枳實通降顆粒通過干預(yù)MK2磷酸化調(diào)控c-kit表達防治術(shù)后炎性腸梗阻的機制研究＊

莫 黎，李 倩，周平蘭，王華帥，李 瑩，黃 麗，何永恒

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 長沙 410005；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院 長沙 410208；3.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院 長沙 410006）

術(shù)后炎性腸梗阻（Postoperative inflammatory ileus，POI）是指腹部術(shù)后早期胃腸道收縮功能恢復(fù)前的一個特殊時期，以腸麻痹和腸壁水腫滲出粘連為特點，又稱為術(shù)后腸梗阻或術(shù)后早期炎性腸梗阻。POI被認(rèn)為是腹部，尤其是腸道手術(shù)后無法避免的并發(fā)癥，其持續(xù)時間的長短直接影響到術(shù)后患者的康復(fù)，但目前臨床仍缺乏高效安全的治療手段和藥物[1]。研究證實，神經(jīng)機制與炎癥機制是導(dǎo)致POI的發(fā)病的兩種主要機制，二者相互影響，但炎癥反應(yīng)在其中起著關(guān)鍵性作用[2]。p38MAPK（Mitogen-activated protein kinase）信號通路是炎癥反應(yīng)發(fā)生的經(jīng)典通路，其中MK2又是該通路中一個關(guān)鍵性的下游蛋白激酶，具有干預(yù)細(xì)胞因子產(chǎn)生、轉(zhuǎn)錄因子活化及影響炎癥受體表達等作用，是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（ICC）作為維持胃腸蠕動功能的關(guān)鍵性細(xì)胞，在各種胃腸蠕動功能障礙性疾病的發(fā)病中起著關(guān)鍵性作用，也是許多藥物的靶點所在[3]。研究證實，手術(shù)操作等可損傷腸壁間神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、激活炎癥啟動細(xì)胞，激發(fā)瀑布式炎癥反應(yīng)，進而導(dǎo)致腸壁間的ICC受損，腸壁神經(jīng)-平滑肌網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)癱瘓，平滑肌起搏抑制，最終導(dǎo)致POI的發(fā)生[4]。

前期多中心臨床研究證實[5]，枳實通降顆粒對開腹及腹腔鏡結(jié)直腸腫瘤術(shù)后POI的恢復(fù)有顯著的促進作用，且POI的再發(fā)率、肺部感染等并發(fā)癥的發(fā)生率均低于常規(guī)治療組。其后的基礎(chǔ)研究也顯示：枳實通降顆粒具有較強的抗炎作用，作用強度與藥物劑量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)，但作用機制尚需進一步明確[6]。本研究繼續(xù)以術(shù)后炎性腸梗阻模型大鼠為研究對象，觀察枳實通降顆粒對模型大鼠小腸腸壁組織MK2磷酸化、炎癥反應(yīng)及c-kit表達的影響，探討其防治POI的可能機制，對該藥的深入開發(fā)和中醫(yī)藥在圍手術(shù)期快速康復(fù)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

專利方枳實通降顆粒[7]由枳實10 g、烏藥10 g、大腹皮10 g、廣木香 10 g、黃柏10 g、澤瀉12 g、三七6 g、西洋參6 g、川牛膝12 g、甘草6 g組成。實驗所用傳統(tǒng)中藥飲片均由湖南新匯制藥廠生產(chǎn)，由湖南省中醫(yī)院（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院）門診中藥房提供，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科周平蘭教授鑒定，所有藥材均達到合格標(biāo)準(zhǔn)。采用傳統(tǒng)方法水煎濃縮后，制備成含藥濃度為0.34 g·mL-1的藥液，冷藏備用。陽性對照組采用琥珀酸普蘆卡必利片（Janssen Cilag S.p.A，2 mg×7片/盒），批號:JGL6E00，以適量純凈水溶解制備成混懸液備用，含藥濃度為0.036 mg·mL-1。

1.2 動物

SPF級SD大鼠84只 （合格證編號：110727191100 1708），鼠齡6周，雌雄各半，質(zhì)量180-220 g。采購自斯萊克景達實驗動物有限公司（湖南），許可證號：SCXK（湘）2016-0002，適應(yīng)性喂養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心實驗室，許可證號：SYXK（湘）2019-0009，1周后開始實驗。本實驗已經(jīng)該校實驗動物理論委員會批準(zhǔn)（LL2019092005）。

