仲景名方白頭翁湯的指紋圖譜及功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

丘海芯，甘金月，王寶林，楊世林，許瓊明，覃喜軍，譚小青，高紅偉, 3，劉振杰

仲景名方白頭翁湯的指紋圖譜及功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

丘海芯1，甘金月1，王寶林1，楊世林1，許瓊明1，覃喜軍1，譚小青2，高紅偉1, 3*，劉振杰1*

1. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530299 2. 廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022 3. 廣西優(yōu)勢(shì)中成藥與民族藥開發(fā)工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530299

研究仲景名方白頭翁湯的化學(xué)成分，建立HPLC指紋圖譜，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)進(jìn)行機(jī)制預(yù)測(cè)分析，為白頭翁湯質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。采用超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-Q-TOF-MS/MS）對(duì)白頭翁湯的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，建立HPLC指紋圖譜，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，匹配共有峰并進(jìn)行色譜峰歸屬?；谫|(zhì)譜鑒定和指紋圖譜篩選白頭翁湯的有效成分，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)建立了“組分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步佐證白頭翁湯有效成分選擇的合理性。通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)匹配、元素組成和碎片結(jié)構(gòu)分析，共鑒定出21種化合物；在建立15批白頭翁湯樣品的指紋圖譜中，標(biāo)定16個(gè)共有峰，通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出秦皮甲素（峰2）、秦皮乙素（峰5）、秦皮素（峰7）、白頭翁皂苷B4（峰15）、白頭翁皂苷B5（峰16）、黃柏堿（峰3）、黃連堿（峰11）、小檗堿（峰13）、巴馬?。ǚ?4）9個(gè)色譜峰，各批次樣品相似度均＞0.90，且16個(gè)共有峰均能歸屬到白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味藥材；通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)所指認(rèn)的9個(gè)藥效成分進(jìn)行機(jī)制預(yù)測(cè)，富集的通路中含癌癥通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路以及缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)-1（hypoxia signaling-1，HIF-1）信號(hào)通路等，這些通路可能與白頭翁湯治療疾病的作用相關(guān)。UPLC-Q-TOF-MS/MS法能快速鑒定白頭翁湯的成分，建立的白頭翁湯指紋圖譜分析方法簡(jiǎn)便可行，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)白頭翁湯9個(gè)成分與白頭翁湯功效屬性密切相關(guān)，為白頭翁湯的質(zhì)量控制提供參考，同時(shí)也為白頭翁湯藥效關(guān)聯(lián)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及作用機(jī)制的探索奠定基礎(chǔ)。

白頭翁湯；超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；高效液相色譜；指紋圖譜；相似度評(píng)價(jià)；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；秦皮甲素；秦皮乙素；秦皮素；白頭翁皂苷B4；白頭翁皂苷B5；黃柏堿；黃連堿；小檗堿；巴馬汀；白頭翁；黃連；黃柏；秦皮

白頭翁湯（Baitouweng Decoction）源于張仲景的《傷寒論》[1]，由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味藥組成，具有清熱解毒、涼血止痢的功效[2]，為治濕熱痢疾的首選方劑。近年來(lái)，對(duì)這一傳統(tǒng)方劑的化學(xué)成分和藥理作用的深入研究證明其具有顯著的藥理活性[3]，現(xiàn)已向臨床各科擴(kuò)展[4]，且在獸醫(yī)臨床也有廣泛應(yīng)用。鑒于中藥復(fù)方具有多成分-多靶點(diǎn)-多通路的特點(diǎn)，超高效液相色譜-三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥及中藥復(fù)方化學(xué)成分的快速分析，同時(shí)指紋圖譜技術(shù)能夠更加全面地反映藥材的內(nèi)在整體化學(xué)成分類型，并且可用于評(píng)價(jià)中藥材質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性，為中藥及中藥復(fù)方質(zhì)量控制提供有效手段[5-6]。

化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)可以將多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合、降維和分類分析，對(duì)指紋圖譜中的信息進(jìn)行表達(dá)、識(shí)別和處理，二者結(jié)合可以更加系統(tǒng)、全面、客觀地評(píng)價(jià)中藥的質(zhì)量[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)可快速發(fā)現(xiàn)中藥主要作用通路及作用靶點(diǎn)，對(duì)于預(yù)測(cè)中藥成分的潛在作用靶點(diǎn)具有重要意義[8-10]。目前尚未見有關(guān)白頭翁湯指紋圖譜的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)白頭翁湯進(jìn)行化學(xué)成分定性分析，再建立白頭翁湯的HPLC指紋圖譜，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，初步篩選出差異標(biāo)志物，結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)尋找潛在作用靶點(diǎn)和作用通路，為白頭翁湯質(zhì)量控制提供參考，也為白頭翁湯藥效關(guān)聯(lián)物質(zhì)基礎(chǔ)的研究及作用機(jī)制的探索奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Sciex X500R Q-TOF液質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Sciex公司，配有ESI源和Sciex OS數(shù)據(jù)處理軟件；Waters Acquity Arc超高效液相色譜儀，四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、2998PDA檢測(cè)器、Waters工作站，沃特世科技（上海）有限公司；SB-800DTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；SQP型十萬(wàn)分之一電子分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料

