健腦安神片中10 個(gè)成分的含量測定及其主成分分析和聚類分析

喬晶晶，張 燕，劉 霞，董建彬， 張偉靖*

（1.榆林市第一醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，陜西 榆林 719000；2.榆林市第一醫(yī)院 骨科，陜西 榆林 719000)

健腦安神片收載于2020 版《中國藥典》（一部），由酒黃精、淫羊藿、枸杞子、鹿茸、南五味子、制遠(yuǎn)志、熟地黃等十六味中藥組成，具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、鎮(zhèn)靜安神等作用，用于治療神經(jīng)衰弱、頭痛、頭暈等癥[1]。方中淫羊藿中主要含有朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、寶藿苷I 等成分，其有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[2-3]，本院應(yīng)用及臨床報(bào)道療效較好[4-6]。盡管臨床應(yīng)用較為滿意，但該產(chǎn)品的基礎(chǔ)研究報(bào)道較少，有健腦安神片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其中淫羊藿苷定量的的研究[7-9]，未發(fā)現(xiàn)關(guān)于采用HPLC 法同時(shí)分析該制劑中10 個(gè)活性成分（即：5-羥甲基糠醛、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、毛蕊花糖苷、3，6’-二芥子?；崽?、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、寶藿苷I）的研究報(bào)道。因此筆者欲通過采用HPLC 法測定健腦安神片中的10個(gè)活性成分，并進(jìn)行主成分分析與聚類分析，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，為進(jìn)一步研究該制劑在體內(nèi)藥代動力學(xué)及組織分布奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

島津NexeraXR 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；乙腈（色譜純，批號：LOT106246）、甲醇（色譜純，批號：LOT110301），均購于美國Fisher公司；5-羥甲基糠醛（批號：HH248894198）、遠(yuǎn)志酮Ⅲ（批號：HP124420，純度≥98.0%）、毛蕊花糖苷（批號：HA141444，純度為98.0%）、3,6’-二芥子酰基蔗糖（批號：HD124612，純度為98.0%）、淫羊藿次苷I（批號：HI008679，純度≥98.0%）、朝藿定A（批號：HE008056，純度≥98.0%）、朝藿定B（批號：HE008057，純度≥98.0%）、朝藿定C（批號：HE008058，純度≥98.0%）、淫羊藿苷（批號：HI008055，純度≥98.0%）、寶藿苷I（批號：HB008053，純度≥98.0%），均購于寶雞辰光生物技術(shù)有限公司；健腦安神片（批號：190808-190814，200908-200916，編號為S1-S15；規(guī)格：0.21 g ×12片× 3 板/盒，江西藥都樟樹制藥有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采 用Shim-pack Scepter C18色 譜 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.15%甲酸水溶液溶液(A)-乙腈（B），梯度洗脫：0 ～10 min，A 96% → 92%；10 ～45 min，A 92% → 80%；45 ～120 min，A 80% →50%。記錄時(shí)間：120 min；流速：0.8 mL/min；柱溫：20 ℃；檢測波長：300 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 混合對照品溶液的配制

2.3 供試品溶液的制備

取本品20 片，除薄膜衣，研細(xì)，混勻，稱取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50%甲醇25 mL，稱定重量，超聲（功率：200 W，頻率：40 KHz）處理45 min，取出，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足失重，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液得到供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方比例[1]分別制成缺淫羊藿、黃精、遠(yuǎn)志、地黃的模擬制劑，再依據(jù)“2.3”項(xiàng)，制備缺淫羊藿的陰性對照溶液（即：朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、寶藿苷I 陰性對照溶液）、缺黃精的陰性對照溶液（即：5-羥甲基糠醛陰性對照溶液）、缺遠(yuǎn)志的陰性對照溶液（即：遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6’-二芥子?；崽顷幮詫φ杖芤海?、缺地黃的陰性對照溶液（即：毛蕊花糖苷陰性對照溶液）。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取儲備液0.01、0.05、0.25、0.50、0.75 mL置于1 mL容量瓶中，分別加甲醇定容，混勻，即得系列混合對照溶液。用0.45 μm 微孔濾膜濾過，進(jìn)樣。以各對照品的濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。線性回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)r，見表1。結(jié)果表明，10 種對照品在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 對照品的線性方程與濃度范圍及相關(guān)系數(shù)Tab.1 Linear equations and their concentration range of the reference substance

2.6 專屬性試驗(yàn)