1.3 試劑

腫瘤壞死因子（TNF-α）、白介素-6（IL-6）及白介素-8（IL-8）試劑盒（上海晶天生物，E20200103012，E20200103011，E20200103010）、引物（上海生工，221020117）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國 Promega，A3500）、PCR 試 劑盒（美 國 Promega，A6001）、TRIzol（美 國Invitrogen，15596018）；G蛋白磁珠（美國Cell Signaling公司，9006S)；蛋白質(zhì)標(biāo)志物（美國Thermo公司，26634)；c-kit兔抗體（美國 ABclonal公司，A0357）；β-Action兔抗體、羊抗兔IgG抗體（武漢貝茵萊生物科技有限公司，PAB36265 ，SAB43714）。

1.4 儀器

電泳儀、Real-time PCR儀（美國Bio-Rad）；酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃）；全自動化學(xué)發(fā)光分析儀（上海天能）。

1.5 實驗方法

1.5.1 動物分組及造模

84只SD大鼠按照隨機數(shù)字表法隨機分為7組：空白組、假手術(shù)組、POI模型組、中藥（枳實通降顆粒）低、中、高劑量組和普蘆卡必利組，每組各12只，雌雄各半，分別于術(shù)后24 h取材。所有大鼠于術(shù)前禁食24 h，禁水12 h，術(shù)后禁食不禁水。根據(jù)前期實驗優(yōu)化的造模方法[8]：3%戊巴比妥鈉（3 mL·kg-1體質(zhì)量腹腔注射）麻醉大鼠并固定，盡量按照無菌手術(shù)操作要求進行手術(shù)及取樣：開腹，找到并以4號絲線結(jié)扎切除部分盲腸，然后用兩根鹽水棉簽輕輕夾住腸管，由近心端小腸起始段向盲腸端輕柔摩擦腸壁，僅處理1次后即回納腸管并關(guān)腹，手術(shù)時間控制在15 min左右；假手術(shù)組：僅單純切開腹腔，濕鹽水紗布覆蓋切口后保持與手術(shù)組相同時間，不做其他任何操作，然后同法關(guān)腹?？瞻捉M不做處理。

1.5.2 給藥方法

根據(jù)前期研究篩選的最優(yōu)給藥方法[6]，于造模術(shù)后6 h，所有大鼠按5 mL·kg-1體重的劑量標(biāo)準(zhǔn)灌胃給藥1次。給藥劑量根據(jù)等效劑量計算公式進行折算后確定，中藥低、中、高劑量組分別按照4.2 g·kg-1、8.3 g·kg-1、16.6 g·kg-1體重的標(biāo)準(zhǔn)給予枳實通降顆粒濃縮藥液，普蘆卡必利組按0.18 g·kg-1體重標(biāo)準(zhǔn)予混懸液，空白組、假手術(shù)組、模型組則給予同體積生理鹽水。

1.5.3 檢測腸道推進率及胃內(nèi)容物殘留率

術(shù)后23.5 h給予0.15 mL墨汁灌胃，30 min后麻醉大鼠，重新打開腹腔，夾閉胃的兩端及小腸末端，自然狀態(tài)下分別測量已染色部分及整個幽門以下腸管的長度，腸管黑染長度/全腸道長度×100%=腸道推進率（%）。完整取出胃體，分別測量全胃及胃內(nèi)容物的質(zhì)量，并按照（全胃質(zhì)量-洗凈后胃體質(zhì)量）/全胃質(zhì)量×100%的公式計算胃內(nèi)容物殘留率（%）。

表1 MK2及c-kit mRNA實時熒光定量PCR檢測引物設(shè)計

表2 各組大鼠腸道推進率、胃內(nèi)容物殘留率比較（，%，n=12）

表2 各組大鼠腸道推進率、胃內(nèi)容物殘留率比較（，%，n=12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