1.2.1 試劑 水為屈臣氏飲用水，甲醇為分析級(jí)，乙腈為色譜級(jí)。對(duì)照品白頭翁皂苷B4（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、白頭翁皂苷B5（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、秦皮甲素（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、秦皮乙素（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、秦皮素（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、黃柏堿（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、鹽酸黃連堿（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、鹽酸小檗堿（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、鹽酸巴馬汀（HPLC質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），上述試劑均購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司。

1.2.2 藥材 白頭翁為毛茛科白頭翁屬植物白頭翁(Bge.) Regel的干燥根；秦皮為木犀科白蠟樹屬植物白蠟樹Roxb.的干燥枝皮或干皮；黃柏為蕓香科黃檗屬植物黃皮樹Schneid.的干燥樹皮；黃連為毛茛科黃連屬植物黃連Franch.的干燥根莖[2]。經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)許瓊明教授鑒定，所購(gòu)買的飲片均為正品。將單味藥各批次飲片隨機(jī)取樣組合，得到15批白頭翁湯樣品，編號(hào)為S1～S15，藥材產(chǎn)地信息見表1。

表1 藥材產(chǎn)地信息

Table 1 Origin information of medicinal herbs

樣品編號(hào)黃連秦皮白頭翁黃柏 S1四川（批次20191201）陜西（批次180901）秦皇島（批次2021042804）四川（批次20201002） S2四川（批次20201201）陜西（批次20200501）大連（批次2021042805）廣西（批次20200701） S3四川（批次20200603）陜西（批次180901）秦皇島（批次2021042804）廣西（批次20200701） S4四川（批次20201201）陜西（批次20200501）鞍山（批次2021042802）廣西（批次20200701） S5四川（批次20200603）陜西（批次20180401）大連（批次2021042805）四川（批次200901） S6四川（批次20200603）陜西（批次20180401）鞍山（批次2021042802）四川（批次200901） S7四川（批次20200603）陜西（批次20200501）保定（批次2021050401）四川（批次20201002） S8四川（批次D21010B4）陜西（批次20180401）秦皇島（批次2021042804）四川（批次200401） S9四川（批次20201001）陜西（批次180901）大連（批次2021042805）廣西（批次20200701） S10四川（批次D21010B4）陜西（批次20180401）保定（批次2021050401）四川（批次200401） S11四川（批次20201001）陜西（批次180901）鞍山（批次2021042802）四川（批次20201002） S12四川（批次201907299）陜西（批次20200501）保定（批次2021050401）四川（批次200901） S13四川（批次20191201）陜西（批次180901）秦皇島（批次2021042804）四川（批次20201002） S14四川（批次201907299）陜西（批次20180401）保定（批次2021050401）四川（批次200401） S15四川（批次20191201）陜西（批次20180401）大連（批次2021042805）四川（批次200401）

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 白頭翁湯樣品溶液制備 張仲景《傷寒論》中記載白頭翁湯的處方為白頭翁15 g、黃柏12 g、黃連6 g、秦皮12 g，本實(shí)驗(yàn)按照原方比例進(jìn)行煎煮，即白頭翁-黃柏-黃連-秦皮5∶4∶2∶4。將4種單味藥隨機(jī)組合成的S1～S15樣品按比例稱取，加入10倍量的水，煎煮2次，每次煎煮1 h，過(guò)濾后合并濾液，濾液備用。取濾液過(guò)0.22 μm濾膜，即得到白頭翁湯供試品溶液。

2.1.2 單味藥樣品溶液制備 將白頭翁湯處方中的白頭翁、黃柏、黃連、秦皮的4種單味飲片按“2.2.1”項(xiàng)的煎煮方法制備溶液，即得到單味藥樣品供試品溶液。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取9個(gè)對(duì)照品，加甲醇定容至10 mL量瓶中，得到含秦皮甲素0.13 mg/mL、秦皮乙素0.63 mg/mL、秦皮素0.41 mg/mL、白頭翁皂苷B4 0.11 mg/mL、白頭翁皂苷B5 0.06 mg/mL、黃柏堿0.9 mg/mL、鹽酸黃連堿0.62 mg/mL、鹽酸小檗堿1.63 mg/mL、鹽酸巴馬汀0.16 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS/MS定性分析

