丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠眼結膜微循環(huán)的改善作用及機制研究

林 娟，徐 旭，李 新，王玉麗，李曉霞，王德勤，強小杰，陳小凡，許 浚, 6*，張鐵軍*

丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠眼結膜微循環(huán)的改善作用及機制研究

林 娟1，徐 旭2, 3#，李 新2, 3，王玉麗2, 3，李曉霞4，王德勤1，強小杰5，陳小凡5，許 浚2, 3, 6*，張鐵軍2, 3*

1. 廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515 2. 天津藥物研究院 天津市中藥質量標志物重點實驗室，天津 300462 3. 天津藥物研究院 釋藥技術與藥物代謝動力學國家重點實驗室，天津 300462 4. 華北理工大學，河北 唐山 063200 5. 天津中醫(yī)藥大學，天津 300193 6. 天津藥物研究院 中國醫(yī)學科學院藥物代謝新技術創(chuàng)新單元，天津 300462

研究丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠眼結膜微循環(huán)的改善作用及機制。采用復合因素（夾尾、束縛、冰水浴等）建立氣滯血瘀證大鼠模型，造模同時給予丹紅化瘀口服液和阿司匹林進行干預，3周后觀察大鼠眼結膜血管數(shù)、微血管交叉數(shù)、微血管管徑及血流速度；采用ELISA法檢測大鼠血清中6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-F1α）、血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）水平及誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）活性；采用微板法測定大鼠血清中一氧化氮（nitric oxide，NO）水平；采用Western blotting法檢測大鼠眼結膜組織磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（phosphorylated cAMP response-element binding protein，p-CREB）和iNOS蛋白表達情況。與模型組比較，丹紅化瘀口服液組大鼠微血管管徑顯著增大（＜0.05），血流速度加快（＜0.05、0.01），血管數(shù)和微血管交叉數(shù)顯著增多（＜0.05、0.01）；血小板最大聚集率及血清中TXB2/6-keto-F1α、VEGF、cAMP/cGMP、NO水平和iNOS活性均顯著降低（＜0.05、0.01）；眼結膜組織p-CREB和iNOS蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01）。丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀模型大鼠的眼結膜微循環(huán)有改善作用，其作用機制可能與抑制視網膜組織血栓形成、減少細胞自由基生成、抗炎和抑制血管生成有關。

丹紅化瘀口服液；氣滯血瘀；眼結膜微循環(huán)；血栓形成；抗炎；血管生成

視網膜中央靜脈阻塞癥（central retinal vein occlusion，CRVO）是最常見的視網膜血管病，也是致盲眼病之一，主要表現(xiàn)為視力下降、視野缺損、視物變形等。其病因比較復雜，各種原因導致的血液內高凝狀態(tài)、血流減少以及眼局部受壓狹窄等多因素作用引起視網膜中央靜脈血管內皮受損，血栓形成，經脈阻塞，血液回流障礙，造成血液微循環(huán)紊亂[1]。中醫(yī)學理論認為，微循環(huán)障礙屬于血瘀范疇，氣滯血瘀是常見類型；CRVO主要因情志不舒、憂郁悲傷等而致氣機郁滯，血行不暢，血瘀脈阻而溢于目[2]，其中肝氣郁結、肝風內動引起的微循環(huán)障礙最為顯著，主要表現(xiàn)為血管粗細不均、血管扭曲、血流速度變慢等[3]。

