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    鞘內(nèi)注射ZD7288對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)痛及血糖的作用

    2019-11-29 03:55:24余德芊馬彥巧雷曉露劉曉紅
    關(guān)鍵詞:背根鞘內(nèi)興奮性

    余德芊,馬彥巧,雷曉露,劉曉紅

    (遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

    超極化激活環(huán)核苷酸門控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated,HCN)通道激活時(shí)允許Na+內(nèi)流、K+外流,產(chǎn)生一種內(nèi)向陽離子電流(Ih電流),使細(xì)胞興奮性增高。HCN通道包括4種亞型(HCN1-4),廣泛表達(dá)于傷害性感覺傳導(dǎo)通路,參與了病理性疼痛的發(fā)生[1]。背根節(jié)(dorsal root ganglion,DRG)為初級感覺傳入神經(jīng)元胞體所在地,研究發(fā)現(xiàn)多種亞型HCN通道表達(dá)于背根節(jié):HCN1表達(dá)于大、中型神經(jīng)元,HCN2主要分布于感受傷害性刺激的小型神經(jīng)元,HCN3、HCN4表達(dá)較少[2]。既往研究顯示背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)增加促進(jìn)了病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展:外周炎性痛和外周神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)痛模型中,背根節(jié)神經(jīng)元HCN1、HCN2表達(dá)增加、Ih幅值增大;給予HCN通道拮抗劑可減小Ih幅值,顯著減輕疼痛癥狀[3-4]。

    糖尿病周圍神經(jīng)痛(Diabetes peripheral neuralgia,DPN)在糖尿病患者中發(fā)生率高,嚴(yán)重影響患者的身心健康。但DPN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,迄今尚不清楚。最近,Shimatani等[5]發(fā)現(xiàn)連續(xù)給予丙酮醛(葡萄糖代謝派生物)可激活小鼠外周感覺神經(jīng)HCN通道,Ih幅度增加,感覺神經(jīng)興奮性增高。然而,糖尿病時(shí)背根節(jié)HCN通道的表達(dá)變化及其在DPN發(fā)生中的作用目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠Ⅰ型糖尿病,檢測糖尿病大鼠血糖、痛閾值及背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)變化,觀察鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288對以上指標(biāo)的影響,探討背根節(jié)HCN通道在DPN發(fā)生與發(fā)展過程中所起的作用。

    1 材料與方法

    1.1 藥物與試劑兔抗HCN1多克隆抗體(ab19405)、兔抗HCN2多克隆抗體(ab19346)為Abcam產(chǎn)品;山羊抗β-actin多克隆抗體(60008-1)購自proteintech公司;抗兔IgG-HRP、抗山羊IgG-HRP、STZ、ZD7288為Sigma公司產(chǎn)品。

    1.2 動物分組4~5周齡SD大鼠36只購自第三軍醫(yī)大學(xué)[許可證號SCXK(渝)20012-0005]。實(shí)驗(yàn)分為3組:①對照組(n=12);②STZ組(鞘內(nèi)注射生理鹽水,n=12);③ZD7288+ STZ組(鞘內(nèi)注射ZD7288,n=12)。

    1.3 方法

    1.3.1 糖尿病神經(jīng)痛模型制作及鞘內(nèi)置管參照馬彥巧等[6]的方法,于大鼠L4與L5間隙置入PE-10導(dǎo)管。置管7 d 后,單次腹腔注射STZ(60 mg/kg),72 h后血糖值≥16.7 mmol/L,且2周后熱縮足潛伏期明顯降低,則糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠制備成功。

    1.3.2 血糖測定采用便攜式血糖分析儀分別于注射STZ前及注射STZ后3 d,3、4周測定各組大鼠空腹尾靜脈血糖。

    1.3.3 鞘內(nèi)給藥注射STZ的第3、4周,STZ組大鼠鞘內(nèi)注射生理鹽水20 μL,ZD7288 + STZ組大鼠先鞘內(nèi)注射5 μLZD7288(含30 μg ZD7288),再給予15 μL生理鹽水。每天1次,連續(xù)14 d。

