鞘內(nèi)注射ZD7288對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)痛及血糖的作用

余德芊，馬彥巧，雷曉露，劉曉紅

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

超極化激活環(huán)核苷酸門控(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide gated，HCN)通道激活時(shí)允許Na+內(nèi)流、K+外流，產(chǎn)生一種內(nèi)向陽離子電流(Ih電流)，使細(xì)胞興奮性增高。HCN通道包括4種亞型(HCN1-4)，廣泛表達(dá)于傷害性感覺傳導(dǎo)通路，參與了病理性疼痛的發(fā)生[1]。背根節(jié)(dorsal root ganglion，DRG)為初級感覺傳入神經(jīng)元胞體所在地，研究發(fā)現(xiàn)多種亞型HCN通道表達(dá)于背根節(jié)：HCN1表達(dá)于大、中型神經(jīng)元，HCN2主要分布于感受傷害性刺激的小型神經(jīng)元，HCN3、HCN4表達(dá)較少[2]。既往研究顯示背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)增加促進(jìn)了病理性疼痛的發(fā)生與發(fā)展：外周炎性痛和外周神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)痛模型中，背根節(jié)神經(jīng)元HCN1、HCN2表達(dá)增加、Ih幅值增大；給予HCN通道拮抗劑可減小Ih幅值，顯著減輕疼痛癥狀[3-4]。

糖尿病周圍神經(jīng)痛(Diabetes peripheral neuralgia，DPN)在糖尿病患者中發(fā)生率高，嚴(yán)重影響患者的身心健康。但DPN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，迄今尚不清楚。最近,Shimatani等[5]發(fā)現(xiàn)連續(xù)給予丙酮醛(葡萄糖代謝派生物)可激活小鼠外周感覺神經(jīng)HCN通道，Ih幅度增加，感覺神經(jīng)興奮性增高。然而，糖尿病時(shí)背根節(jié)HCN通道的表達(dá)變化及其在DPN發(fā)生中的作用目前未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)大鼠Ⅰ型糖尿病，檢測糖尿病大鼠血糖、痛閾值及背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)變化，觀察鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288對以上指標(biāo)的影響，探討背根節(jié)HCN通道在DPN發(fā)生與發(fā)展過程中所起的作用。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑兔抗HCN1多克隆抗體(ab19405)、兔抗HCN2多克隆抗體(ab19346)為Abcam產(chǎn)品；山羊抗β-actin多克隆抗體(60008-1)購自proteintech公司；抗兔IgG-HRP、抗山羊IgG-HRP、STZ、ZD7288為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 動物分組4～5周齡SD大鼠36只購自第三軍醫(yī)大學(xué)[許可證號SCXK(渝)20012-0005]。實(shí)驗(yàn)分為3組：①對照組(n=12)；②STZ組(鞘內(nèi)注射生理鹽水，n=12)；③ZD7288+ STZ組(鞘內(nèi)注射ZD7288，n=12)。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病神經(jīng)痛模型制作及鞘內(nèi)置管參照馬彥巧等[6]的方法，于大鼠L4與L5間隙置入PE-10導(dǎo)管。置管7 d 后，單次腹腔注射STZ(60 mg/kg)，72 h后血糖值≥16.7 mmol/L，且2周后熱縮足潛伏期明顯降低，則糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠制備成功。

1.3.2 血糖測定采用便攜式血糖分析儀分別于注射STZ前及注射STZ后3 d，3、4周測定各組大鼠空腹尾靜脈血糖。

1.3.3 鞘內(nèi)給藥注射STZ的第3、4周，STZ組大鼠鞘內(nèi)注射生理鹽水20 μL，ZD7288 + STZ組大鼠先鞘內(nèi)注射5 μLZD7288(含30 μg ZD7288)，再給予15 μL生理鹽水。每天1次，連續(xù)14 d。

1.3.4 痛行為學(xué)鞘內(nèi)給予ZD7288后2 h時(shí)采用熱輻射法測定大鼠熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)，具體方法參照楊舒蕾等[7]。