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil Gold C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫：0～1 min，5%乙腈；1～5 min，5%～27%乙腈；5～15 min，27%～70%乙腈；15～18 min，70%～95%乙腈；18～20 min，95%～5%乙腈；體積流量0.4 mL/min；柱溫40.0 ℃；進(jìn)樣量3 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI），正、負(fù)離子模式，掃描范圍/100～2000；碰撞能量35 eV；離子源溫度為600 ℃；噴霧電壓5500 V。通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜信息確定精確相對(duì)分子質(zhì)量，二級(jí)質(zhì)譜獲得裂解信息，搜索數(shù)據(jù)庫(kù)和查閱文獻(xiàn)推測(cè)化合物的結(jié)構(gòu)式信息。

2.2.3 化合物質(zhì)譜分析 采用UPLC-Q-TOF-MS/ MS對(duì)白頭翁湯進(jìn)行分析，選擇正、負(fù)離子模式分別對(duì)供試品溶液進(jìn)行掃描，總離子流圖（total ions current，TIC）見圖1。通過(guò)SCIX OS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)查找質(zhì)譜響應(yīng)較高的成分的精確相對(duì)分子質(zhì)量，與天然產(chǎn)物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（natural procducts HR- MSMS 2.0）進(jìn)行比對(duì)，獲得候選化合物，然后通過(guò)二級(jí)碎片離子及母離子可能的斷裂規(guī)律來(lái)確定其結(jié)構(gòu)，最后通過(guò)市售對(duì)照品保留時(shí)間的對(duì)比，對(duì)部分成分的結(jié)果作進(jìn)一步確證。結(jié)果顯示，從白頭翁湯中鑒定出21個(gè)化學(xué)成分，各化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜信息見表2。通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)白頭翁湯的化學(xué)成分進(jìn)行了初步鑒定，發(fā)現(xiàn)白頭翁湯中所含成分可分為生物堿類、香豆素類、皂苷類和檸檬苦素類4大類成分，與文獻(xiàn)研究結(jié)果相一致[11]。為反映白頭翁湯內(nèi)在整體化學(xué)成分情況，實(shí)驗(yàn)將結(jié)合指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)白頭翁湯進(jìn)一步研究，以期了解其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 白頭翁湯的正離子、負(fù)離子模式的TIC圖

2.3 白頭翁湯指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

2.3.1 色譜條件 采用Ultimate?XB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水溶液，梯度洗脫：0～2 min，10%甲醇；2～75 min，10%～48%甲醇；75～90 min，48%～73%甲醇；90～95 min，73%甲醇；95～100 min，73%～75%甲醇；柱溫30 ℃；體積流量0.6 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2.3.2 參照峰的選擇 在特征圖譜中，小檗堿含量較高，色譜峰較穩(wěn)定，故選擇小檗堿的色譜峰（13）作為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取編號(hào)為S1的白頭翁湯供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄譜圖，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取編號(hào)為S1的白頭翁湯樣品，平行制備6份白頭翁湯供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件，測(cè)定特征圖譜，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取編號(hào)為S1的白頭翁湯供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件，將樣品置于室溫下，于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，結(jié)果顯示各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6 指紋圖譜建立及相似度評(píng)價(jià) 按“2.1.1”項(xiàng)下方法，分別制備S1～S15白頭翁湯供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012年版）軟件，設(shè)定S1樣品的色譜圖為參照?qǐng)D譜，利用多點(diǎn)校正方式，時(shí)間窗寬度為0.1 min，平均數(shù)法生成指紋圖譜和對(duì)照指紋圖譜。15批白頭翁湯樣品的指紋圖譜（圖2），并進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，S1～S15的相似度結(jié)果分別為0.980、0.973、0.941、0.952、0.956、0.987、0.983、0.987、0.930、0.935、0.981、0.947、0.983、0.933、0.997，結(jié)果顯示相似度均＞0.90。