丹紅化瘀口服液中丹參、當歸活血化瘀、養(yǎng)血潤燥，川芎、桃仁、紅花化瘀行氣通絡，柴胡、枳殼疏肝解郁、行氣通絡[4]。全方具有活血化瘀、行氣通絡之功效，臨床上用于氣滯血瘀引起的視物模糊、突然不見癥；CRVO的吸收期見上述證候者[5]。本研究根據(jù)丹紅化瘀口服液功能主治，采用大鼠氣滯血瘀證模型，研究其在病理狀態(tài)下全身及局部眼結膜的變化，從中醫(yī)藥“整體觀”和“證候理論”角度探索丹紅化瘀口服液“活血化瘀、行氣通絡”的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級Wistar大鼠，雌雄各半，12周齡，體質量241～268 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0006。動物于天津藥物研究院有限公司實驗動物房屏障環(huán)境飼養(yǎng)，動物使用許可證號SYXK（津）2016-0013，溫度、濕度、換氣次數(shù)由中央系統(tǒng)自動控制，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，通風次數(shù)為10～15次/h全新風，光照為12 h明/12 h暗。動物實驗遵循天津藥物研究院動物福利倫理審查委員會的規(guī)定，符合3R原則。

1.2 藥品與試劑

丹紅化瘀口服液（10 mL/支，批號D17A002）由廣州白云山和記黃埔中藥有限公司提供；阿司匹林腸溶片（100 mg/片，批號BJ34680）購自德國Bayer公司；鹽酸腎上腺素（批號SE8530）購自北京索萊寶生物科技有限公司；6-酮-前列腺素F1α（6-keto-prostaglandin F1α，6-keto-F1α）ELISA試劑盒（批號20180411）、環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）ELISA試劑盒（批號20180418）、環(huán)磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）ELISA試劑盒（批號20180418）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）ELISA試劑盒（批號20180418）、一氧化氮（nitric oxide，NO）試劑盒（批號20180418）購自南京建成生物工程研究所；血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）ELISA試劑盒（批號2018S145）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）ELISA試劑盒（批號X11013386）購自武漢華美生物工程有限公司；β-actin抗體（批號MD6338）、HRP標記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號MD2142）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號MD2141）、iNOS抗體（批號MD1873）購自北京百奧思科生物醫(yī)學技術有限公司；磷酸化cAMP反應元件結合蛋白（phosphorylated cAMP response-element binding protein，p-CREB）抗體（批號9198）購自美國CST公司。

1.3 儀器

BI-2000A+型微循環(huán)觀測分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；Multiskan GO型全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；LG-PABER-1型凝血分析儀（北京世帝科學儀器有限公司）；LBY-NJ4型血小板聚集儀器（北京普利生儀器有限公司）；BG-subMIDI型電泳儀（北京百晶生物技術有限公司）；電泳儀、170-8280型ChemiDocMP化學發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；GelDoc-It310型凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）。

2 方法

2.1 氣滯血瘀證大鼠模型制備

大鼠采用復合因素干預法模擬人體因情志不遂等因素造成氣機阻滯、血行瘀阻的病理狀態(tài)。Wistar大鼠適應期喂養(yǎng)1周后，給予以下刺激：①夾尾，用夾子裹上紗布夾住大鼠的尾巴，使其保持憤怒狀態(tài)；②束縛，將大鼠裝在窄布套里，用夾子夾住出口，使其不能自由活動；③冰水浴，1～4 ℃冰水??；④傾斜，45°傾斜鼠籠；⑤懸尾，用棉線系在大鼠尾根下2～3 cm處，另一端固定在高處，使大鼠倒懸空中；⑥晝夜顛倒，白天關燈，夜晚亮燈；⑦禁食，禁食24 h。每天給予1種刺激，連續(xù)刺激3周。造模最后1 d大鼠背部sc 1%鹽酸腎上腺素（0.8 mg/kg）。

2.2 分組與給藥

大鼠隨機分為對照組、模型組和丹紅化瘀口服液低、中、高劑量（3.25、6.50、13.00 mL/kg，分別相當于臨床劑量的0.5、1、2倍）組和阿司匹林（10 mg/kg）組，每組10只。除對照組外，其余大鼠采用復合刺激因素制備氣滯血瘀模型，造模同時各給藥組ig相應藥物（10 mL/kg），對照組和模型組大鼠ig等體積無菌飲用水，1次/d，連續(xù)3周。

