芋螺多肽AuIB對小鼠骨癌痛的影響及其作用機制

陳海韶 劉震 李俊達 寧星 趙璐 李華道 潘靈輝

癌痛是臨床晚期癌癥患者最常見的癥狀之一，根據(jù)WHO最新公布的數(shù)據(jù)顯示，目前全球每年新增的癌癥患者中有51%～62%的患者伴隨不同程度的疼痛，其中60%為中重度疼痛［1］。研究顯示，約有40%的癌痛患者得不到有效治療和控制，其中高達75%～95%的晚期癌癥患者承受劇烈疼痛，且大部分癌性疼痛患者未得到充分治療，疼痛完全緩解率不足10%［2-3］。因此，緩解癌癥患者疼痛是臨床醫(yī)師亟需解決的一大難題。芋螺多肽AuIB從菲律賓食肉圓錐螺毒液中分離出來，含15個氨基酸殘基，能選擇性抑制α3β4煙堿乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs）［4］。研究顯示，煙堿乙酰膽堿受體的多個不同亞型在體外培養(yǎng)的背根神經(jīng)節(jié)中表達并具有藥理活性，其中α3β4的煙堿乙酰膽堿受體（包括α3β4亞型）主要在傷害性背根神經(jīng)節(jié)中表達，表明該亞型可能參與傷害性和炎癥性神經(jīng)元信號傳導［5］。有研究報道尼古丁通過與nAChRs結合導致下游激活并促進腫瘤生長的相關蛋白，其中包括PI3K/AKT信號通路［6-7］。然而，芋螺多肽AuIB在骨癌痛中能否起到鎮(zhèn)痛作用尚不清楚。本研究通過建立骨癌痛小鼠模型，探討芋螺多肽AuIB在骨癌痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

芋螺多肽AuIB購自MCE（Med Chem Express）公司（貨號：HY-P1269）。PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、AKT和磷酸化 AKT（p-AKT）均購自 Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司。Von Frey纖維絲痛閾測試包購自美國Stoelting公司。

1.2 腫瘤細胞培養(yǎng)

小鼠來源的肺腺癌細胞Lewis購自中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所（中國上海）。將Lewis細胞接種至含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 骨癌痛模型的建立

骨癌痛模型建立參考文獻［8］，將小鼠麻醉后，取仰臥位固定于操作臺上，腹部朝上，左側后肢剪毛，用75%乙醇消毒股骨及脛骨處皮膚；在膝關節(jié)處沿著股直肌肌腱方向切一長0.5～1.0 cm的皮膚切口，小心暴露髕骨，先用一次性無菌1 mL注射器針頭在髕骨沿股骨長軸方向穿刺打孔，然后換上10 μL微量注射器進入股骨骨髓腔，緩慢注入10 μL Lewis小鼠肺癌細胞（3.0×105個）至股骨；注射完畢后用骨蠟封住針孔；然后依次用75%酒精、雙氧水、碘伏嚴格消毒并縫合皮膚；待小鼠蘇醒后放回籠中。SHAM組小鼠于左側股骨骨髓腔內注射生理鹽水10 μL。

1.4 實驗分組

36只SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，6～8周齡，體重（25±2）g，購于廣西醫(yī)科大學實驗動物中心（動物合格證號為SCXK桂2020-0003）。采用隨機數(shù)字法，將其分為6組（n=6）：假手術組（SHAM組）、骨癌痛組（BCP組）、生理鹽水對照組（NS組）、低劑量AuIB給藥組（AuIB1組）、中劑量AuIB給藥組（AuIB2組）和高劑量AuIB給藥組（AuIB3組）。SHAM組行假手術，BCP組股骨遠端注射3.0×105個Lewis細胞構建骨癌痛模型，NS組、AuIB1組、AuIB2組和AuIB3組在股骨遠端接種腫瘤細胞后，每天分別腹腔注射100 μL生理鹽水、AuIB 0.6 mg/kg、AuIB 1.2 mg/kg和AuIB 2.4 mg/kg（根據(jù)前期細胞實驗確定各組中AuIB的相應濃度，實驗中AuIB均溶于生理鹽水）。

1.5 X影像檢測各組小鼠股骨病理學改變

術后第14天取SHAM組和BCP組小鼠，用4%水合氯醛麻醉后以仰臥位固定，用X光機拍攝每只小鼠股骨，觀察股骨病理學改變情況，確認模型構建是否成功。

1.6 組織切片HE染色觀察各組小鼠的組織病理學變化情況

術后第14天取SHAM組和BCP組小鼠術側股骨標本，置于4%多聚甲醛溶液固定24 h，3%硝酸溶液脫鈣2周，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，石蠟切片（5 μm），行HE染色。光學顯微鏡下觀察組織病理學變化情況。

