基于茜素紅S-苯硼酸光化學(xué)比色傳感器的附子配方顆粒強心活性評價方法的建立

陳露夢，劉 惠，賀亞男，羅傳紅，賈明艷，周永峰，楊景屏，譚 鵬，楊 明，張定堃*

基于茜素紅S-苯硼酸光化學(xué)比色傳感器的附子配方顆粒強心活性評價方法的建立

陳露夢1，劉 惠1，賀亞男1，羅傳紅1，賈明艷1，周永峰1，楊景屏2，譚 鵬3，楊 明4*，張定堃1*

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 四川新盛源藥業(yè)有限公司，四川 江油 621700 3. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥質(zhì)量生物評價重點研究室，四川 成都 610041 4. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

基于附子強心組分去甲烏藥堿、去甲豬毛菜堿和棍掌堿共有的腎上腺素類似結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了以鄰二酚羥基基團與茜素紅S-苯硼酸體系置換反應(yīng)為核心的光化學(xué)比色傳感器，用于整體評價附子配方顆粒的強心作用。以傳感器的響應(yīng)強度為評價指標，對超聲提取時間、料液比、提取液濃度和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）濃度等供試品的制備條件進行優(yōu)化；并對該方法的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性進行考察；用平板掃描儀獲取23批附子配方顆粒的|Δ|值（綠色， |Δ|＝|后－前|），同時采用LC-MS/MS測定附子配方顆粒中3種生物堿的含量，將|Δ|與強心成分總含量進行相關(guān)性分析。供試品制備方法優(yōu)選為取附子配方顆粒粉末0.5 g，加10 mL甲醇，300 W、60 kHz超聲提取15 min，將上清液全部轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，80 ℃揮干，4 mL 0.13 g/mL的EDTA-2Na溶液洗脫蒸發(fā)皿上物質(zhì)，離心，取上清液，調(diào)pH至8.0左右，緩沖溶液稀釋3倍。方法學(xué)考察表明該方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。23批樣品的強心成分總含量的差異較大，為127.83～6 928.27 μg/g；|Δ|的范圍為0～12.5，兩者的相關(guān)系數(shù)（）高達0.96，表明強心成分總含量與|Δ|高度相關(guān)。該方法具有一定的科學(xué)性與準確性，可整體性評價附子配方顆粒強心藥效。

附子；強心作用；配方顆粒；光化學(xué)比色傳感器；質(zhì)量評價；茜素紅S；苯硼酸；去甲烏藥堿；去甲豬毛菜堿；棍掌堿；腎上腺素

配方顆粒是中藥飲片發(fā)展的一種新形式。目前，已有160個中藥配方顆粒的國家標準頒布[1]，但大部分中藥配方顆粒仍沿用現(xiàn)有中藥飲片的評控體系，主要采用薄層、特征圖譜、含量測定、浸出物等理化分析方法。這些檢驗指標雖具有一定的質(zhì)控力，但與臨床功效和安全性關(guān)聯(lián)不緊密，難以評控中藥配方顆粒的內(nèi)在質(zhì)量[2-3]。

附子為毛茛科烏頭屬植物烏頭Debx.的子根加工品，因其對于各種急、慢性心衰療效顯著，被譽為“回陽救逆第一品藥”，治病保命“藥中四維”[4-5]。但由于含有雙酯型生物堿等劇毒成分和不恰當(dāng)?shù)呐谥?、?yīng)用，時有關(guān)于附子中毒事件的報道[6-7]。附子配方顆粒主要以生附片、黑順片、淡附片等飲片為原料，經(jīng)工業(yè)化提取、濃縮、干燥、制粒而成。在提取過程中，附子劇毒成分大量降解，確保了用藥安全，解決了因先煎帶來的不便，且方便攜帶，調(diào)配靈活[8]。但由于不同廠家的飲片來源、生產(chǎn)制備、顆粒收率等方面的不同，市售附子配方顆粒的化學(xué)成分含量差異明顯，尚未形成統(tǒng)一的國家質(zhì)量標準，更缺少關(guān)聯(lián)功效的整體質(zhì)量評控方法。