根據(jù)特征圖譜分析，將白頭翁湯與各單味藥樣品HPLC譜圖進(jìn)行比對(duì)，確定出峰情況良好、無(wú)干擾的色譜峰為各藥味特征峰（圖3）。15批白頭翁湯指紋圖譜共檢測(cè)到16個(gè)共有峰，經(jīng)過(guò)與混合對(duì)照品溶液圖譜的比對(duì)（圖4），指認(rèn)了9個(gè)色譜峰，分別為秦皮甲素（峰2）、黃柏堿（峰3）、秦皮乙素（峰5）、秦皮素（峰7）、黃連堿（峰11）、小檗堿（峰13）、巴馬汀（峰14）、白頭翁皂苷B4（峰15）、白頭翁皂苷B5（峰16）。結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS/M法鑒定出白頭翁湯的21種化合物（表2），其中9種成分均能在指紋圖譜上明確指認(rèn)，實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步采用化學(xué)識(shí)別模式對(duì)指紋圖譜中共有峰在樣品中的差異進(jìn)行分析，并圍繞明確指認(rèn)的9個(gè)成分進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析。

表2 白頭翁湯中化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定結(jié)果

Table 2 Identification result of chemical components in Baitouweng Decoction by UPLC-Q-TOF-MS/MS

峰號(hào)tR/min電離模式理論值(m/z)實(shí)測(cè)值(m/z)誤差/(×10?6)MS/MS二級(jí)碎片分子式鑒定化合物 10.533[M＋H]+370.301 1370.302 02.4121.065 1, 180.139 3C16H18O10秦皮苷 20.721[M－H]?191.020 0191.021 05.2191.173 0, 111.855 0C15H10O7檸檬酸 32.260[M－H]?339.074 9339.075 62.1177.024 9C15H16O9秦皮甲素* 42.996[M＋H]+179.034 6179.034 0?3.4123.044 2C9H6O4秦皮乙素* 53.404[M＋H]+342.171 8342.170 3?4.3192.101 4C20H24NO4黃柏堿* 63.813[M＋H]+209.043 4209.044 65.7166.026 6, 209.044 6C10H8O5秦皮素* 74.345[M＋H]+342.170 5342.170 1?1.2297.112 5, 265.086 7C20H24NO4木蘭花堿 86.511[M＋H]+320.095 4320.095 81.3292.097 2, 262.086 6C19H14NO4黃連堿* 96.609[M＋H]+339.142 5339.142 91.2322.107 2, 323.115 1, 265.064 0, 294.112 5C20H20NO4藥根堿 106.745[M＋H]+337.126 5337.125 9?1.8320.091 5, 292.097 5C20H18NO4表小檗堿 117.597[M＋H]+336.123 0336.122 12.7320.091 9, 278.083 1C20H18NO4小檗堿* 127.769[M＋H]+353.155 5353.156 94.0278.081 8, 336.123 0C21H22NO4巴馬汀* 137.952[M＋H]+353.104 1353.105 23.1278.068 7C21H22NO4掌葉防己堿 148.473[M＋H]+455.206 0455.205 4?2.4114.092 0, 453.345 1C26H30O7黃柏酮 158.845[M＋H]+471.201 0471.202 21.9243.138 7, 404.344 2C26H30O8檸檬苦素 169.509[M－H]?1 221.626 01 221.630 13.4749.459 9, 750.461 1, 603.401 4, 469.164 8C59H96O26白頭翁皂苷B4* 179.805[M－H]?1 221.619 51 221.619 1?0.3749.461 0, 471.349 1C56H96O26白頭翁皂苷B5* 1810.515[M－H]?895.913 4895.912 9?5.6895.518 8, 733.464 6C47H76O16黑海常春藤皂苷A1* 1910.958[M－H]?911.501 0911.502 11.2765.440 3, 603.390 2C47H76O17白頭翁皂苷D 2014.456[M－H]?749.454 0749.454 60.8471.351 0, 603.400 8C41H66O12α-常春藤皂苷* 2118.615[M＋H]+457.368 0457.365 94.6207.369 3, 190.010 7C33H52O8齊墩果酸

*表示化合物已通過(guò)對(duì)照品比對(duì)

*indicates that the compound has been compared with the reference substance

圖2 15批白頭翁湯樣品HPLC指紋圖譜

圖3 白頭翁湯和單味藥色譜圖

2-秦皮甲素 3-黃柏堿 5-秦皮乙素 7-秦皮素 11-黃連堿 13-小檗堿 14-巴馬汀 15-白頭翁皂苷B4 16-白頭翁皂苷B5

2.4 化學(xué)模式識(shí)別分析

中藥指紋圖譜可全面系統(tǒng)地反映物質(zhì)基準(zhǔn)的化學(xué)信息，同時(shí)采用化學(xué)識(shí)別模式對(duì)指紋圖譜中共有峰在樣品中的差異進(jìn)行分析，可將共有峰對(duì)各批次樣品間指紋圖譜差異的貢獻(xiàn)度量化。