胃內(nèi)容物殘留率26.13±8.30 33.40±5.27 82.46±4.64**63.61±6.03##55.58±6.27##52.91±3.82##52.95±6.96##組別空白對照組假手術(shù)組模型對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組普蘆卡必利組劑量---4.2 g·kg-1 8.3 g·kg-1 16.6 g·kg-1 0.18 mg·kg-1腸道推進率26.27±3.03 20.43±3.18 1.19±1.2**9.13±3.00##14.29±1.92##15.80±2.03##15.02±2.05##

1.5.4 ELISA法檢測小腸組織中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α的含量

術(shù)后24 h，分別取大鼠靠近幽門端1段長2 cm的小腸腸管，-80℃冰箱保存，參照試劑盒要求進行裂解后勻漿、離心，取上清液進行檢測。

1.5.5 免疫組化觀察小腸組織的病理學(xué)改變及c-kit陽性細(xì)胞表達情況

術(shù)后24 h，取大鼠近幽門端長約2 cm的小腸一段，將標(biāo)本進行切片及DAB染色，隨機挑選3張切片進行分析，每張切片隨機5個互不重疊視野在顯微鏡下（×200）觀察檢測，進行圖像采集和分析，以胞膜出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒視為陽性表達，測定c-kit陽性細(xì)胞表達的平均光密度[9]。

1.5.6 Western blot檢測小腸組織中MK2、p-MK2、ckit蛋白表達水平

術(shù)后24 h，取大鼠近幽門端長約2 cm的小腸組織，按照下列步驟進行檢驗：剪碎組織后加入適量裂解液，勻漿至完全裂解，離心后取上清液檢測蛋白質(zhì)含量。以定量結(jié)果為參考，取適量蛋白液與緩沖液混合，再次離心后依次加入一抗、二抗，轉(zhuǎn)膜電泳，全自動化學(xué)發(fā)光分析儀檢測分析，相關(guān)條帶的灰度值采用TANONGIS軟件讀取，對比其蛋白相對表達量。

1.5.7 RT-PCR檢測小腸組織中MK2、c-kit mRNA的相對表達水平

術(shù)后24 h，取大鼠近幽門端2段長約2 cm的小腸組織，首先從NCBI中下載基因序列，采用Primer 5.0軟件設(shè)計引物,見表1。取組織20-50 mg，采用TRIzol法提取總RNA，即每個樣本加入600 μL TRIzol，反復(fù)進行吹打、室溫靜置、離心等處理后，提取小腸組織中總的RNA，然后加入含有上下游引物、熒光染料的反應(yīng)體系中，合成cDNA，接著配置反應(yīng)體系、按照94℃4 min、94℃ 40 sec，60℃ 30 sec，×50 cycle完成擴增程序后行Real-time PCR檢測，得到目的蛋白的CT值后，再以2-△△Ct法計算其mRNA的相對表達水平（RQ值）。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0軟件進行分析。計量資料以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性，多組比較則采用單因素方差分析，否則采用Kruskal-Wallis H檢驗。以α=0.05的標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 比較各組大鼠腸道推進率、胃內(nèi)容物殘留率

與空白組及假手術(shù)組比較，模型組腸道推進率明顯偏低，胃內(nèi)容物殘留率明顯偏高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥各劑量組及普蘆卡必利組能明顯增加腸道推進率及降低胃內(nèi)容物殘留率（P＜0.01），以枳實通降顆粒高劑量組療效最好，但與中劑量組和普蘆卡必利組比較，差異并無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 比較各組大鼠小腸組織中炎癥因子IL-6、IL-8、TNF-α的含量

模型組小腸組織中IL-6、IL-8、TNF-α含量均明顯高于空白組和假手術(shù)組（P＜0.01）；與模型組比較，藥物治療組炎癥因子水平均明顯低于模型組（P＜0.01），以中藥高劑量組效果最好，但與中劑量組及普蘆卡必利組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），優(yōu)于中藥低劑量組（P＜0.05）。見表3。

表3 各組大鼠小腸組織中炎癥因子含量比較（，pg·mg-1，n=12）

表3 各組大鼠小腸組織中炎癥因子含量比較（，pg·mg-1，n=12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