    1.3.4 痛行為學(xué)鞘內(nèi)給予ZD7288后2 h時(shí)采用熱輻射法測定大鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency,TWL),具體方法參照楊舒蕾等[7]。

    1.3.5 免疫印跡法檢測背根節(jié)HCN1,2通道蛋白表達(dá)提取各組大鼠L4~L6背根節(jié)總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,行SDS- PAGE電泳(每孔加入30 μg蛋白樣品),半干轉(zhuǎn)法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5 %脫脂牛奶封閉2 h,分別加入兔抗HCN1多克隆抗體(1∶500)、兔抗HCN2多克隆抗體(1∶500)、山羊抗β-actin多克隆抗體(1∶500),4℃孵育過夜。PBS洗膜,分別加入抗兔IgG-HRP(1∶1 000)和抗山羊IgG- HRP(1∶1 000),室溫放置1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑顯色,于全自動凝膠成像儀中顯影,以目的條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶平均灰度值的比值(%)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

    2 結(jié)果

    2.1 糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠血糖的變化與對照組相比,糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠空腹血糖(fasting blood glucose,F(xiàn)BG)顯著升高(>16.7 mM;P<0.01,見圖1),鞘內(nèi)注射HCN通道拮抗劑ZD7288對糖尿病大鼠FBG無顯著影響,說明抑制HCN通道功能對STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠的高血糖無明顯改善作用。

    2.2 糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠痛閾值的改變與對照組相比,腹腔注射STZ 2周后大鼠TWL明顯降低,3~4周痛閾值進(jìn)一步下降(P<0.01,見圖2),說明糖尿病神經(jīng)痛模型成功建立;鞘內(nèi)給予30 μgZD7288(我們以往的實(shí)驗(yàn)顯示鞘內(nèi)注射30 μgZD7288后2 h鎮(zhèn)痛效果佳[7])可顯著升高糖尿病大鼠的TWL(P< 0.01,見圖2),表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

    **:與control組相比,P<0.01;##:與STZ組相比,P<0.01。圖2 各組大鼠熱縮足潛伏期的變化

    2.3 糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)的變化

    2.3.1 背根節(jié)HCN1通道表達(dá)變化與對照組相比,糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠在注射STZ后第3、4周背根神經(jīng)節(jié)HCN1通道表達(dá)顯著增加(P< 0.01,見圖3),鞘內(nèi)給予ZD7288(HCN通道拮抗劑)可降低糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)HCN1表達(dá)(P<0.01,見圖3)。

    **:與control組相比,P<0.01;## :與STZ組相比,P<0.01。圖3 各組大鼠背根節(jié)HCN1通道表達(dá)的變化

    2.3.2 背根節(jié)HCN2通道表達(dá)變化與對照組比較,糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠在注射STZ后第3、 4周背根神經(jīng)節(jié)HCN2表達(dá)升高(P<0.01,見圖4),鞘內(nèi)給予ZD7288可顯著降低糖尿病大鼠背根節(jié)HCN2通道的表達(dá)(P<0.01,見圖4)。

    **:與control組相比,P<0.01;##:與STZ組相比,P<0.01。圖4 各組大鼠背根節(jié)HCN2通道表達(dá)的變化

    3 討論

    鏈脲佐菌素(STZ) 為目前廣泛采用的Ⅰ型糖尿病動物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑。以往研究表明,注射STZ的第2周即可出現(xiàn)痛閾值的降低,痛敏可維持至第4周,隨著時(shí)間的推移,到注射STZ后的第6周,大鼠逐漸出現(xiàn)痛覺減退,同時(shí)約38%的真皮內(nèi)神經(jīng)纖維丟失,故一般認(rèn)為, STZ注射后的前4周屬于糖尿病周圍神經(jīng)病變的早期階段[8-10]。因此,我們選擇在注射STZ第2周大鼠出現(xiàn)熱痛敏后鞘內(nèi)給藥,觀察STZ注射3、4周后的痛閾值和HCN1、HCN2通道表達(dá)變化。