1.7 機械縮足閾值測定

機械縮足閾值的具體測定方法參照文獻［9］。分別于Lewis小鼠肺腺癌細胞接種前1 d以及接種后3 d、5 d、7 d、11 d和14 d時檢測機械縮足閾值。將小鼠置于底部為金屬網(wǎng)格的透明樹脂玻璃籠中30 min以適應環(huán)境，釆用遞增力度的Von Frey纖維絲（分別為0.007 g、0.02 g、0.04 g、0.16 g、0.4 g、0.6 g、1 g、1.4 g、2 g、4 g）自足底下方垂直刺激小鼠后足底皮膚表面，每次持續(xù)6 s。小鼠對刺激出現(xiàn)快速縮足或藤足行為為陽性反應，為陽性反應時則釆用相鄰的低一級力度刺激，直至無陽性反應產生。能引起陽性縮足反應所需的最低力度記為縮足閾值。

1.8 Western blot法檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白的表達水平

取同側脊髓L4-L5段背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層組織，加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF和磷酸酶抑制劑，冰上裂解，離心，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量后加入蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性。取30～60 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，然后200 mA轉膜60 min，5%脫脂牛奶室溫封閉60 min；加入p-PI3K、PI3K、p-AKT和AKT抗體（稀釋比均為1∶1 000），4℃冰箱孵育過夜，TBST洗滌3次；然后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗滌3次。采用電化學發(fā)光（ECL）法顯影，Image Lab測量條帶灰度值，以磷酸化蛋白與總蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以雙側P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠骨癌痛模型的鑒定

X影像顯示，術后14 d時，SHAM組骨密度均勻，骨皮質連續(xù)，見圖1A；而BCP組可見明顯的骨結構破壞和損傷，骨密度不均勻，骨皮質有明顯缺損，組織周圍出現(xiàn)明顯腫脹，見圖1B。顯微鏡下可見SHAM組骨膜完整且骨質結構緊密，骨小梁致密且寬，骨細胞清晰可見，且可見新生骨組織，見圖1C；而BCP組骨膜缺損且骨質明顯破壞，骨小梁排列紊亂，伴隨腫瘤細胞在骨髓腔內浸潤，見圖1D。上述結果說明骨癌痛模型建模成功。

圖1 SHAM組和BCP組小鼠的X線影像和HE染色結果Fig.1 The X-ray images and HE staining in SHAM group and BCP group

2.2 芋螺多肽AuIB對骨癌痛小鼠機械痛行為的影響

各組小鼠術前1 d、術后3 d、術后5 d的機械縮足閾值比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；術后7d，與SHAM組相比，BCP組機械縮足閾值明顯降低（P＜0.05），說明此時小鼠出現(xiàn)機械痛敏；與相同時間點的BCP組相比，AuIB1組在術后14 d出現(xiàn)機械縮足閾值明顯升高（P＜0.05），AuIB2組在術后11 d出現(xiàn)機械縮足閾值明顯升高（P＜0.05），AuIB3組在術后7 d出現(xiàn)機械縮足閾值明顯升高（P＜0.05），見表1。說明AuIB可改善骨癌痛小鼠機械痛行為且呈濃度依賴性和時間依賴性。

表1 各組小鼠的機械縮足閾值比較［g，（±s）］Tab.1 Comparison of the mechanical paw withdrawal threshold in different groups of mice［g,(±s)］

表1 各組小鼠的機械縮足閾值比較［g，（±s）］Tab.1 Comparison of the mechanical paw withdrawal threshold in different groups of mice［g,(±s)］

#P＜0.05,vs SHAM group at the same time point;*P＜0.05,vs BCP group at the same time point

Group SHAM BCP NS AuIB1 AuIB2 AuIB3 n 6 6 6 6 6 6 F P Preoperative 1 d 1.33±0.16 1.30±0.39 1.37±0.37 1.27±0.21 1.33±0.52 1.37±0.37 0.072 0.996 Postoperative 3 d 0.63±0.20 0.53±0.10 0.60±0.22 0.57±0.23 0.67±0.16 0.63±0.29 0.327 0.893 Postoperative 5 d 0.70±0.24 0.63±0.20 0.50±0.11 0.53±0.28 0.57±0.08 0.60±0.22 0.783 0.570 Postoperative 7 d 0.93±0.30 0.35±0.22#0.39±0.20#0.50±0.32#0.53±0.28#0.77±0.27*4.334 0.004 Postoperative 11 d 1.13±0.33 0.26±0.16#0.27±0.23#0.43±0.23#0.60±0.22#*0.80±0.22#*13.488 0.001 Postoperative 14 d 1.20±0.22 0.16±0.13#0.16±0.14#0.60±0.22#*0.77±0.27#*0.93±0.30#*21.660 0.001

