遵義市匯川區(qū)特殊教育學(xué)校192例耳聾學(xué)生耳聾基因檢測分析

廖生波，謝天宏，丁 丹，李小英，黃 晗，王世飛

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 耳鼻咽喉科, 貴州 遵義 563099；2.四川大學(xué)華西第四醫(yī)院 耳鼻咽喉科, 四川 成都 610041；3.河南省周口市中心醫(yī)院，河南 周口 466000 )

耳聾在人類殘疾中最常見，按其發(fā)生原因分遺傳性和非遺傳性，約60%以上的耳聾由于基因或染色體異常等遺傳因素引起[1]。根據(jù)是否伴有耳外全身其它組織器官疾病把遺傳性耳聾分為綜合征性耳聾(Syndromic hearing loss，SHL)和非綜合征性耳聾(Nonsyndromic hearing loss，NSHL)[2]。國內(nèi)外研究表明，遺傳性耳聾中NSHL占耳聾人群的70%以上，不同種族、民族、地區(qū)遺傳性耳聾的發(fā)病率及發(fā)病原因各不相同[3]。各地在開展耳聾基因檢測初期，多以最常見4個耳聾致病基因GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA及GJB3 基因檢測開展耳聾基因檢測相關(guān)研究。我國幅員遼闊，各民族大雜居，小聚居，生活習(xí)慣及飲食結(jié)構(gòu)、環(huán)境因素等影響，常見耳聾基因檢出率報道差異較大，我們對貴州遵義市匯川區(qū)特殊教育學(xué)校192例耳聾學(xué)生進(jìn)行常見耳聾基因檢測，了解本地常見耳聾基因突變情況，為在本地區(qū)深入開展遺傳性耳聾防治工作奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年9月至2016 年9 月就讀于遵義市匯川區(qū)特殊教育學(xué)校的非綜合征性耳聾學(xué)生192 人，男 113 例，女79 例，年齡5～22 歲，平均(14.80±7.22)歲，其中漢族耳聾學(xué)生160 例，少數(shù)民族聾啞學(xué)生32例[4]。得到遵義市殘疾人聯(lián)合會、特殊教育學(xué)校教師大力支持，取得學(xué)生及家長同意。納入標(biāo)準(zhǔn):①所有研究對象均為兩代以上常駐貴州省遵義市轄區(qū)；②聽力檢測證實(shí)為中重度、極重度感音神經(jīng)性非綜合征性耳聾;③目前就讀于遵義市匯川區(qū)特殊教育學(xué)校；④有或無耳聾家族遺傳史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①診斷急、慢性化膿性中耳炎，有中耳手術(shù)史者；②有明確可引起聽力下降；包括顱面部外傷、腦膜炎、迷路感染等其它疾病史；③伴有外耳、中耳畸形，引起傳導(dǎo)性聽力下降者；④伴有腦癱、智力發(fā)育障礙、或全身其它疾病影響聽力檢測效果者；⑤聾啞學(xué)生及家長不同意進(jìn)入該項(xiàng)研究者。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 每位受檢對象由護(hù)士使用一次性無菌針采血5 mL，-80℃保存，檢測時解凍使用DNA提取試劑盒(上海生工生物工程)提取DNA，使用Thermo ND-2000測定DNA濃度與純度，控制樣本純度OD260/280=1.8～2.1，濃度150 ng/μL左右。

1.2.2 耳聾基因芯片檢測 將抽提的DNA取50 ng配置成25 μL體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s后72℃延伸30 s，進(jìn)行30個循環(huán)，終止反應(yīng)后72℃延伸7 min，置于4℃冰箱保存，使用耳聾基因芯片(北京博奧生物有限公司)對本研究中192例患者的耳聾基因突變進(jìn)行篩查，主要包括GJB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA12SrRNA四個常見耳聾基因的9個突變位點(diǎn)。

1.2.3 顳骨顳骨高分辨率 CT 掃描+三維重建 對SLC26A4 基因突變者進(jìn)行顳骨高分辨率CT+三維重建檢查前庭導(dǎo)水管是否有擴(kuò)大以及病變類型。

2 結(jié)果

192例耳聾患者中，基因突變 32例(16.67%，32/192)見表1。

表1192例耳聾學(xué)生耳聾基因檢出情況

基因類型突變位點(diǎn)檢出例數(shù)檢出率235 delC純合136.77%(13/192)235 delC雜合31.56%(3/192)GJB2299del AT雜合突變21.04%(2/192)176del16純合突變10.52%(1/192)35delG純合突變10.52%(1/192)SLC26A4 IVS7-2A>G純合突變10.52%(1/192) IVS7-2A>G雜合突變10.52%(1/192)線粒體12Sr RNA12Sr RNA 1494C >T42.08%(4/192)12SrRNA1555A>G63.13%(6/192)GJB3538 C > T00

GJB2突變20例(10.42%，20/192)，本研究2例 SLC26A4 基因突變者均為3～5歲開始發(fā)作眩暈，均有2次以上突發(fā)性耳聾發(fā)作病史，經(jīng)顳骨高分辨率 CT 掃描+三維重建見(見圖1)，IVS7-2A>G純合突變者CT顯示雙側(cè)單純前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大(見圖1A)，不伴前庭及半規(guī)管異常。IVS7-2A>G雜合突變者CT顯示雙側(cè)前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大與上、后半規(guī)管單腳匯合成的總腳相通(見圖1B)，該例患者轉(zhuǎn)診外院行人工耳蝸植入術(shù)。