課題組前期[9]建立了基于急性心衰大鼠血液流變學(xué)即時測定的附子強心活性評價方法，可真實客觀地反映藥物的藥效強度，但技術(shù)難度高，可及性差，需消耗大量實驗動物。LC-MS/MS雖能直接測定強心成分含量，但儀器的購置成本貴，檢測速率較慢，且需使用多種對照品。

為尋找快速簡便、關(guān)聯(lián)功效的附子整體質(zhì)量評控方法，課題組根據(jù)附子強心成分去甲烏藥堿（higenamine，HI）、去甲豬毛菜堿（salsolinol，SA）、棍掌堿（coryneine，CO），構(gòu)建了基于茜素紅S（alizarin red S，ARS）-苯硼酸（phenylboronic acid，PA）光化學(xué)比色傳感器的附子強心活性評價新方法。ARS與PA通過非共價鍵可逆性結(jié)合，含鄰二酚羥基的物質(zhì)與PA競爭性結(jié)合，指示劑被置換出來，產(chǎn)生指示劑顏色響應(yīng)（原理如圖1所示），具有價格低廉、操作簡便、響應(yīng)快速的特點。該方法實現(xiàn)了對不同批次生附片強心強度的區(qū)分[10]。

為進一步擴大該方法的應(yīng)用范圍，本實驗以附子配方顆粒為研究對象，根據(jù)附子配方顆粒具有的藥物濃度高、鈣鎂離子含量高等特點，優(yōu)化改進供試品制備方法，對比光化學(xué)傳感器檢測結(jié)果與質(zhì)譜測定結(jié)果的異同，并擬定附子配方顆粒的質(zhì)量分級參考標準。

1 儀器與材料

1.1 儀器

EPSON Perfection V370 Photo全彩平板掃描儀，愛普生有限公司；KQ-500D E型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司；Costar 96孔細胞培養(yǎng)板，美國康寧公司；pHS-3C型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Mili-Q型超純水儀，美國Milipore公司；BSA 224SA型1/1萬分析天平和BT25S型1/10萬分析天平，德國Sartorius公司；L550型臺式低速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；Agilent 6460C三重串聯(lián)四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent公司，配有ESI離子源。

圖1 IDA置換原理

1.2 試藥

分析甲醇，批號2021032902，成都市科隆化學(xué)品有限公司；色譜乙腈，批號20032512，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司；PA（批號C10492112）；ARS（批號1129L031），阿法埃莎化工有限公司；4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），批號20200918，北京索萊寶科技有限公司；對照品HI（批號CHB210118，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、SA（批號CHB190104，質(zhì)量分數(shù)≥98%）、棍掌堿（批號CHB180609，質(zhì)量分數(shù)≥ 98%）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（EDTA- 2Na，批號20190416）；無水亞硫酸鈉（Na2SO3，批號015042101），成都市科龍化工試劑廠。

1.3 樣品

23批附子配方顆粒（S1～S23）來源于全國5個不同廠家，樣品信息見表1。

2 方法

2.1 |ΔG|值的測定

將緩沖溶液加入ARS-PA的反應(yīng)體系后，平衡5 min，用平板掃描儀掃描反應(yīng)“前”的圖像。不同批次附子配方顆粒的供試品溶液加入反應(yīng)體系，平衡5 min，反應(yīng)完全后，取200 μL反應(yīng)后的溶液于96孔板中，用平板掃描儀掃描，掃描反應(yīng)“后”的圖像。每個批次做3次平行實驗，求取平均值。使用Adobe Photoshop CS 6.0軟件獲得反應(yīng)前后圖像中的綠色（）值，即為“前”和“后”，并進行差減，得到反應(yīng)前后的變化值即|Δ|值（|Δ|＝|后－前|）。

2.2 供試品溶液制備方法的考察

2.2.1 超聲時間的優(yōu)化 準確稱取的附子配方顆粒約0.5 g，加入10 mL甲醇，300 W、60 kHz超聲提取15、30、45、60 min，對比不同超聲時間提取的附子配方顆粒提取液加入前后的|Δ|值，優(yōu)選最佳超聲時間。結(jié)果|Δ|分別為9.50±0.00、9.17±0.57、9.83±0.57、9.83±0.57（＝3），超聲時間對于配方顆粒的響應(yīng)強度無明顯的影響，因此，選取提取時間最短的15 min為最佳提取時間。