1.3.5 免疫印跡法檢測背根節(jié)HCN1,2通道蛋白表達(dá)提取各組大鼠L4～L6背根節(jié)總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，行SDS- PAGE電泳(每孔加入30 μg蛋白樣品)，半干轉(zhuǎn)法將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5 %脫脂牛奶封閉2 h，分別加入兔抗HCN1多克隆抗體(1∶500)、兔抗HCN2多克隆抗體(1∶500)、山羊抗β-actin多克隆抗體(1∶500)，4℃孵育過夜。PBS洗膜，分別加入抗兔IgG-HRP(1∶1 000)和抗山羊IgG- HRP(1∶1 000)，室溫放置1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑顯色，于全自動凝膠成像儀中顯影，以目的條帶與內(nèi)參(β-actin)條帶平均灰度值的比值(%)進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2 結(jié)果

2.1 糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠血糖的變化與對照組相比，糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)顯著升高(>16.7 mM；P<0.01，見圖1)，鞘內(nèi)注射HCN通道拮抗劑ZD7288對糖尿病大鼠FBG無顯著影響，說明抑制HCN通道功能對STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠的高血糖無明顯改善作用。

2.2 糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠痛閾值的改變與對照組相比，腹腔注射STZ 2周后大鼠TWL明顯降低，3～4周痛閾值進(jìn)一步下降(P<0.01，見圖2)，說明糖尿病神經(jīng)痛模型成功建立；鞘內(nèi)給予30 μgZD7288(我們以往的實(shí)驗(yàn)顯示鞘內(nèi)注射30 μgZD7288后2 h鎮(zhèn)痛效果佳[7])可顯著升高糖尿病大鼠的TWL(P< 0.01，見圖2)，表現(xiàn)出良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。

**：與control組相比，P<0.01；##：與STZ組相比，P<0.01。圖2 各組大鼠熱縮足潛伏期的變化

2.3 糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)的變化

2.3.1 背根節(jié)HCN1通道表達(dá)變化與對照組相比，糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠在注射STZ后第3、4周背根神經(jīng)節(jié)HCN1通道表達(dá)顯著增加(P< 0.01,見圖3)，鞘內(nèi)給予ZD7288(HCN通道拮抗劑)可降低糖尿病大鼠背根神經(jīng)節(jié)HCN1表達(dá)(P<0.01,見圖3)。

**：與control組相比，P<0.01；## ：與STZ組相比，P<0.01。圖3 各組大鼠背根節(jié)HCN1通道表達(dá)的變化

2.3.2 背根節(jié)HCN2通道表達(dá)變化與對照組比較，糖尿病周圍神經(jīng)痛大鼠在注射STZ后第3、 4周背根神經(jīng)節(jié)HCN2表達(dá)升高(P<0.01,見圖4)，鞘內(nèi)給予ZD7288可顯著降低糖尿病大鼠背根節(jié)HCN2通道的表達(dá)(P<0.01,見圖4)。

**：與control組相比，P<0.01；##：與STZ組相比，P<0.01。圖4 各組大鼠背根節(jié)HCN2通道表達(dá)的變化

3 討論

鏈脲佐菌素(STZ) 為目前廣泛采用的Ⅰ型糖尿病動物模型化學(xué)誘導(dǎo)劑。以往研究表明，注射STZ的第2周即可出現(xiàn)痛閾值的降低，痛敏可維持至第4周，隨著時(shí)間的推移，到注射STZ后的第6周，大鼠逐漸出現(xiàn)痛覺減退，同時(shí)約38%的真皮內(nèi)神經(jīng)纖維丟失，故一般認(rèn)為， STZ注射后的前4周屬于糖尿病周圍神經(jīng)病變的早期階段[8-10]。因此，我們選擇在注射STZ第2周大鼠出現(xiàn)熱痛敏后鞘內(nèi)給藥，觀察STZ注射3、4周后的痛閾值和HCN1、HCN2通道表達(dá)變化。