分別精密量取混合對照溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各20 μL 進(jìn)樣，分別記錄色譜圖，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。結(jié)果表明陰性對照無干擾，專屬性強(qiáng)。

圖1 混合對照、供試品與陰性對照HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of mixed control, test substance and negative control

2.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液（批號：200908），重復(fù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果測得5-羥甲基糠醛、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子?；崽?、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、寶藿苷I 峰面積的RSD 值分別為1.02%、0.87%、1.16%、1.05%、0.88%、0.95%、0.81%、0.94%、1.21%、1.34%，表明精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下制備的供試品溶液（批號：200908），在第0、3、6、9、16、24 h 進(jìn)樣。結(jié)果5-羥甲基糠醛、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子?；崽?、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、寶藿苷I 峰面積的RSD 值分別為1.24%、1.18%、1.25%、1.32%、1.15%、1.09%、1.16%、1.23%、1.14%、1.39%，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取樣品（批號：200908）6 份，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.1”項(xiàng)下條件測定。測得5-羥甲基糠醛、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3, 6’-二芥子?；崽?、毛蕊花糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I、寶藿苷I 平均含量的RSD 值分別為2.11%、1.49%、0.85%、1.62%、1.93%、1.04%、0.87%、1.09%、 1.76%、1.85%，表明該法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn)

取本品（批號：200908）內(nèi)容物，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，重復(fù)制樣6 份，結(jié)果見表2，表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Test results of sample recovery

2.11 含量測定

精密稱取10 批樣品，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品，按“2.1”項(xiàng)下條件測定。5-羥甲基糠醛、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、3,6’ -二芥子酰基蔗糖、毛蕊花糖苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I 及寶藿苷I 的含量及RSD 值見表3。

表3 15 批健腦安神片中10 種成分含量試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Test results of 10 components in 15 batches of Jiannaoanshen tablets

2.12 聚類分析

運(yùn)用SPSS 26.0 軟件，以15 批次健腦安神片10種功效成分的含量為數(shù)據(jù)樣本，采用組間聯(lián)接法，以平方歐氏距離為測度，進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析[20-21]，結(jié)果見圖2。依據(jù)聚類分析樹狀圖，當(dāng)類間距離為20 時(shí)，15 批樣品可聚為2 類，S5、S15、S6、S4、S14、S2、S12、S8、S9 為第I 類，S3、S13、S1、S11、S7、S10為第Ⅱ類；當(dāng)類間距離為15 時(shí)，15 批樣品可聚為3類，S5、S15、S6、S4、S14、S2、S12、S8、S9 為 第Ⅰ類，S3、S13、S1、S11、S7 為第Ⅱ類，S10 為第Ⅲ類；當(dāng)類間距離小于10 時(shí)，分為4 大類，S5、S15、S6、S4、S14 為 第Ⅰ類，S2、S12、S8、S9 為 第Ⅱ類，S3、S13、S1、S11、S7 為第III 類，S14 為第IV類。結(jié)果顯示健腦安神片中所測10 種成分的含量差異可能與健腦安神片生產(chǎn)所用原藥材的種屬來源、產(chǎn)地、生長年限、采收季節(jié)及加工炮制方式等因素有關(guān)。

圖2 15 批健腦安神片聚類分析樹狀圖Fig.2 Cluster analysis tree diagram of 15 batches of Jiannaoanshen tablets

2.13 主成分分析

采用SPSS 26.0 軟件對15 批次健腦安神片中10 種成分進(jìn)行主成分分析[10-11]，主成分特征值和方差貢獻(xiàn)率見表4，初始因子載荷矩陣見表5。由表4 可知，以累計(jì)方差貢獻(xiàn)率 > 87%，初始特征值>1 為提取標(biāo)準(zhǔn)，前四個(gè)主成分初始特征值分別為：3.224、2.517、1.703、1.353，對應(yīng)方差貢獻(xiàn)率分別為32.236%、25.168%、17.030%、13.535%。由表5 可知，朝藿定A、淫羊藿次苷I、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子?；崽菍χ鞒煞? 貢獻(xiàn)率高，毛蕊花糖苷、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、寶藿苷I、淫羊藿苷對主成分2 貢獻(xiàn)率高，淫羊藿苷、朝藿定C、遠(yuǎn)志酮Ⅲ對主成分3 貢獻(xiàn)率顯著，5-羥甲基糠醛、遠(yuǎn)志酮Ⅲ對主成分4 貢獻(xiàn)率顯著。各成分?jǐn)?shù)與特征值的關(guān)系可通過PCA 碎石圖表示，見圖3。