2.4.1 聚類分析（cluster analysis）[12]將15批白頭翁湯樣品的共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，接著導(dǎo)入MetaboAnalyst 5.0數(shù)據(jù)分析進(jìn)行系統(tǒng)聚類，測(cè)量區(qū)間為歐幾里得，聚類結(jié)果如圖5所示。當(dāng)距離為15時(shí)，可將15批白頭翁湯樣品分為2類，其中S13、S7、S8、S1、S11、S4、S14、S10聚為一類，S9、S3、S5、S12、S6、S15、S2聚為一類。聚類結(jié)果表明，不同批次樣品間存在差異，與白頭翁湯樣品中配伍的藥材的產(chǎn)地具有一定相關(guān)性，如聚為一類的S13、S7、S1、S11中黃柏的產(chǎn)地均來(lái)自四川的同一批次（批次均為20201002），聚為一類的S3、S5、S6、S7中黃連的產(chǎn)地均為四川的同一批次（批次均為20200603）。

圖5 15批白頭翁湯聚類樹狀分析圖

2.4.2 偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）[13]將15個(gè)批次的白頭翁湯樣品16個(gè)共有峰峰面積的標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，得到PLS-DA得分矩陣圖、載荷散點(diǎn)圖和變量重要性投影（variable importance in project，VIP）值圖，如圖6所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其關(guān)鍵參數(shù)2、2、2的值分別為0.517、0.891、0.685，均大于0.5，說(shuō)明該模型具有良好的擬合能力及預(yù)測(cè)能力。并且在置信區(qū)間（95%）內(nèi)，15批樣品存在一定差異性。根據(jù)分布可將樣品S1～S15分為2類，樣品S13、S7、S8、S1、S11、S4、S14、S10為A類，樣品S9、S3、S5、S12、S6、S15、S2為B類，結(jié)果與聚類分析一致。PLS-DA載荷散點(diǎn)圖（圖6-B）上每1個(gè)點(diǎn)代表1個(gè)變量，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表明對(duì)樣本的區(qū)分能力越強(qiáng)。為進(jìn)一步篩選出對(duì)上述樣本分類貢獻(xiàn)較大的成分，結(jié)合VIP圖可更直觀地看出各色譜峰的影響程度，VIP 值＞1.0為有意義變量。結(jié)果共找到6個(gè)有意義變量，依次為峰2（秦皮甲素）、峰6、峰10、峰16（白頭翁皂苷B5）、峰7、峰15（白頭翁皂苷B4），見圖6-C。說(shuō)明這6種成分可能是將15批白頭翁湯分為2類的差異性質(zhì)量標(biāo)志物（quality markers，Q-Marker）。

圖6 PLS-DA得分散點(diǎn)圖(A)、載荷散點(diǎn)圖(B)和VIP值(C)

2.5 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的白頭翁湯功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)預(yù)測(cè)分析

2.5.1 白頭翁湯潛在Q-Marker的來(lái)源定位 白頭翁湯的化學(xué)成分包括生物堿類、香豆素類、皂苷類、檸檬苦素類、甾醇類和木脂素類等[11,14]。其中生物堿類、香豆素類、皂苷類和檸檬苦素類化合物為白頭翁湯中主要的化學(xué)成分，具有抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等藥理作用[15]，可能為湯劑發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。故將此4類成分作為白頭翁湯的潛在Q-Marker的來(lái)源范圍，具體主要成分有白頭翁皂苷B4（anemoside B4）、常春藤皂苷C（hederacoside C）、秦皮甲素（esculin）、秦皮乙素（esculetin）、秦皮素（fraxetin）、黃柏堿（phellodendrine）、巴馬?。╬almatine）、黃連堿（coptisine）、小檗堿（berberine）9個(gè)活性成分為候選化合物。

2.5.2 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction. ch/），查找候選化合物作用靶點(diǎn)，通過(guò)UniProt（https://www.uniproUniPrott.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)范靶點(diǎn)基因名，靶點(diǎn)合并，去除重復(fù)值，得到與9個(gè)化合物相關(guān)的545個(gè)靶點(diǎn)。

2.5.3 靶點(diǎn)蛋白與蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析 將獲得的545個(gè)靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0在線分析數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org），選擇物種為“homo sapiens”，設(shè)置蛋白交互參數(shù)評(píng)分值大于0.96的蛋白互作數(shù)據(jù)，去掉網(wǎng)絡(luò)中游離節(jié)點(diǎn)，最終篩選到114個(gè)節(jié)點(diǎn)，將結(jié)果以TSV文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，如圖7所示。利用Cytoscape 3.8.2軟件中的“Network Analyzer”功能對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯?jì)算選取介數(shù)中心性（betweenness centrality）、接近中心性（closeness centrality）和度值（degree）3個(gè)重要拓?fù)鋮?shù)均大于其平均數(shù)的靶點(diǎn)作為關(guān)鍵靶點(diǎn)，經(jīng)篩選得到18個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)（表3）。