表1 樣品信息

Table 1 Sample information

編號飲片類型批號廠家 S1黑順片配方顆粒20095587江陰天江藥業(yè)有限公司 S2黑順片配方顆粒20104013江陰天江藥業(yè)有限公司 S3黑順片配方顆粒20099411江陰天江藥業(yè)有限公司 S4黑順片配方顆粒20088723江陰天江藥業(yè)有限公司 S5黑順片配方顆粒20085637江陰天江藥業(yè)有限公司 S6黑順片配方顆粒2101034安徽濟人藥業(yè)有限公司 S7淡附片配方顆粒0081579廣東一方制藥有限公司 S8黑順片配方顆粒1808018安徽濟人藥業(yè)有限公司 S9黑順片配方顆粒2007044安徽濟人藥業(yè)有限公司 S10黑順片配方顆粒18019351北京康仁堂藥業(yè)有限公司 S11黑順片配方顆粒17010981北京康仁堂藥業(yè)有限公司 S12黑順片配方顆粒17026892北京康仁堂藥業(yè)有限公司 S13黑順片配方顆粒20035771北京康仁堂藥業(yè)有限公司 S14黑順片配方顆粒20008871北京康仁堂藥業(yè)有限公司 S15黑順片配方顆粒20008881北京康仁堂藥業(yè)有限公司 S16淡附片配方顆粒0092391廣東一方制藥有限公司 S17淡附片配方顆粒0121871廣東一方制藥有限公司 S18生附片配方顆粒1905002W三九醫(yī)藥股份有限公司 S19生附片配方顆粒18054151江陰天江藥業(yè)有限公司 S20生附片配方顆粒18063281江陰天江藥業(yè)有限公司 S21生附片配方顆粒18072251江陰天江藥業(yè)有限公司 S22生附片配方顆粒20092293江陰天江藥業(yè)有限公司 S23黑順片配方顆粒20035771北京康仁堂藥業(yè)有限公司

2.2.2 料液比的優(yōu)化 分別以1∶5、1∶10、1∶20、1∶30的料液比提取配方顆粒，超聲15 min，對比不同料液比提取的附子配方顆粒提取液加入前后的|Δ|值，優(yōu)選最佳液料比。結(jié)果|Δ|分別為3.00±0.00、5.75±0.50、10.17±0.57、10.17±0.57（＝3），當(dāng)料液比為1∶5和1∶10時，附子配方顆粒的響應(yīng)強度很弱，而當(dāng)料液增比加至1∶20，響應(yīng)強度增加，繼續(xù)增加至1∶30后，響應(yīng)強度不再增加，表明當(dāng)料液比為1∶20時強心成分已能基本溶出，從節(jié)省時間、節(jié)約溶劑的角度，選取1∶20為最佳料液比。

2.2.3 附子配方顆粒提取液濃度的優(yōu)化 pH調(diào)至8.0的附子配方顆粒提取液的顏色仍然偏深，為避免提取液顏色對于|Δ|造成干擾，分別用緩沖溶液將其稀釋3、5、7、10倍，對比不同濃度的配方顆粒提取液加入前后|Δ|值，優(yōu)選最佳的配方顆粒提取液濃度。結(jié)果|Δ|分別為10.00±0.00、6.00±0.00、5.60±0.55、2.40±0.89（＝3），附子配方顆粒提取液稀釋3倍后溶液顏色很淡，將其加入反應(yīng)體系后，傳感器的響應(yīng)強度很高。稀釋至5、7倍時，傳感器的響應(yīng)強度急劇降低；繼續(xù)稀釋至10倍，傳感器的響應(yīng)強度很弱或幾乎無響應(yīng)，因此優(yōu)選附子配方顆粒提取液稀釋3倍后的濃度為最佳濃度。