組別空白對照組假手術(shù)組模型對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組普蘆卡必利組TNF-α 64.89±4.54 86.36±3.17 307.45±34.53**211.46±15.75##133.91±21.33##116.26±12.42##141.49±28.54##劑量---4.2 g·kg-1 8.3 g·kg-1 16.6 g·kg-1 0.18 mg·kg-1 IL-6 33.08±4.06 41.54±8.88 120.66±15.96**89.81±4.71##64.93±10.29##57.05±9.46##67.78±11.28##IL-8 79.04±15.34 90.40±12.47 295.12±21.58**191.45±13.98##125.67±18.01##114.15±11.27##138.31±23.18##

圖1 各組大鼠小腸病理形態(tài)學(xué)改變及c-kit陽性細(xì)胞表達情況（×200）

表4 各組大鼠小腸組織中c-kit蛋白表達[WB（相對灰度）、免疫組化（平均光密度）]及m-RNA表達水平比較（，n=12）

表4 各組大鼠小腸組織中c-kit蛋白表達[WB（相對灰度）、免疫組化（平均光密度）]及m-RNA表達水平比較（，n=12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白對照組假手術(shù)組模型對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組普蘆卡必利組平均光密度0.37±0.05 0.32±0.04 0.16±0.02**0.22±0.03##0.29±0.03##0.31±0.03##0.27±0.02##劑量---4.2 g·kg-1 8.3 g·kg-1 16.6 g·kg-1 0.18 mg·kg-1相對灰度1.08±0.18 1.02±0.10 0.30±0.10**0.52±0.14#0.80±0.16##0.89±0.22##0.78±0.14##c-kit mRNA 1.14±0.21 1.05±0.13 0.31±0.09**0.50±0.15#0.82±0.14##0.89±0.17##0.79±0.10##

2.3 各組大鼠小腸組織病理形態(tài)改變及c-kit陽性細(xì)胞表達情況比較

與空白組及假手術(shù)組比較，模型組小腸組織可見明顯水腫、炎癥細(xì)胞浸潤及組織壞死脫落，c-kit陽性細(xì)胞表達水平明顯低于其他各組（P＜0.01）；藥物治療組病理組織結(jié)構(gòu)改變較輕，c-kit陽性細(xì)胞（P＜0.01），中藥高劑量組效果最好，但與中劑量組及普蘆卡必利組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1、表3。

2.4 比較各組大鼠小腸組織中MK2、p-MK2、c-kit蛋白及c-kit、MK2 mRNA的表達水平

與空白組及假手術(shù)組比較，模型組小腸組織中ckit、p-MK2蛋白及c-kit mRNA的表達水平明顯低于其他各組（P＜0.01）；藥物治療組c-kit、p-MK2蛋白的表達明顯高于模型組（P＜0.01），以中藥高劑量組最低，但與中劑量組及普蘆卡必利組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組MK2蛋白及mRNA的表達水平無明顯差異（P＞0.05）。見表4、5，圖2。

表5 各組大鼠小腸組織中MK2、p-MK2蛋白及MK2 mRNA表達水平比較（，n=12）

表5 各組大鼠小腸組織中MK2、p-MK2蛋白及MK2 mRNA表達水平比較（，n=12）

注：與空白組及假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別空白對照組假手術(shù)組模型對照組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組普蘆卡必利組MK2 mRNA 1.04±0.24 1.04±0.08 1.09±0.35 0.94±0.17 0.93±0.14 0.92±0.25 1.05±0.31劑量---4.2 g·kg-1 8.3 g·kg-1 16.6 g·kg-1 0.18 mg·kg-1 MK2蛋白1.0±0.01 0.99±0.05 0.99±0.09 0.99±0.08 1.0±0.06 1.02±0.08 1.0±0.09 p-MK2蛋白1.0±0.01 1.28±0.11 3.41±0.28**1.97±0.43##1.68±0.40##1.40±0.15##2.01±0.44##p-MK2/MK2 1.0±0.02 1.30±0.13 3.45±0.34**2.0±0.34##1.97±0.33##1.39±0.24##2.05±0.58##