圖中顏色越深、圓圈越大說(shuō)明degree值越大

2.5.4 功能富集分析與通路分析 采用基迪奧生物（https://www.omicshare.com/）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)114個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）生物通路富集分析，共篩選出215條相關(guān)通路，對(duì)值最小的前20條通路進(jìn)行分析（圖8），包括癌癥通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt）信號(hào)通路、以及缺氧信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)-1（hypoxia signaling-1，HIF-1）信號(hào)通路等，這些通路可能與白頭翁湯治療疾病的作用相關(guān)。

2.5.5 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將白頭翁湯的9個(gè)活性成分、114個(gè)作用靶點(diǎn)、20條通路，在Cytoscape 3.8.2軟件中構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖（圖9），圖中網(wǎng)絡(luò)錯(cuò)綜復(fù)雜，1個(gè)成分對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，每條通路由多個(gè)靶點(diǎn)調(diào)控，體現(xiàn)了中藥復(fù)方中多成分、多靶點(diǎn)、多途徑共同作用疾病的效果。

表3 關(guān)鍵靶點(diǎn)的拓?fù)涮卣?/p>

Table 3 Topological features of key targets

靶點(diǎn)介數(shù)中心性接近中心性度值 STAT30.255 20.410 925 SRC0.170 40.421 623 AKT10.149 40.412 421 HSP90AA10.194 80.424 818 CDK10.192 10.366 917 PIK3CA0.060 30.349 815 CDKN1A0.111 70.406 514 MAPK10.092 60.383 113 ESR10.095 80.388 313 JUN0.047 80.366 912 CDK20.031 80.338 312 RB10.025 80.356 511 CCND10.077 80.389 711 CDC420.034 20.324 711 AR0.035 60.353 110 E2F10.090 90.340 49 MDM20.072 50.362 28 NCOA10.026 90.289 75

2.5.6 整合分析 白頭翁湯主要的功效是清熱解毒、涼血止痢，主治痢疾，是治療腹瀉的經(jīng)典名方。通過(guò)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的相關(guān)信息整理發(fā)現(xiàn)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可以將肽激素信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到細(xì)胞核，在細(xì)胞內(nèi)被許多細(xì)胞因子迅速激活，一旦激活過(guò)度，會(huì)導(dǎo)致一系列的疾病發(fā)生。

有研究指出，通過(guò)阻斷STAT3靶點(diǎn)的促炎信號(hào)傳導(dǎo)，可以達(dá)到抗結(jié)腸炎的效果[16-18]；AKT1靶點(diǎn)參與細(xì)胞凋亡、生物代謝以及碳水化合物代謝等過(guò)程，可調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝狀態(tài)[19]。KEGG富集發(fā)現(xiàn)，前20條通路主要包括癌癥通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、酪氨酸激酶受體（tyrosine kinase receptor，ErbB）信號(hào)通路以及HIF-1信號(hào)通路等。其中，PI3K-Akt信號(hào)通路[20]是調(diào)控細(xì)胞周期的經(jīng)典通路之一，一些酪氨酸激酶受體可以通過(guò)該途徑促進(jìn)細(xì)胞繁殖或抑制細(xì)胞凋亡，抑制PI3K-Akt信號(hào)通路可以減輕慢性結(jié)腸炎病理?yè)p傷，降低促炎細(xì)胞因子表達(dá)，緩解疾病所致的便血、腹瀉現(xiàn)象[21]。由此可推測(cè)，白頭翁湯可能通過(guò)作用于這些靶點(diǎn)和通路達(dá)到清熱解毒、涼血止痢的功效。

圖8 白頭翁湯KEGG通路富集結(jié)果(前20)

圖中左邊圓環(huán)部分代表化學(xué)成分、中間矩形部分代表靶點(diǎn)（深紅三角形節(jié)點(diǎn)代表關(guān)鍵靶點(diǎn)）、右邊圓環(huán)部分代表通路

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)不同提取溶劑、不同提取方式和不同提取時(shí)間進(jìn)行了考察，基于成分響應(yīng)值、出峰數(shù)目和雜質(zhì)干擾情況，選擇出最優(yōu)條件。通過(guò)比較白頭翁湯冷凍干粉分別用甲醇、70%甲醇、乙腈、純水溶劑提取，發(fā)現(xiàn)用有機(jī)試劑超聲提取不如純水出峰數(shù)量多，故確定用純水作為提取溶劑，再比較超聲提取和煎煮法提取2種方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煎煮法色譜峰的出峰數(shù)量、峰形、提取化學(xué)成分的全面性以及湯劑煎煮更加合理，因此綜合考慮，確定用煎煮法為最佳提取條件。