2.2.4 EDTA-2Na質(zhì)量濃度的優(yōu)化 與生附片不同的是，黑順片、白附片中含有大量的Ca2+、Mg2+，可競爭性的與茜素紅絡(luò)合，進而形成紫色絡(luò)合物。為排除Ca2+、Mg2+對實驗結(jié)果的干擾，選用EDTA- 2Na進行絡(luò)合。平行稱取4份同一批附子配方顆粒約0.5 g，超聲提取后置于80 ℃的水浴鍋上揮干，分別用4 mL質(zhì)量濃度分別為0.06、0.10、0.13、0.15 g/mL的EDTA-2Na溶液洗脫蒸發(fā)皿上的物質(zhì)，然后再用緩沖溶液稀釋3倍，即得供試品溶液。對比不同質(zhì)量濃度EDTA-2Na溶液對|Δ|的影響，優(yōu)選最佳的EDTA-2Na質(zhì)量濃度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量濃度為0.06、0.10 g/mL的EDTA-2Na溶液無法完全除盡供試品中的Ca2+、Mg2+，指示劑仍顯紫色。當(dāng)質(zhì)量濃度增加至0.13 g/mL時，溶液不再顯紫色，繼續(xù)增加至0.15 g/mL時，傳感器的響應(yīng)強度也不再增加，說明當(dāng)EDTA-2Na質(zhì)量濃度為0.13 g/mL時，Ca2+、Mg2+已基本除盡。因此，EDTA-2Na質(zhì)量濃度優(yōu)選為0.13 g/mL。

2.2.5 供試品溶液的制備 準確稱取附子配方顆粒約0.5 g，加入10 mL甲醇，300 W、60 kHz超聲提取15 min，8000 r/min離心（離心半徑81 mm）10 min，將提取液全部轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，80 ℃揮干溶劑，4 mL 0.13 g/mL的EDTA-2Na洗脫蒸發(fā)皿上的物質(zhì)，洗脫液12 000 r/min離心（離心半徑81 mm）10 min，取上清液，0.3 mol/L NaOH調(diào)pH至8.0左右，用緩沖溶液稀釋3倍，即得供試品溶液。所有實驗均在10 mmol/L的緩沖溶液（pH 8.0）中進行。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度 將SA（2.5 mmol/L）對照品溶液，加入ARS（0.1 mmol/L）和PA（0.3mmol/L）的反應(yīng)體系中，0 ℃條件下反應(yīng)，平衡5 min，將200 μL反應(yīng)后的溶液加入96孔板中，平行移取6份，獲取反應(yīng)前后的圖像。結(jié)果表明6次測定的|Δ|的RSD值為2.43%，表明該方法的精密度很好。

2.3.2 穩(wěn)定性 將附子配方顆粒（S4）制成供試品溶液，室溫放置，分別于0、1、2、4、6、8、10和12 h后進行反應(yīng)，獲取每個時間點的|Δ|，計算得|Δ|的RSD值。結(jié)果表明|Δ|的RSD值為1.21%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性 平行稱取6份附子配方顆粒（S4）約0.5 g，制成供試品溶液，分別獲取該6個平行批次的|Δ|，計算|Δ|的RSD值。6份供試品溶液的|Δ|的RSD值為3.07%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.4 專屬性 配方顆粒中常含有乳糖、糊精等輔料，可能會對|Δ|產(chǎn)生一定的干擾。前期研究中發(fā)現(xiàn)2.5 mmol/L的SA可將ARS完全置換出來。糊精在水中的溶解度很低，將溶解至飽和的糊精和3 mmol/L的乳糖加入ARS-PA的反應(yīng)體系中，觀察顏色的變化，并獲取其|Δ|值。將3 mmol/L的乳糖和部分溶解的糊精加入ARS-PA的反應(yīng)體系后，顏色幾乎沒有變化，|Δ|均為0，乳糖和糊精對于|Δ|幾乎沒有影響。

2.4 光化學(xué)傳感器檢測結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果的對比

2.4.1 色譜質(zhì)譜條件 Phenomenex C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～1 min，2%～20%乙腈；1～5 min，20%～50%乙腈；5～10 min，50%～75%乙腈；10～15 min，75%～100%乙腈；體積流量為0.45 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量5 μL[11]。

質(zhì)譜采用ESI源，正離子模式檢測；脫溶劑溫度300 ℃；脫溶劑氣N2體積流量11 L/min；霧化器壓力15 psi（1 psi＝6.895 kPa）；毛細管電壓4000 V；掃描方式為多反應(yīng)檢測（MRM）；3個待測化合物優(yōu)化后的離子對、碎裂電壓和碰撞能量見表2。