圖3 樣品PCA 碎石圖Fig.3 PCA scree plot of various samples

表4 主成分方差分析Tab.4 Analysis of variance for PCA

表5 初始因子載荷矩陣Tab.5 Initial factor load matrix

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

使用二極管陣列檢測器對健腦安神片樣品進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果表明10 個(gè)成分的最大吸收波長分別為：5-羥甲基糠醛（284 nm）、遠(yuǎn)志酮Ⅲ與3, 6’-二芥子酰基蔗糖（302 nm）、毛蕊花糖苷（330 nm）、朝藿定A 和朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I 及寶藿苷I（270、319 nm），因此，將300 nm作為10 種成分的檢測波長。本品為中藥復(fù)方，成分復(fù)雜，所以采用梯度洗脫；比較選擇不同流動相系統(tǒng)如：乙腈-磷酸水（0、0.05%、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%）、甲醇-水（0、0.1%、0.2%、0.5%、1.0%）、乙腈-醋酸水（0.10%、0.20%、0.50%）、乙腈（或甲醇）-甲酸水（0、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.50%）等，比較不同柱溫（20、30、35℃）、不同流速（0.5、0.6、0.8、0.9、1.0 mL/min）；結(jié)果表明色譜條件（流動相為乙腈-0.15%甲酸水進(jìn)行梯度洗脫，柱溫為20℃，流速為0.8 mL/min）具有較好分離度及較為理想的峰形等優(yōu)勢，故將此條件作為檢測色譜條件。

3.2 供試品制備方法

本制劑制由生藥粉、水提物及醇提物等制成[1]。研究比較了提取溶劑如：甲醇（0、50%、70%、100%），乙醇（0、50%、70%、95%）；提取方法如：回流提?。?0、45、60 min），超聲提?。?5、30、45、60 min）等。結(jié)果表明超聲處理制備方法操作簡便、色譜信息豐富，明顯優(yōu)于加熱回流制備方法；選擇50%甲醇作為提取溶劑目標(biāo)物色譜峰峰面積大，優(yōu)于其它溶劑及濃度；超聲處理時(shí)間小于45 min 目標(biāo)物色譜峰峰面積較??；大于45 min 目標(biāo)物色譜峰峰面積并沒有增加。綜合上述各因素選擇50%甲醇超聲處理45 min 作為供試品制備方法，該方法具有色譜峰信息理想、分離度好等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

黃精含有5-羥甲基糠醛，所以制備陰性對照供試品時(shí)需要減去黃精；毛蕊花糖苷僅在地黃中含有，制備陰性對照時(shí)需要去掉地黃；遠(yuǎn)志中含有遠(yuǎn)志酮Ⅲ與3, 6’-二芥子?；崽?，故制備陰性對照時(shí)需要去掉遠(yuǎn)志；淫羊藿中含有朝藿定A 和朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、淫羊藿次苷I 及寶藿苷I，所以制備陰性對照供試品時(shí)需要減去淫羊藿。

3.4 主成分與聚類分析

通過對健腦安神片中所測10 種成分的含量聚類分析，分為兩大類，含量差異可能與健腦安神片生產(chǎn)所用原藥材的種屬來源、產(chǎn)地、生長年限、采收季節(jié)及加工炮制方式等因素有關(guān)。主成分分析顯示，前4個(gè)主成分基本可反映各成分全部信息，能以其對樣品質(zhì)量進(jìn)行控制，其中，主成分1 主要反映朝藿定A、毛蕊花糖苷、3, 6’-二芥子?；崽呛辛啃畔?，主成分2 主要反映朝藿定A、寶藿苷I、淫羊藿次苷I、毛蕊花糖苷、遠(yuǎn)志酮Ⅲ、朝藿定C 含有量信息，主成分3 主要反映淫羊藿苷、朝藿定C、朝藿定B含有量信息，而主成分4 主要反映5-羥甲基糠醛、淫羊藿苷、毛蕊花糖苷、遠(yuǎn)志酮Ⅲ成分含有量信息。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了15 批健腦安神片樣品中10 種成分的HPLC 含量測定方法，該方法操作簡單、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)，可用于健腦安神片的質(zhì)量控制，同時(shí)10 種成分的定量分析也為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。