于細(xì)胞膜上的離子泵等限速酶[22]。離子泵即ATP酶，鈉鉀泵是細(xì)胞的Na+-K+-ATP酶，鈣鎂泵是細(xì)胞的Ca2+-Mg2+-ATP酶，它們都參與了細(xì)胞逆濃度梯度的主動(dòng)運(yùn)輸，且酶的活性與轉(zhuǎn)運(yùn)強(qiáng)度成正比。有研究發(fā)現(xiàn)SD令興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸釋放，通過(guò)谷氨酸離子型受體使鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量升高[23]。我們實(shí)驗(yàn)也證實(shí)SD使能量代謝Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶及總ATP酶活性降低，會(huì)減少物質(zhì)的交換和毒素的外排，從而破壞代謝穩(wěn)態(tài)。提示SD會(huì)干預(yù)生物鐘基因功能，打破肝細(xì)胞跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)平衡，影響能量代謝。

安寐丹是中醫(yī)治療失眠癥的代表方，針對(duì)上述SD導(dǎo)致的行為學(xué)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)改變結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與模型組相比，安寐丹能恢復(fù)模型晝夜節(jié)律特征，增加靜止?fàn)顟B(tài)計(jì)數(shù)（P＜0.05）、減少大運(yùn)動(dòng)狀態(tài)計(jì)數(shù)（P＜0.05）；縮短第1次進(jìn)入EC區(qū)的時(shí)間，增加EC區(qū)的停留時(shí)間；保護(hù)神經(jīng)元胞體結(jié)構(gòu)，增加尼氏小體數(shù)目；降低生物鐘基因clocka、bmal1（P＜0.01）、cry1a（P＜0.01）、per1a、per2mRNA 相對(duì)表達(dá)量；升高 Na+-K+-ATP酶（P＜0.05）、Ca2+-Mg2+-ATP酶（P＜0.01）及總ATP酶（P＜0.05）活力，并且結(jié)果呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性。提示安寐丹對(duì)生物鐘基因異常表達(dá)導(dǎo)致晝夜節(jié)律紊亂，影響能量代謝穩(wěn)態(tài)，造成神經(jīng)元損傷這一過(guò)程有顯著的拮抗作用。

另外褪黑激素作為一種潛在的同時(shí)參與調(diào)節(jié)睡眠覺(jué)醒和能量代謝的激素[24]，設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照藥，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)褪黑素可顯著改善SD斑馬魚(yú)的鎮(zhèn)靜和睡眠質(zhì)量，維持代謝平衡，與安寐丹低劑量組相比在降低bmal1（P＜0.05）、cry1a（P＜0.01）mRNA水平上更為顯著，但與安寐丹高劑量組相比未見(jiàn)明顯差異。

綜上所述，安寐丹可以恢復(fù)斑馬魚(yú)睡眠剝奪模型晝夜節(jié)律，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，保護(hù)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，其機(jī)制可能與干預(yù)bmal1、cry1a等生物鐘基因，提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-Mg2+-ATP酶、總ATP酶等能量代謝酶活性相關(guān)。但本實(shí)驗(yàn)并未對(duì)生物鐘干預(yù)能量代謝的關(guān)鍵途徑進(jìn)行深一步的探討，后期將繼續(xù)開(kāi)展晝夜節(jié)律與能量代謝的關(guān)聯(lián)性分析和機(jī)制研究。