表2 附子配方顆粒中3種生物堿的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

Table 2 Mass spectrum data of three alkaloids in Fuzi formula granules

名稱m/z碎裂電壓/V碰撞能量/eV HI279.1/106.910020 SA179.9/116.910520 CO196.1/13716020

2.4.2 對照品溶液的配制 分別稱取各對照品適量，精密稱定，用甲醇配制成含HI、CO、SA的質(zhì)量濃度分別為1.07、1.03、1.07 μg/mL的對照品儲備液。

2.4.3 供試品溶液的配制 精密稱取附子配方顆粒粉末約0.1 g，分別置于量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，超聲提取30 min，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4.4 測定結(jié)果 按上述色譜與質(zhì)譜條件進樣，進行LC-MS/MS分析，測定樣品中3種生物堿的含量，每個樣品平行測定3份。23批附子配方顆粒的含量測定結(jié)果見表3。HI是活性較強的強心成分，但23批附子配方顆粒中HI的含量均很低，含量最高僅為1.64 μg/g，最低為0.27 μg/g，相差6倍。SA、CO是強心活性相對較弱的成分，不同產(chǎn)家、不同原料、不同批次的配方顆粒含量波動較大，CO含量從81.62～6 844.412 μg/g，相差83.85倍；SA含量最高為470.09 μg/g，最低為2.19 μg/g，相差214.17倍。觀察發(fā)現(xiàn)，生附片配方顆粒中強心成分的含總量普遍較高，最高為6 928.27 μg/g。這是由于生附片未經(jīng)過反復(fù)的水洗、浸漂、蒸煮處理，強心的水溶性生物堿保留較為充分。在收集的23批附子配方顆粒中，有15批是以黑順片為原料制成的，由于黑順片的原料、加工工藝、加工設(shè)備不同，致使不同廠家、不同批次的黑順片配方顆粒強心成分的總含量差異巨大，最高為5 429.69 μg/g，最低為201.08 μg/g，相差近27倍。3批淡附片配方顆粒的強心成分的總含量均小于300 μg/g。推測這可能是因為淡附片由鹽附子漂膽，與甘草、黑豆煮至透心后，切片干燥后制成，水處理環(huán)節(jié)過多，導(dǎo)致大量的水溶性生物堿流失，強心成分總含量總體偏低。23批附子配方顆粒的光化學(xué)傳感器檢測結(jié)果見表3。23批樣品的|Δ|差異顯著，最高為12.5，最低為0。生附片配方顆粒的|Δ|普遍較大，最高為12.5；淡附片的|Δ|較小，均接近于0；15批黑順片配方顆粒的|Δ|差別很大，從0.5～11.6。對比23批樣品的光化學(xué)傳感器檢測結(jié)果與質(zhì)譜檢測結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，附子配方顆粒的強心成分總含量越高，|Δ|越大。

表3 附子配方顆粒中3種化合物的含量測定結(jié)果(n = 3)

Table 3 Determination results of three compounds in Fuzi formula granules (n = 3)

編號質(zhì)量分數(shù)/(μg?g?1)|ΔG| HICOSAHI＋CO＋SA 10.543 322.80125.353 448.697.13 21.645 167.38260.685 429.7011.60 30.53693.5320.11714.161.00 41.204 872.01257.695 130.909.00 50.661 093.2326.501 120.391.20 60.912 264.29371.912 637.115.75 70.4481.622.1984.260.50 80.34164.6036.14201.080.50 90.973 041.24470.093 512.308.75 100.992 421.33169.432 591.756.00 111.183 522.49128.793 652.457.83 121.003 538.40191.203 730.619.42 131.372 240.20268.922 510.503.75 141.352 433.56246.872 681.785.17 151.432 535.58270.082 807.095.00 160.27125.342.22127.830.25 170.52252.6036.64289.760.00 181.042 372.09227.552 600.688.20 191.346 484.6872.406 558.4211.20 201.636 844.4282.236 928.2712.50 211.536 656.6365.576 723.7412.00 221.185 260.8150.355 312.3411.25 231.632 401.69327.952 731.275.00