本實(shí)驗(yàn)還考察波長(zhǎng)、流動(dòng)相組成、色譜柱、體積流量、柱溫等條件，其中波長(zhǎng)和流動(dòng)相的選擇是本實(shí)驗(yàn)考慮的重點(diǎn)。白頭翁湯的化學(xué)成分較為復(fù)雜，含有生物堿類、香豆素類、皂苷類和檸檬苦素類等化合物，測(cè)定時(shí)選用紫外檢測(cè)器全波長(zhǎng)對(duì)樣品進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)皂苷類成分在203 nm下響應(yīng)較高，生物堿類成分在345 nm下響應(yīng)較高，因此著重考察了203、210、345 nm波長(zhǎng)，綜合考慮其出峰數(shù)量、響應(yīng)值、峰形、基線等，為了使指紋圖譜信息豐富，避免影響峰值響應(yīng)和檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定性，保證多成分在最大吸收波長(zhǎng)下的最佳吸收而互不干擾，最終確定掃描波長(zhǎng)為210 nm。流動(dòng)相分別考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液，發(fā)現(xiàn)用乙腈作為洗脫溶劑，生物堿類成分均出現(xiàn)明顯后拖尾且峰形較寬，若在流動(dòng)相中加入緩沖溶劑，也沒有明顯修飾峰形。因此，考慮更換溶劑，使用甲醇洗脫有較好的色譜峰峰形，分離度良好，出峰數(shù)量多，響應(yīng)值高，且不用添加緩沖溶劑，綜合考慮選用甲醇作為流動(dòng)相。

白頭翁湯是由白頭翁、黃連、黃柏、秦皮4味藥組成，其中白頭翁味苦性寒，能入血分，清熱解毒，涼血止痢，為君藥；黃連清熱解毒，燥濕厚腸，為治痢要藥；黃柏善清下焦?jié)駸幔?藥共助君藥清熱解毒，燥濕治痢，為臣藥。秦皮苦寒而澀，清熱解毒兼能收澀止痢，為佐使藥。全方4味藥配合有度，其藥效的發(fā)揮并非是單一有效成分的作用，而是其所含多元化活性成分共同作用的結(jié)果，建立指紋圖譜時(shí)應(yīng)綜合考慮全方，選擇具有代表性且與藥效相關(guān)性強(qiáng)的成分作為質(zhì)控指標(biāo)，使物質(zhì)基準(zhǔn)能準(zhǔn)確反映原方質(zhì)量，以助于更好地發(fā)揮物質(zhì)基準(zhǔn)的參照物功能，保證經(jīng)典方劑的質(zhì)量[22]。

本研究通過(guò)UPLC-Q-TOF-MS/MS聯(lián)用技術(shù)對(duì)白頭翁湯化學(xué)成分進(jìn)行表征，鑒定出21個(gè)化學(xué)成分，建立15批白頭翁湯指紋圖譜標(biāo)定了16個(gè)色譜峰且通過(guò)對(duì)照品指認(rèn)出9個(gè)化學(xué)成分，包括白頭翁的藥效成分白頭翁皂苷B4和白頭翁皂苷B5，黃連的藥效成分黃連堿和小檗堿，黃柏的藥效成分黃柏堿和小檗堿，秦皮中的的藥效成分秦皮素、秦皮甲素和秦皮乙素。未成功指認(rèn)7個(gè)色譜峰，由白頭翁湯和單味藥材的色譜疊圖可大致推斷，峰6來(lái)自秦皮，峰1、4、8、9、12來(lái)自黃連，峰4、8、9、10、12來(lái)自黃柏，其中峰4、8、9、12為黃連、黃柏的共有成分。通過(guò)查閱文獻(xiàn)，黃連、黃柏共有的成分研究較多為木蘭花堿、藥根堿、防己堿和表小檗堿等生物堿類成分[23-24]，從文獻(xiàn)查閱和白頭翁湯化學(xué)成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定結(jié)果來(lái)看，出峰順序依次為木蘭花堿、藥根堿和表小檗堿且均出峰早于小檗堿，若需明確峰8、9、12是否為這3種物質(zhì)，后期仍需購(gòu)買對(duì)照品進(jìn)行比對(duì)或通過(guò)制備色譜分離技術(shù)與結(jié)構(gòu)鑒定技術(shù)對(duì)這3個(gè)色譜峰進(jìn)行深入的探索分析。