2.3 丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠眼結膜微循環(huán)變化的影響

末次給藥后1 h，大鼠麻醉側臥位固定，分開左眼眼瞼，采用微循環(huán)觀測分析系統(tǒng)物鏡對準大鼠左眼，并以冷光源上補光，調節(jié)焦距，3倍放大觀察結膜血管數(shù)、交叉點和血管徑，9倍放大測定大鼠結膜微循環(huán)血流速度。

2.4 丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠血小板聚集率及血清6-keto-F1α、TXB2、VEGF、cAMP、cGMP、NO水平和iNOS活性的影響

觀察結束后，大鼠腹主動脈取血1.8 mL，枸櫞酸鈉抗凝，以500 r/min離心15 min分離出富含血小板血漿，再以3500 r/min離心15 min分離出貧血小板血漿。除對照組外，以終濃度5 μmol/L的二磷酸腺苷進行誘導，采用比濁法測定血小板聚集率。

另取血3 mL，3500 r/min離心15 min，分離血清，采用ELISA法測定6-keto-F1α（前列環(huán)素穩(wěn)定代謝產物）、TXB2（血栓素穩(wěn)定代謝產物）、VEGF、cAMP、cGMP水平和iNOS活性；采用微板法測定血清NO水平。

2.5 丹紅化瘀口服液對對氣滯血瘀證大鼠眼結膜組織p-CREB和iNOS蛋白表達的影響

各組大鼠分離眼球結膜組織，加入蛋白裂解液，制備勻漿，提取蛋白并定量。蛋白樣品經電泳、轉膜、封閉后，分別加入p-CREB、iNOS和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜，漂洗后加入HRP標記的山羊抗小鼠/兔IgG抗體，室溫孵育2 h，漂洗后用ECL化學發(fā)光試劑顯影，采用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.6 統(tǒng)計方法

3 結果

3.1 一般情況觀察

對照組大鼠毛色白凈、順滑、有光澤，活動正常有規(guī)律；模型組大鼠毛色灰暗少光澤，出現(xiàn)易怒、暴躁、喜打斗等表現(xiàn)；各給藥組大鼠亦出現(xiàn)易怒、暴躁、打斗等行為，但較模型組癥狀減輕。

3.2 丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠眼結膜微循環(huán)變化的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠眼結膜血管計數(shù)、血管交叉數(shù)顯著減少（＜0.01），管徑變窄（＜0.01），血液流速減慢（＜0.01）。與模型組比較，丹紅化瘀口服液各劑量組微血管管徑顯著增大（＜0.05），血流速度加快（＜0.05、0.01）；丹紅化瘀口服液高劑量組血管計數(shù)顯著增加（＜0.01），微血管交叉數(shù)增多（＜0.01）；丹紅化瘀口服液中劑量組血管交叉數(shù)增多（＜0.05）。表明丹紅化瘀口服液可不同程度地改善氣滯血瘀證大鼠眼結膜微循環(huán)。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.3 丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠血小板聚集率及血清6-keto-F1α、TXB2、VEGF、cAMP、cGMP、NO水平和iNOS活性的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠血小板最大聚集率及血清中TXB2/6-keto-F1α、VEGF、cAMP/cGMP、NO水平和iNOS活性均顯著升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，丹紅化瘀口服液各劑量組血清中NO水平和iNOS活性均顯著降低（＜0.01），丹紅化瘀口服液中、高劑量組血小板最大聚集率及血清TXB2/6-keto-F1α、VEGF水平均顯著降低（＜0.05、0.01），丹紅化瘀口服液高劑量組血清cAMP/cGMP水平顯著降低（＜0.05）。

圖2 丹紅化瘀口服液對氣滯血瘀證大鼠血小板聚集率及血清TXB2/6-keto-F1α、VEGF、cAMP/cGMP、NO水平和iNOS活性的影響(, n = 10)

3.4 丹紅化瘀口服液對對氣滯血瘀證大鼠眼結膜組織p-CREB和iNOS蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組大鼠眼結膜組織p-CREB和iNOS蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，丹紅化瘀口服液各劑量組大鼠眼結膜組織p-CREB和iNOS蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01）。