背根節(jié)神經(jīng)元興奮性增高是產(chǎn)生病理性疼痛的關(guān)鍵，HCN通道富集于背根節(jié)神經(jīng)元，尤其是HCN2主要表達(dá)于感受傷害性刺激的小型神經(jīng)元。以往研究顯示，背根節(jié)HCN2通道在病理性疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用：在外周炎性痛[11-12]和外周神經(jīng)損傷所致的神經(jīng)痛模型[13-15]，背根節(jié)神經(jīng)元HCN2通道表達(dá)顯著增加，Ih幅度增大，受損的神經(jīng)纖維放電頻率增高；全身或局部給予HCN通道抑制劑可降低Ih幅度及受損神經(jīng)的異常放電，并顯著減輕機(jī)械痛和/或熱痛敏；此外，Emery等[16]發(fā)現(xiàn)，敲除背根節(jié)HCN2基因完全消除了足底注射福爾馬林或角叉菜膠誘發(fā)的熱痛敏、坐骨神經(jīng)損傷導(dǎo)致的熱/機(jī)械痛敏。這些研究均表明， HCN2激活導(dǎo)致的初級感覺神經(jīng)元興奮性增加促進(jìn)了病理性疼痛的發(fā)生。另有研究顯示背根節(jié)HCN1通道也參與病理性疼痛的發(fā)生：Momin等[17]發(fā)現(xiàn)，敲除背根節(jié)HCN1基因可明顯減輕小鼠部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎誘發(fā)的冷痛敏；長期使用奧沙利鉑(抗腫瘤藥)誘發(fā)的神經(jīng)痛大鼠背根節(jié)HCN1表達(dá)增加，給予選擇性HCN1抑制劑MEL57A可明顯緩解奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)痛[18]。最近，Sun等[19]發(fā)現(xiàn)，蜂毒誘發(fā)的炎性痛大鼠背根節(jié)神經(jīng)元HCN1、HCN2表達(dá)增加、Ih增大，神經(jīng)元興奮性增高；給予ZD7288可降低背根節(jié)神經(jīng)元Ih幅值及興奮性，并緩解蜂毒導(dǎo)致的疼痛。以上研究均表明：HCN1,2激活導(dǎo)致的背根節(jié)神經(jīng)元興奮性增加促進(jìn)了病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在產(chǎn)生周圍神經(jīng)痛的同時(shí)，背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)顯著升高，鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288降低背根節(jié)HCN1,2表達(dá)的同時(shí)，明顯緩解了周圍神經(jīng)痛，說明背根節(jié)HCN1,2通道表達(dá)的增加可促進(jìn)糖尿病周圍神經(jīng)痛的發(fā)生與發(fā)展。由于ZD7288缺乏亞型針對性，尚無法確定HCN1、HCN2在糖尿病周圍神經(jīng)痛中的具體作用。此外，本實(shí)驗(yàn)鞘內(nèi)給予ZD7288抑制HCN通道活化后，背根節(jié)HCN1，HCN2蛋白表達(dá)下降，這提示HCN通道活化增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性的同時(shí)，可能影響胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的活性，造成HCN1,2蛋白表達(dá)變化。Liu等[20]的研究也顯示HCN通道拮抗劑可抑制奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)痛及脊髓背角Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴的蛋白激酶II/環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CaMKII/CREB)信號通路的過度活化。本實(shí)驗(yàn)ZD7288是否通過抑制CaMKII/CREB信號通路進(jìn)而抑制背根節(jié)HCN1、HCN2的表達(dá)，有待進(jìn)一步闡明。

關(guān)于糖尿病大鼠背根節(jié)HCN1,2通道活化的具體機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。以往研究顯示，cAMP/PKA信號過度激活促進(jìn)了慢性疼痛的產(chǎn)生與維持。近期研究發(fā)現(xiàn)，cAMP/PKA也是調(diào)節(jié)HCN通道功能的重要因子，胞內(nèi)cAMP水平升高可加快HCN通道激活開放，Ih增強(qiáng)[21]。最近，Herrmann 等[22]發(fā)現(xiàn)，cAMP通過PKA激活背根節(jié)傷害性感覺神經(jīng)元HCN2通道可促進(jìn)炎性痛的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)STZ誘導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病大鼠背根節(jié)HCN1,2通道激活是否由cAMP-PKA信號過度活化導(dǎo)致，有待進(jìn)一步研究。

此外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，盡管鞘內(nèi)給予HCN通道拮抗劑ZD7288對糖尿病大鼠的周圍神經(jīng)痛可發(fā)揮良好的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，但對血糖無明顯改善作用，說明ZD7288的鎮(zhèn)痛效應(yīng)與血糖無明顯關(guān)聯(lián)。