2.5 一致性和相關(guān)性分析

使用Origin 2019和SPSS 26.0軟件分別對傳感器陣列的|Δ|和3種強心成分總含量進行一致性和簡單的線性相關(guān)性分析，驗證該方法的科學(xué)性和準確性。為了驗證該傳感器評價附子配方顆粒強心作用的科學(xué)性，比較3種強心成分總含量與|Δ|值的一致性，如圖2-A所示。氣泡面積代表強心成分總含量的高低，氣泡越大，強心成分的總含量越高。從氣泡大小的排列順序來看，強心成分的總含量排序與|Δ|總體上基本一致，除S10、S15、S18、S19稍有偏差。隨后，為了進一步判斷該傳感器評價附子配方顆粒強心作用的準確性，本研究對|Δ|與強心成分的總含量進行了相關(guān)性分析。從圖2-B可以看出，|Δ|與強心成分的總含量呈現(xiàn)顯著的線性相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)（）高達0.96，相關(guān)性方程為＝0.001 9＋0.360 1。將|Δ|值代入相關(guān)性方程后，便可預(yù)測其強心成分的總含量。本研究建立的ARS-PA光化學(xué)比色傳感器可有效地評價附子配方顆粒的品質(zhì)，反映其強心作用的強弱。

圖2 強心成分總含量與|ΔG|的一致性評價(A) 和相關(guān)性分析(B)

2.6 附子配方顆粒的質(zhì)量評價標準初步研究

強心是附子的主要藥理作用，受藥材來源、制劑工藝、產(chǎn)品規(guī)格等因素的影響[12-14]，不同批次、不同產(chǎn)家、不同類型的附子配方顆粒含強心成分的總含量存在著顯著的差異。反應(yīng)后的顏色與強心成分的總含量密切相關(guān)，因此可通過顏色快速評定附子配方顆粒質(zhì)量優(yōu)劣。根據(jù)23批樣品反應(yīng)后的顏色，構(gòu)建附子配方顆粒質(zhì)量評價比色卡及其對應(yīng)的|Δ|和強心成分總含量的范圍。

本實驗依據(jù)顏色的差異，制作附子配方顆粒比色卡，便于后續(xù)的分級評定。如圖3所示，強心作用較弱的附子配方顆粒反應(yīng)后的顏色為橙黃色；強心作用中等的附子配方顆粒反應(yīng)后的顏色偏紅；強心作用較強的附子配方顆粒反應(yīng)后的顏色為紫紅色。此外本實驗通過制作的附子配方顆粒比色卡對收集的23批附子配方顆粒進行初步分級評定，結(jié)果表明這批樣品中強心作用較強的有5批，強心作用中等12批，強心作用弱的有6批。

圖3 附子配方顆粒質(zhì)量評價比色卡

3 討論

含鄰二酚羥基結(jié)構(gòu)的化合物不太穩(wěn)定[15]，易被氧化，因此附子配方顆粒提取液若放置過久，強心活性物質(zhì)將會被氧化，溶液顏色加深，對|Δ|值產(chǎn)生影響。供試品的穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，樣品在 12 h內(nèi)是穩(wěn)定的，但12～24 h溶液的顏色及響應(yīng)強度均發(fā)生一定的變化。考慮到有時樣品溶液制備后無法在12 h內(nèi)將其檢測完成，為提高供試品的穩(wěn)定性，在EDTA-2Na緩沖溶液中加入抗氧化劑（0.1%無水Na2SO3），考察1、6、12、24 h穩(wěn)定性，結(jié)果表明加入抗氧化劑后供試品可在24 h內(nèi)依舊能保持穩(wěn)定。因此，有時為提高供試品的穩(wěn)定性可考慮在其中加入0.1%無水Na2SO3。

附子產(chǎn)鮮季節(jié)產(chǎn)量大，如不及時采挖處理，1周時間就會大量腐爛，因此需通過泡膽工藝防腐[16-17]。泡膽用的膽巴水由MgCl2、CaSO4、CaCl2、NaCl高濃度混合溶液組成[18-19]。自清朝后期以來，在四川江油地區(qū)，形成了“泡膽-退膽-煮制-剝皮-切片-蒸制（火烤）”的主流工藝[20]。部分商家為謀取個人利益，故意退膽不凈，致使黑順片、淡附片中仍然殘留著大量的Ca2+、Mg2+，其會與ARS絡(luò)合，進而形成紫色絡(luò)合物，嚴重干擾實驗結(jié)果。因此，附子配方顆粒在供試品的制備過程中需加入一定量的EDTA-2Na，絡(luò)合去除金屬離子。