綜上，本實(shí)驗(yàn)首次全面表征了白頭翁湯成分的整體樣貌，同時(shí)將網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與指紋圖譜相結(jié)合，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)建立“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，對(duì)明確指認(rèn)出的9種藥效成分進(jìn)行篩選與靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選得到18個(gè)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)，通過(guò)癌癥通路、PI3K-Akt通路和HIF-1通路等信號(hào)通路發(fā)揮治療疾病的作用。不僅對(duì)白頭翁湯質(zhì)量控制指標(biāo)成分的合理性進(jìn)行了驗(yàn)證，而且揭示白頭翁湯功效關(guān)聯(lián)性的物質(zhì)基礎(chǔ)，為白頭翁湯發(fā)揮功效及藥理作用機(jī)制的闡釋提供了思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Predictive analysis of fingerprints and efficacy related substances of Zhongjing famous prescription Baitouweng Decoction

QIU Hai-xin1, GAN Jin-yue1, WANG Bao-lin1, YANG Shi-lin1, XU Qiong-ming1, QIN Xi-jun1, TAN Xiao-qing2, GAO Hong-wei1,3, LIU Zhen-jie1

1. Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, China 2. Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Science, Nanning 530022, China 3. Guangxi Engineering Technology Research Center of Advantage Chinese Patent Drug and Ethnic Drug Development, Nanning 530299, China

To study the chemical components of a famous prescription of Zhongjing named Baitouweng Decoction (白頭翁湯), establish HPLC fingerprint and analyze the mechanism of its efficacy-related substances using network pharmacology, so as to provide a reference for the quality control of Baitouweng Decoction.Qualitative analysis of the chemical components of Baitouweng Decoction was carried out by UPLC-Q-TOF-MS/MS, the HPLC method was used to establish the fingerprint analysis method of Baitouweng Decoction and the similarity was evaluated. The common peaks were matched, at the same time, the attribution analysis of each common peak was performed. The active ingredients of Baitouweng Decoction were screened based on Mass spectrometry identification and fingerprints, and the “component-target-pathway” network was established through network pharmacology, which further supported the rationality of functional components selection for Baitouweng Decoction.Through database matching, element composition and fragment structure analysis, a total of 21 compounds were identified. The Baitouweng Decoction fingerprint analysis method was established, 15 batches of Baitouweng Decoction samples were measured, 16 common peaks were calibrated, and nine peaks of esculin (peak 2), aesculetin (peak 5), fraxetin (peak 7), anemoside B4 (peak 15), anemoside B5 (peak 16), phellodendrine (peak 3), coptisine (peak 11), berberine (peak 13) and palmatine (peak 14) were identified by comparing with the reference substance. The similarity of each batch of samples was greater than 0.90. And the 16 common peaks can be assigned to the four flavors of Baitouweng (), Huanglian (),Huangbo (), and Qinpi (). The mechanism of the identified nine medicinal components was predicted. The enriched pathways included cancer pathways, PI3K-Akt signaling pathways, and HIF-1 signaling pathways, which may be related to the effect of Baitouweng Decoction in treating diseases.The UPLC-Q-TOF-MS/MS method can quickly identify the chemical components of Baitouweng Decoction, and the fingerprint analysis method established in this experiment is simple and feasible. Combined with network pharmacology, it is found that the nine components of Baitouweng Decoction are closely related to the efficacy and attributes of Baitouweng Decoction, which provides a reference for the overall control of the quality and provides a material basis for the efficacy of Baitouweng Decoction. The research and the exploration of the mechanism of action also lay the foundation.

Baitouweng Decoction; UPLC-Q-TOF-MS/MS; HPLC; fingerprint; similarity evaluation; network pharmacology; esculin; aesculetin; fraxetin; anemoside B4; anemoside B5; phellodendrine; coptisine; berbine; palmatine;;;;

R283.6

A

0253 - 2670(2022)06 - 1740 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.016

2021-09-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81860711）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81860270）；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2018GXNSFBA 281034）；廣西科技基地和人才專項(xiàng)（桂科AD19245124）

丘海芯，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)和中藥分析。Tel: 18894642093 E-mail: 974525034@qq.com

劉振杰，助理研究員，研究方向?yàn)樗幬锓治?。Tel: 13737048648 E-mail: rainman982@126.com

高紅偉，博士，副研究員，主要研究方向?yàn)橹兴幙寡谆钚约翱鼓[瘤活性研究。Tel: 18077022216 E-mail: gaohongwei06@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]