圖3 丹紅化瘀口服液對對氣滯血瘀證大鼠眼結膜組織p-CREB和iNOS蛋白表達的影響(, n = 10)

4 討論

丹紅化瘀口服液為理血劑，具有活血化瘀、行氣通絡的功效，用于氣滯血瘀引起的視物模糊不清、突然不見癥；CRVO的吸收期見上述證候者。本研究采用多種刺激因素造成大鼠慢性長期應激狀態(tài)，形成氣滯血瘀中醫(yī)證候病理模型。應激的最基本反應是交感神經腎上腺髓質反應，使外周小血管收縮、微循環(huán)灌流量少，導致組織缺血；研究表明兒茶酚胺促使血小板聚集，小血管內的血小板聚集可引起組織缺血[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，丹紅化瘀口服液可改善氣滯血瘀證大鼠眼結膜微循環(huán)，從而減輕組織缺血。血栓素A2主要是由血小板微粒體合成并釋放的一種具有強烈促進血管收縮和血小板聚集的生物活性物質，其生物半衰期約30 s，迅速代謝為無活性的TXB2。前列環(huán)素是血栓素的對抗劑，具有抗血小板和舒張血管的作用，它的合成減少可促進血栓形成，6-keto-F1α是前列環(huán)素在血液中穩(wěn)定代謝產物[7]。本研究結果發(fā)現(xiàn)丹紅化瘀口服液可降低氣滯血瘀證大鼠血清TXB2/6-keto-F1α水平，推測丹紅化瘀口服液改善眼結膜微循環(huán)的作用機制與降低血栓素與前列環(huán)素比值有關。

應激時腎上腺素及去甲腎上腺素2種激素與肝細胞膜及肌細胞膜上的β2腎上腺素能受體結合，通過G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶形成cAMP，通過一系列的酶聯(lián)反應，促進糖原磷酸化酶的活化，并抑制糖原合成酶，從而有效地使血糖維持在較高水平，是心率加快的能量保障[8]，在微循環(huán)障礙的情況下，進一步促使血壓增高，成為CRVO的不利因素。本研究發(fā)現(xiàn)丹紅化瘀口服液可降低cAMP/cGMP，可能對降低應激性高血糖、應激性高血壓，進而保護視網膜血管有益。

在高血糖、氧化應激、缺血缺氧等因素刺激下機體可產生大量的NO[9]。NO具有雙重效應，即主要由血管內皮細胞經一氧化氮合成酶催化產生的低水平NO，可以通過血管舒張等發(fā)揮對機體的保護作用；而在高血糖、氧化應激、缺血及缺氧等因素刺激下，由iNOS催化產生的大量的NO可以通過與過氧化物反應產生一種強氧化性的活性氮產物——過氧亞硝酸鹽。此時大量的NO是一種重要自由基，具有嚴重的細胞毒性作用，造成器官損害和炎癥反應[10]。本研究結果表明，丹紅化瘀口服液可不同程度地降低iNOS活性，減少NO含量，利于保護正常細胞，減少血管炎癥反應。

VEGF是與新生血管關系最為密切的多肽生長因子，在血管炎癥時釋放，能夠誘導間質膠原酶、金屬蛋白酶和纖維蛋白溶酶原激活劑的生成，活化纖溶酶原，加速小靜脈和毛細血管出現(xiàn)裂隙，從而增加血管通透性，是潛在的單核細胞化學趨化因子。VEGF可誘導內皮細胞黏附分子表達，造成周圍血管水腫，是引起視網膜水腫的主要機制之一[11]。本研究結果表明，丹紅化瘀口服液可降低血清VEGF水平，利于改善視網膜水腫，其機制可能與抑制上游cAMP/蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）/CREB信號通路，減少CREB磷酸化有關。