LC-MS/MS是鑒別附子強心活性成分常用的方法，但其依賴昂貴儀器、分析成本高、需要專業(yè)人員、操作復(fù)雜、不便于在基層單位使用。相較于LC-MS/MS等大型分析設(shè)備，該方法大大縮減了分析成本：無需專業(yè)設(shè)備、無需昂貴的對照品、無需專業(yè)的操作人員；節(jié)省時間，雖然該方法供試品制備時間略長，但|Δ|值測定時間短，掃描1次僅需幾秒，整體所需時間較LC-MS/MS有所減少，如1個樣品從制樣到顯色需大約1.8 h，而LC-MS/MS測定該3種成分需要2.25 h左右。該方法作為現(xiàn)有方法的重要補充，可整體性的評價附子配方顆粒的強心作用，可為附子配方顆粒質(zhì)量標準完善提供了重要的技術(shù)支撐。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Establishment of cardiotonic activity evaluation method of Fuzi formula granules based on alizarin red S-phenylboronic acid photochemical colorimetric sensor

CHEN Lu-meng1, LIU Hui1, HE Ya-nan1, LUO Chuan-hong1, JIA Ming-yan1, ZHOU Yong-feng1, YANG Jing-ping2, TAN Peng3, YANG Ming4, ZHANG Ding-kun1

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Sichuan Xingshengyuan Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 621700, China 3. State Key Laboratory of Biological Evaluation of TCM Quality, National Administration of TCM, Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China 4. Key Laboratory of Modern Preparation of TCM, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

Based on the similar structure of adrenaline shared by higenamine, salsolinol and coryneine, a photochemical colorimetric sensor based on the displacement reaction of-diphenol hydroxyl group and alizarin red S-phenylboric acid system was proposed to evaluate the cardiotonic effect of Fuzi () formula granules as a whole.Taking the response intensity of the sensor as the evaluation index, the preparation conditions of test samples such as ultrasonic extraction time, solid-liquid ratio, extraction solution concentration and EDTA-2Na concentration were optimized; then the precision, repeatability and stability of the method were investigated; The |Δ| value (is green, |Δ| = |after－before|) of each sample was obtained by response values determination of 23 batches of Fuzi formula granules; at the same time, the contents of three alkaloids in Fuzi formula granules were determined by LC-MS/MS. The correlation between |Δ| and the total content of cardiac components was analyzed.The preparation method of the test article was preferably as follows: take 0.5 g of Fuzi formula granular powder, add 10 mL of methanol, and ultrasonic at 300 W and 60 kHz for 15 min, put the supernatant in an evaporating dish, volatilize it at 80 ℃, elute the substance on the evaporating dish with 4 mL of 0.13 g/mL EDTA-2Na solution, centrifuge, take the supernatant, adjust the pH to 8.0, and dilute the buffer solution three times; The methodological investigation showed that the method had good precision, repeatability and stability. The total content of cardiac components in 23 batches of samples varied greatly, 127.83—6 928.27 μg/g; The range of |Δ| was 0—12.5, and the correlation coefficient () was as high as 0.96, indicating that the total content of cardiac components was highly correlated with |Δ|.The method is scientific and accurate, and can evaluate the cardiotonic effect of Fuzi formula granules as a whole.

; cardiotonic action; formula granules; photochemical colorimetric sensor; quality evaluation; alizarin red S; phenylboronic acid; higenamine; salsolinol; coryneine; adrenaline

R283.6

A

0253 - 2670(2022)06 - 1761 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.018

2021-10-26

四川省中醫(yī)藥管理局科學(xué)技術(shù)研究專項（2021MS016）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（82003907）；四川省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥重點學(xué)科建設(shè)項目（川中醫(yī)藥函[2020]84號）；四川省重點研發(fā)項目（2022YFS0429）

陳露夢，女，碩士研究生，研究方向為中藥炮制新技術(shù)。E-mail: 491145843@qq.com

楊 明，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制與制劑。E-mail: yangming16@126.com

張定堃，男，博士，副教授，研究方向為中藥制藥與品質(zhì)評價新技術(shù)。E-mail: zhangdingkun@cdutcm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]