A：前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，與總腳不相通；B：前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，與總腳連通。 圖1 2例SLC26A4突變顳骨高分辨率CT 掃描+三維重建

3 討論

遺傳性耳聾是臨床上常見的缺陷性疾病，對人類的健康有較大的威脅，而遺傳因素是其主要的致病因素。根據(jù)其臨床癥狀可分為綜合征性、非綜合征性耳聾，在我國有4種主要的致病基因GJB2、GJB3、SLC26A4及mtDNA12SrRNA，涉及9個突變位點(diǎn)。GJB2是主要的一個引起遺傳性耳聾的突變基因，它的突變會產(chǎn)生異常的連接蛋白Cx-26，從而影響細(xì)胞間隙連接，導(dǎo)致在內(nèi)耳中的鉀離子異?；厥斩露@。SJC26A4基因主要編碼蛋白質(zhì)Pendrin，與氯/碘、氯/碳酸氫根等的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，它的異常表達(dá)會導(dǎo)致Pendrin綜合癥以及大前庭水管綜合癥。GJB3是中國首個本土發(fā)現(xiàn)的耳聾基因，它的突變導(dǎo)致的耳聾臨床表現(xiàn)為高頻聽力損失為主要特征的感音神經(jīng)性耳聾，多為語后性耳聾。mtDNA12SrRNA主要引起DNA空間結(jié)構(gòu)的改變而致聾，線粒體基因突變導(dǎo)致耳聾的遺傳方式多為母系遺傳，人類線粒體DNA突變、氨基苷類抗生素與耳聾的誘發(fā)密切相關(guān)，且致聾因素之間也存在相互關(guān)聯(lián)。在由氨基苷類抗生素誘導(dǎo)的藥物性聾患者中，mtDNA12SrRNA 1555A>G 和1494C >T 突變是主要的分子致病基礎(chǔ)[5]。除紅細(xì)胞外，人身體的其他細(xì)胞內(nèi)均含有線粒體，但線粒體基因只能隨女性的卵子遺傳給下一代，即母系遺傳[6]。

我們通過對192例耳聾學(xué)生進(jìn)行了詳細(xì)的病史調(diào)查、突變基因檢測并通過分析其病史，基因突變檢測顯示192例聾啞學(xué)生中共檢出32例基因突變陽性，檢出率為16.67%，以GJB2基因235del C純合突變最常見(13/20)；其次為線粒體12Sr RNA 1555A>G突變；發(fā)現(xiàn)2例SLC26A4；未發(fā)現(xiàn)GJB3基因突變。本研究與國內(nèi)其它地區(qū)聾啞學(xué)校耳聾基因檢測結(jié)果比較，耳聾基因檢出率偏低，張怡[7]等報道黑龍江某聾啞學(xué)校103例耳聾患者共發(fā)現(xiàn)突變攜帶者47例，檢出率為45.63%。張華[8]等采用飛行時間質(zhì)譜檢測河北省秦皇島市聾啞學(xué)校耳聾患者基因突變四個基因的共20個位點(diǎn)，基因突變總的檢出率為50%；可能與本研究耳聾基因檢測位點(diǎn)少，血樣采集、凍存及運(yùn)輸影響，我們未檢測SLC26A4 基因H723R突變位點(diǎn)，所用檢測方法需改進(jìn)等有關(guān)。本組結(jié)果顯示GJB2 235delC是遵義市匯川區(qū)特殊教育學(xué)校最常見的耳聾突變位點(diǎn)，占所有該基因全部突變檢出位點(diǎn)的 40.63%(13/32)，因而GJB2 235delC應(yīng)作為本地區(qū)主要篩查項(xiàng)目。

在中國人大前庭水管綜合征患者中最常見的 SLC26A4 基因突變類型是IVS7-2A>G ，其次為H723R。我們對SLC26A4 基因的 IVS7-2A>G突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測，2例發(fā)現(xiàn)突變，經(jīng)顳骨高分辨率 CT+三維重建檢查，2例均明確診斷為前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大。對耳聾學(xué)生及家長進(jìn)行健康宣教，避免劇烈運(yùn)動，防止跌倒傷及頭部。線粒體mtDNA基因突變引起的遺傳性耳聾較少見，具有母系遺傳特性，因使用氨基苷類抗生素導(dǎo)致耳聾。mtDNA基因突變?nèi)巳嚎诜蜢o脈應(yīng)用常用劑量或低于常用劑量就可誘發(fā)患者聽力下降。本組匯川區(qū)特殊教育學(xué)校耳聾學(xué)生mtDNA的突變率為5.21%，1555A>G基因突變陽性率3.13%，高于全國平均水平2.86%。在前期的耳聾調(diào)查中，遵義市匯川區(qū)特殊教育學(xué)校有明確的氨基糖苷類應(yīng)用后耳聾者31例，本組耳聾基因檢測結(jié)果顯示mtDNA基因突變檢出率低，后續(xù)研究需擴(kuò)大耳聾基因突變位點(diǎn)的檢測及開展全基因組測序等，掌握本地區(qū)藥物性耳聾基因突變譜，大力宣傳耳毒性藥物用藥注意事項(xiàng)。

通過本課題研究，我們初步掌握遵義市匯川區(qū)特殊教育學(xué)校的遺傳性耳聾患者發(fā)病情況、影響因素及基因突變情況。結(jié)合我院開展新生兒聽力篩查10余年的經(jīng)驗(yàn)及數(shù)據(jù)[9]，將對進(jìn)一步深入開展耳聾研究，建立本地區(qū)耳聾家系數(shù)據(jù)庫奠定基礎(chǔ)。