2.3 芋螺多肽AuIB對骨癌痛小鼠背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中PI3K/AKT通路相關蛋白表達的影響

在背根神經(jīng)節(jié)，與SHAM組相比，BCP組、NS組和AuIB3組中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均顯著增加（均P＜0.05）；與BCP組相比，AuIB3組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均降低（均P＜0.05），見圖2A～C。相同的結果可以在大腦皮層中觀察到，見圖2D～F。

圖2 芋螺多肽AuIB對骨癌痛小鼠背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中PI3K/AKT通路相關蛋白表達的影響Fig.2 Effects of α-Conotoxin AuIB on the expression of PI3K/AKT pathway-related proteins in dorsal root ganglia and cerebral cortex of mice with bone cancer pain

3 討論

癌痛是腫瘤患者后期最常見的并發(fā)癥，導致骨癌痛的機制較復雜，目前主要認為癌癥誘導的骨痛是一種混合機制的疼痛狀態(tài)表現(xiàn)出的神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛，是對周圍組織和神經(jīng)有特殊改變以及對脊髓水平獨特的神經(jīng)化學變化，但與神經(jīng)性疼痛和炎癥性疼痛不同的是，骨癌痛的特點是突發(fā)性和高強度性［10-12］。因此，骨癌痛是一種復雜的綜合征，不但涉及炎癥和神經(jīng)病變，更有缺血性和腫物壓迫特異性機制。短暫的高爆發(fā)性疼痛也是目前臨床上常面臨的問題，主要依靠嗎啡止痛，但該法止痛并不充分［13］。

海洋藥物由于獨特的結構及特異高效的生物活性而成為當今的研究熱點之一，目前越來越受國內外制藥研究者的關注［14］。如，來源于加勒比海荔枝海綿的阿糖胞苷，由于能抑制細胞DNA合成，已成為臨床上急性粒細胞白血病標準的治療藥物［15］。從河豚提取的替曲朵辛能選擇性阻滯電壓門控鈉通道而達到鎮(zhèn)痛作用，目前已進入Ⅲ期臨床試驗［16］。但目前關于芋螺多肽的研究仍不多，芋螺多肽AuIB對癌痛是否具有鎮(zhèn)痛作用尚不清楚。本研究通過構建骨癌痛小鼠模型探討芋螺多肽的鎮(zhèn)痛作用，結果發(fā)現(xiàn)在建模第7天，小鼠出現(xiàn)明顯的跛行姿態(tài)；在建模第14天，X影像提示骨質明顯破壞，病理學提示癌細胞浸潤，表明骨癌痛小鼠模型構建成功。進一步在小鼠模型中腹腔注射芋螺多肽AuIB，發(fā)現(xiàn)芋螺多肽AuIB能改善小鼠的機械痛行為，并且隨著藥物濃度的升高，可見小鼠縮足閾值升高的轉折點提前，AuIB1組在術后14 d才升高，而AuIB3組在術后7 d已出現(xiàn)升高，說明AuIB可改善骨癌痛小鼠機械痛行為且呈濃度依賴性。

PI3K/AKT信號通路是聯(lián)系細胞內外信號傳遞與細胞應答效應的橋梁之一，廣泛存在于機體多種細胞中，且參與細胞代謝、增殖、分化、調亡等多種生理過程［17］。越來越多的研究顯示PI3K/AKT信號通路在調節(jié)疼痛方面發(fā)揮重要作用。如SONG等［18］研究顯示，柚皮素可能通過下調PI3K信號通路減輕大鼠骨癌痛。李洪波等［19］也報道背根神經(jīng)節(jié)IL-17可能通過激活P13K/AKT信號通路參與大鼠骨癌痛的維持。背根神經(jīng)節(jié)是痛感傳入的初級神經(jīng)元，炎癥會導致p-AKT在背根神經(jīng)節(jié)中表達上調，從而引起痛覺過敏［20］。本研究采用不同劑量AuIB注射，發(fā)現(xiàn)均能緩解小鼠的機械痛行為，同時在蛋白水平上通過Western blot法檢測背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中PI3K/AKT通路相關蛋白的表達，結果發(fā)現(xiàn)注射AuIB后小鼠背根神經(jīng)節(jié)和大腦皮層中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比例均降低，提示AuIB可能通過下調PI3K/AKT信號通路參與骨癌痛的調節(jié)。

綜上所述，芋螺多肽AuIB可以減輕骨癌痛小鼠的機械痛閾，且可能是通過調節(jié)PI3K-AKT信號通路實現(xiàn)。但是AuIB是通過其既定功能阻斷nAChR還是通過其他未知靶點產生作用仍不清楚，未來可以在使用nAChRs激動劑的情況下進一步驗證。