不同來源虎杖指紋圖譜研究

曾 梅，孫 晶，范 蓓，劉 聰,3，李 燦，劉湘丹,4,5，王鳳忠*,周日寶,4,5*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，北京 100193；3.長沙衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；4.湘產(chǎn)大宗道地藥材種質(zhì)資源及規(guī)范化種植重點研究室，湖南 長沙 410208；5.湖南省普通高等學(xué)校中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南 長沙 410208）

中藥材虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根及根莖，屬多年生草本[1]，我國大部分地區(qū)均有分布，主產(chǎn)于江蘇、江西、四川、湖南等地[2]。虎杖性寒、味苦，歸肝、肺、膽經(jīng)，主要含有蒽醌類、黃酮類、二苯乙烯類等化合物[3-5]，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰的功效。臨床用于治療風(fēng)濕痹痛、痰多咳嗽、跌打損傷等癥[6]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，虎杖藥材質(zhì)量的相關(guān)研究大多數(shù)僅以不同產(chǎn)地作為研究點，同時進行不同采收時間、生長年限、土壤類型、產(chǎn)地環(huán)境虎杖藥材質(zhì)量的研究未見報道。筆者廣泛收集了不同采收時間、不同生長年限、不同土壤類型、不同產(chǎn)地環(huán)境等多種類型的虎杖藥材樣品，利用高效液相色譜法建立虎杖指紋圖譜，以期為中藥材虎杖的質(zhì)量控制及進一步開發(fā)利用虎杖資源提供實驗依據(jù)[7]。

1 材料

1.1 儀器

SK8200 型超聲波清洗機（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限 公 司）；Agilent Technologies 1260 Inginity 型 高 效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；BCD-452 WDPF 型冰箱（青島海爾服務(wù)有限公司）；Eco-S15型實驗室純水系統(tǒng)（上海和泰儀器有限公司）；ME204E/02 型電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）公司］；YF-500 型高速中草藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）。

1.2 試劑與藥材

甲醇（分析純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；磷酸（分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司）；乙腈（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆?；虎杖苷對照品（純度?8%，批號：B20533），白藜蘆醇對照品（純度≥98%，批號：B20044），蒽苷B 對照品（純度≥98%，批號：B20241），大黃素對照品（純度≥98%，批號：B20241），大黃素甲醚對照品（純度≥98%，批號：B20242）均購于上海源葉有限公司。

課題組于2018 年和2019 年分別從不同產(chǎn)地收集了18 批虎杖藥材樣品，樣品由湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源教研室周日寶教授鑒定為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根和根莖，具體信息見表1。

表1 虎杖樣品信息表Tab.1 Sample information table of Polygonum cuspidatum

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm ×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）和0.1%磷酸水溶液（B），按照以下色譜條件洗脫：0 ～ 10 min，80%→73%；10 ～ 18 min，73%→65%；18 ～ 24 min，65%→55%；24 ～ 34 min，55%→5%；34 ～ 40 min，5%→80%；流速：1.0 mL/min；色譜柱溫度：25℃；進樣量：10 μL；檢測波長：287 nm。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取虎杖苷0.026 0 g、白藜蘆醇0.003 8 g、大黃素0.005 0 g、大黃素甲醚0.022 0 g、蒽苷B 0.003 2 g、置于10 mL 容量瓶中，再精密加入80%甲醇溶解，定容，用0.45 μm 微孔濾膜過濾，密封保存于4 ℃避光處，備用。

2.3 供試品溶液制備

精密稱取虎杖樣品細粉（過6 號篩）0.500 0 g，置于100 mL 錐形瓶中，精密加入50 mL 80%甲醇，進行稱重，超聲（20 KHz、25℃）30 min后取出再稱重，如重量減失，用80%甲醇補足失重，搖勻，經(jīng)過濾后取適量續(xù)濾液，再用0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取S18 號樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣6 次，以虎杖苷作為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.64 %，相對峰面積RSD 均小于1.20%，說明儀器有較好的精密度。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取S18 號樣品6 份，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣。以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.38%，相對峰面積RSD 均小于1.80%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取S18 號樣品，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下分別于0、2、6、8、10、12 h 進樣，以虎杖苷為參照峰，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.38%，相對峰面積RSD 均小于2.00%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.5 指紋圖譜建立

2.5.1 不同來源虎杖圖譜 按照“2.3”項下方法，取表1 中的各批虎杖樣品制備成供試品溶液，并且按照“2.1”項色譜條件進行進樣。接著采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”對各樣品的HPLC 色譜圖進行數(shù)據(jù)匹配，生成對照圖譜R，并計算相似度。軟件計算得出，18 批不同來源虎杖樣品，共檢測到55 個色譜峰，確定了其中10 個峰為共有峰，占總峰面積的85.41%，18批虎杖指紋圖譜見圖1。

圖1 不同來源虎杖HPLC 指紋譜圖Fig.1 HPLC fingerprint spectra of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.2 參照峰選擇 與對照品保留時間比對后，指認了五種成分，分別為2 號峰（虎杖苷）、5 號峰（白藜蘆醇）、6 號峰（蒽苷B）、8 號峰（大黃素）、10 號峰（大黃素甲醚）。其中，虎杖苷為二苯乙烯類化合物，文獻研究發(fā)現(xiàn)其具有擴張血管、溶血栓、抑制血小板凝集和改善血液循環(huán)、抗菌、抗休克等作用[8-11]，且在各批虎杖樣品中分離良好，峰形穩(wěn)定，峰面積較大且為所有樣品共有，故確定虎杖苷為參照峰（S），虎杖對照圖譜見圖2。