圖2 各組大鼠小腸組織中MK2、p-MK2、c-kit蛋白表達條帶圖

3 討論

炎癥是導(dǎo)致POI的主要原因，炎癥反應(yīng)在手術(shù)后3-4 h開始逐漸明顯，并于24 h左右達到最高峰，隨后逐步下降。研究證實，術(shù)后早期若采取藥物等措施抑制炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，可有效的促進POI的恢復(fù)及預(yù)防其相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生[10]。ICC是一種連接于腸壁神經(jīng)末梢和平滑肌細(xì)胞之間的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，可產(chǎn)生慢波電活動起搏腸壁平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生收縮，是保障腸道蠕動功能的關(guān)鍵所在炎癥等各種病理損害造成的胃腸功能障礙均與ICC細(xì)胞缺失/異常以及網(wǎng)絡(luò)受損等密切相關(guān)[4]，而胃腸蠕動功能障礙正是POI的主要特征之一，二者之間存在著密切的聯(lián)系。c-kit是ICC的特異性標(biāo)志物,觀察c-kit在胃腸道的分布和表達，可準(zhǔn)確的評估ICC細(xì)胞的活性及受損狀態(tài)[11]。MK2作為調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子[12-15]，可因腹腔手術(shù)操作刺激而磷酸化，進而激活腸壁漿膜及平滑肌肌間神經(jīng)叢處的常駐巨噬細(xì)胞[16]，誘發(fā)IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子和細(xì)胞趨化因子的釋放，誘導(dǎo)大量白細(xì)胞聚集并浸潤于腸壁組織間，導(dǎo)致腸壁水腫、滲出、粘連，并使原癌基因c-kit表達受到抑制而無法促進腸壁ICC的分化成熟，最終導(dǎo)致腸壁平滑肌細(xì)胞電生理活動被抑制，起搏功能喪失，腸壁平滑肌麻痹，形成POI[17]。

枳實通降顆粒由經(jīng)典方五磨飲子及三妙散加減而成，藥理學(xué)研究證實，其所含有效成分具有較好的抗炎、抗感染、調(diào)節(jié)免疫、促進平滑肌收縮等作用[18-19]。方中枳實、廣木香、烏藥及大腹皮可促進胃腸道平滑肌蠕動；西洋參可調(diào)節(jié)機體免疫力，預(yù)防感染等作用；三七提取物能促進血液循環(huán)，保護小鼠缺血再灌注導(dǎo)致的腸道粘膜損害，促進腸道蠕動功能障礙恢復(fù)；黃柏具有較強的抗炎及抗感染作用，對多種致病細(xì)菌有較強的抑制作用；牛膝不僅可抗炎、鎮(zhèn)痛，還能促進腸管收縮；澤瀉具有較強的的利尿和調(diào)節(jié)免疫力的作用；甘草具有解毒、抗炎抑菌、抗病毒及調(diào)節(jié)免疫作用。全方行氣活血、益氣養(yǎng)血、清熱利濕，行而不峻，補而不膩，清利而不傷津液，具有較強的抗炎、促進血液循環(huán)、增強免疫力和促進胃腸蠕動功能，切合于腹部術(shù)后本虛標(biāo)實，氣血虧虛，瘀血濕熱內(nèi)停的病機特點。

本實驗研究結(jié)果證實：枳實通降顆粒能有效的抑制POI大鼠模型腸壁組織中MK2磷酸化，降低IL-6、IL-8、TNF-α等炎癥因子的水平，促進術(shù)后胃排空及腸道蠕動，其作用強度與用藥時間和劑量存在一定的正相關(guān)性，證實該方具有較強的抗炎和促進術(shù)后胃腸功能恢復(fù)的作用，這種作用主要是通過抑制MK2磷酸化來實現(xiàn)的。枳實通降顆粒各劑量組c-kit的表達明顯高于模型組，從而提示其具有保護ICC細(xì)胞的功能?；谝陨涎芯勘砻鳎鸿讓嵧ń殿w粒可通過抑制MK2磷酸化，有效的抑制因手術(shù)等原因?qū)е碌哪c壁炎癥反應(yīng)，調(diào)控c-kit的表達水平，保護和恢復(fù)ICC細(xì)胞功能，從而達到防治術(shù)后炎性腸梗阻的目的。本次研究雖然從MK2，p-MK2及c-kit的表達作為研究的切入點論證了其作用機制，但中藥復(fù)方的成分及作用機制非常復(fù)雜，是多靶點、多通路作用，其關(guān)鍵性啟動點和各條通路之間的是否具有相互作用仍未明了，需待進一步的研究。