    背根節(jié)神經(jīng)元興奮性增高是產(chǎn)生病理性疼痛的關(guān)鍵,HCN通道富集于背根節(jié)神經(jīng)元,尤其是HCN2主要表達(dá)于感受傷害性刺激的小型神經(jīng)元。以往研究顯示,背根節(jié)HCN2通道在病理性疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用:在外周炎性痛[11-12]和外周神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)痛模型[13-15],背根節(jié)神經(jīng)元HCN2通道表達(dá)顯著增加,Ih幅度增大,受損的神經(jīng)纖維放電頻率增高;全身或局部給予HCN通道抑制劑可降低Ih幅度及受損神經(jīng)的異常放電,并顯著減輕機(jī)械痛和/或熱痛敏;此外,Emery等[16]發(fā)現(xiàn),敲除背根節(jié)HCN2基因完全消除了足底注射福爾馬林或角叉菜膠誘發(fā)的熱痛敏、坐骨神經(jīng)損傷導(dǎo)致的熱/機(jī)械痛敏。這些研究均表明, HCN2激活導(dǎo)致的初級感覺神經(jīng)元興奮性增加促進(jìn)了病理性疼痛的發(fā)生。另有研究顯示背根節(jié)HCN1通道也參與病理性疼痛的發(fā)生:Momin等[17]發(fā)現(xiàn),敲除背根節(jié)HCN1基因可明顯減輕小鼠部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘發(fā)的冷痛敏;長期使用奧沙利鉑(抗腫瘤藥)誘發(fā)的神經(jīng)痛大鼠背根節(jié)HCN1表達(dá)增加,給予選擇性HCN1抑制劑MEL57A可明顯緩解奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)痛[18]。最近,Sun等[19]發(fā)現(xiàn),蜂毒誘發(fā)的炎性痛大鼠背根節(jié)神經(jīng)元HCN1、HCN2表達(dá)增加、Ih增大,神經(jīng)元興奮性增高;給予ZD7288可降低背根節(jié)神經(jīng)元Ih幅值及興奮性,并緩解蜂毒導(dǎo)致的疼痛。以上研究均表明:HCN1,2激活導(dǎo)致的背根節(jié)神經(jīng)元興奮性增加促進(jìn)了病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在產(chǎn)生周圍神經(jīng)痛的同時(shí),背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)顯著升高,鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288降低背根節(jié)HCN1,2表達(dá)的同時(shí),明顯緩解了周圍神經(jīng)痛,說明背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)的增加可促進(jìn)糖尿病周圍神經(jīng)痛的發(fā)生與發(fā)展。由于ZD7288缺乏亞型針對性,尚無法確定HCN1、HCN2在糖尿病周圍神經(jīng)痛中的具體作用。此外,本實(shí)驗(yàn)鞘內(nèi)給予ZD7288抑制HCN通道活化后,背根節(jié)HCN1,HCN2蛋白表達(dá)下降,這提示HCN通道活化增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性的同時(shí),可能影響胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的活性,造成HCN1,2蛋白表達(dá)變化。Liu等[20]的研究也顯示HCN通道拮抗劑可抑制奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)痛及脊髓背角Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CaMKII/CREB)信號通路的過度活化。本實(shí)驗(yàn)ZD7288是否通過抑制CaMKII/CREB信號通路進(jìn)而抑制背根節(jié)HCN1、HCN2的表達(dá),有待進(jìn)一步闡明。

    關(guān)于糖尿病大鼠背根節(jié)HCN1,2通道活化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。以往研究顯示,cAMP/PKA信號過度激活促進(jìn)了慢性疼痛的產(chǎn)生與維持。近期研究發(fā)現(xiàn),cAMP/PKA也是調(diào)節(jié)HCN通道功能的重要因子,胞內(nèi)cAMP水平升高可加快HCN通道激活開放,Ih增強(qiáng)[21]。最近,Herrmann 等[22]發(fā)現(xiàn),cAMP通過PKA激活背根節(jié)傷害性感覺神經(jīng)元HCN2通道可促進(jìn)炎性痛的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠背根節(jié)HCN1,2通道激活是否由cAMP-PKA信號過度活化導(dǎo)致,有待進(jìn)一步研究。

    此外,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,盡管鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288對糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)痛可發(fā)揮良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng),但對血糖無明顯改善作用,說明ZD7288的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與血糖無明顯關(guān)聯(lián)。

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