本研究發(fā)現(xiàn)丹紅化瘀口服液具有多靶點的活血化瘀作用，能夠降低血栓素與前列環(huán)素比值，提高抗栓功能；降低cAMP/cGMP，減輕應激反應；降低iNOS活性，減少NO自由基，減輕血管氧化損傷；減少CREB磷酸化，減少VEGF含量，降低血管通透性，減輕視網膜水腫。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Danhong Huayu Oral Liquid on conjunctival microcirculation of rats withstagnation and blood stasis

LIN Juan1, XU Xu2, 3, LI Xin2, 3, WANG Yu-li2, 3, LI Xiao-xia4, WAND De-qin1, QIANG Xiao-jie5, CHEN Xiao-fan5, XU Jun2, 3, 6, ZHANG Tie-jun2, 3

1. Guangzhou Baiyunshan Hutchison Whampoa Chinese Medicine Co., Ltd., Guangzhou 510515, China 2. Tianjin Key Laboratory of Quality Markers of Traditional Chinese Medicine, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. State Key Laboratoty of Drug Delivery Technology and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 4. North China University of Science and Technology, Tangshan 063200, China 5. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300193, China 6. Research Unit for Drug Metabolism, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China

To study the effect and mechanism of Danhong Huayu Oral Liquid (丹紅化瘀口服液) on conjunctival microcirculation in rats withstagnation and blood stasis.Rats model withstagnation and blood stasis syndrome was established by compound factors (tail clip, restraint, ice water bath, etc.), at the same time, Danhong Huayu Oral Liquid and aspirin were given for intervention. After 3 weeks, number of blood vessels, number of microvascular crossings, microvascular diameter and blood flow rate of conjunctiva were observed; ELISA method was used to detect 6-keto-prostaglandin F1α (6-keto-F1α), thromboxane B2(TXB2), vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclic adenosine monophosphate (cAMP), cyclic guanosine monophosphate (cGMP) levels and inducible nitric oxide synthase (iNOS) activity in serum of rats; Nitric oxide (NO) level in serum of rats was determined by microplate method; Phosphorylated cAMP response-element binding protein (p-CREB) and iNOS protein expression in eye conjunctiva of rats was detected by Western blotting.Compared with model group, number of blood vessels, number of microvascular crossings, microvascular diameter and blood flow rate in Danhong Huayu Oral Liquid group were significantly increased (< 0.05, 0.01); Maximum platelet aggregation rate and levels of TXB2/6-keto-F1α, VEGF, cAMP/cGMP, NO and iNOS activity in serum were significantly decreased (< 0.05, 0.01); p-CREB and iNOS protein expressions in conjunctiva of rats were significantly decreased (< 0.05, 0.01).Danhong Huayu Oral Liquid can improve the conjunctival microcirculation ofstagnation and blood stasis model rats, and its mechanism may be related to inhibiting retinal tissue thrombosis, reducing cell free radical generation, anti-inflammation and inhibiting angiogenesis.

Danhong Huayu Oral Liquid;stagnation and blood stasis; conjunctival microcirculation; thrombosis; anti-inflammation; angiogenesis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)06 - 1628 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.004

2021-09-07

廣州市珠江科技新星專項資助（201806010082）；廣州市科學技術協(xié)會2019年“廣州市院士專家工作站”建設項目資助（600180）；中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程項目資助（2019-I2M-5-020）

林 娟（1986—），女，碩士，研究方向為中成藥藥理與臨床研究。Tel: (020)66282359 E-mail: 578045600@qq.com

張鐵軍，研究員，研究方向為中藥新藥研發(fā)及中藥大品種二次開發(fā)。Tel: (022)23006848 E-mail: zhangtj@tjipr.com

許 浚，研究員，研究方向為中藥質量及大品種二次開發(fā)。E-mail: xuj@tjipr.com

#共同第一作者：徐 旭（1976—），男，研究員，研究方向為中藥新藥發(fā)現(xiàn)和藥理研究。Tel: (022)23006846 E-mail: xux@tjipr.com

[責任編輯 李亞楠]