2.5.3 相似度評價 將18 批虎杖藥材指紋圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件，按照“2.5.1”項下方法分析，計算樣品與對照圖譜R 的相似度，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，18 批虎杖樣品相似度為0.941 ～ 0.999，表明18 批虎杖樣品化學(xué)成分相似性較高。計算各批虎杖樣品的共有峰峰面積及相對保留時間的RSD，結(jié)果見表3，由結(jié)果可以得出各批樣品質(zhì)量具有較大差異。

表2 不同來源虎杖相似度計算結(jié)果Tab.2 Similarity calculation results of Polygonum cuspidatum from different sources

表3 不同來源虎杖共有峰平均相對保留時間及峰面積Tab.3 Average relative retention time and peak area of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.4 聚類分析 以各共有峰的峰面積為變量，以歐氏距離為測度，采用IBM SPSS Statistics 軟件以組間聯(lián)接法對不同來源虎杖進行聚類分析，結(jié)果見圖3。由圖3 可知，從閾值5 處，18 批不同虎杖樣品可聚為6 類：S18 為一類；S15、S12、S14、S16 為一類；S13 為一類；S4、S11、S9 為一類；S1、S2、S3 為一類；S5、S8、S6、S7、S17、S10 為一類。

圖3 不同來源虎杖聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis tree of Polygonum cuspidatum from different sources

2.5.5 主成分分析 主成分分析（PCA）是指為了達到簡化分析的目的，在盡量保持原有信息的條件下，將個數(shù)比較多且存在相關(guān)性的指標轉(zhuǎn)換成個數(shù)較少且彼此獨立或不相關(guān)的綜合性指標[12]。本實驗將18 批不同來源虎杖樣品的10 個共有峰峰面積導(dǎo)入IBM SPSS Statistics 軟件，對共有峰峰面積進行主成分分析，特征值及貢獻率結(jié)果見表4，旋轉(zhuǎn)變化后的成分矩陣見表5，應(yīng)用IBM SPSS 軟件進行主成分分析后數(shù)據(jù)窗口最后列出3 個主成分的因子得分值再計算綜合得分，根據(jù)綜合得分情況對18 批虎杖藥材進行排序，結(jié)果見表6，排名越靠前說明虎杖質(zhì)量越好。

表4 虎杖PCA 的特征值與貢獻率結(jié)果Tab.4 Characteristic values and contribution rate of PCA of Polygonum cuspidatum

表5 虎杖PCA 成分矩陣Tab.5 PCA component matrix of Polygonum cuspidatum

表6 18 批虎杖主成分得分及排名Tab.6 Principal component scores and ranking of 18 batches of Polygonum cuspidatum

由表4 可知前面三個主成分的特征值均大于1，且累計貢獻率為78.971%，表明前三個主成分可以代表所有成分進行分析，從表5 可以看出，第一主成分主要來自1、2、3、4、6、8、10 號峰，第二主成分主要來自于5、9 號峰，第三主成分主要來自于7 號峰。經(jīng)查閱數(shù)據(jù)及與對照品對照，第一主成分為虎杖苷、蒽苷B、大黃素、大黃素甲醚，第二主成分為白藜蘆醇。表明虎杖苷、白藜蘆醇在特征變量的重要性評估中具有優(yōu)勢，主成分分析綜合排序結(jié)果與聚類分析結(jié)果相類似，進一步證實該分析方法可用于藥材質(zhì)量的評價。

3 討論

預(yù)實驗進行了不同比例（50%、80%、100%）甲醇、不同提取時間（15、30、45、60 min）、不同提取方法（超聲、回流、浸漬）的供試品制備對比研究，研究發(fā)現(xiàn)，80%甲醇超聲提取30 min，供試品色譜峰面積較大、分離度較好，且實驗成本相對較低，故本研究采用80%甲醇為提取溶劑、超聲提取30 min進行供試品提取。

采用了UV 檢測器對虎杖供試品溶液進行200 ～400 nm 全波長掃描，發(fā)現(xiàn)虎杖苷和白藜蘆醇在310 nm左右有最大吸收，大黃素、大黃素甲醚、蒽苷B 在287 nm 處有最大吸收，且指紋圖譜色譜峰較多，峰形及分離度較好，綜合考慮確定最佳掃描波長為287 nm。

在HPLC指紋圖譜中，不同來源虎杖相似度0.941 ～0.999，表明不同來源的虎杖化學(xué)成分無顯著差異；結(jié)合各共有峰峰面積RSD 結(jié)果及聚類分析、主成分分析結(jié)果得出不同來源虎杖質(zhì)量有明顯差異；結(jié)合聚類分析結(jié)果，主成分綜合得分情況排名前三的樣品被聚為一類，包括在8 月至9 月之間采收的三批耕地種植的三年生虎杖，進一步說明了這三批藥材的質(zhì)量最佳。提示在虎杖栽培中，為提高產(chǎn)量可選擇耕地栽種三年，虎杖采挖時間應(yīng)選擇8 月至9 月這一時間段。

4 結(jié)論

本研究建立了不同來源虎杖藥材HPLC 指紋圖譜分析方法，結(jié)合相似度計算、聚類分析、主成分分析三種分析方法進行不同來源虎杖中藥材質(zhì)量評價分析，所建HPLC 指紋圖譜可用于綜合評價不同來源虎杖質(zhì)量，可為虎杖藥材的質(zhì)量控制提供參考。