遠(yuǎn)志對(duì)DPN大鼠背根節(jié)神經(jīng)元損傷的預(yù)防保護(hù)作用*

李 穎，馬洪偉，付秀美，陳志宏，薛景鳳△

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000； 2.北京市朝陽(yáng)區(qū)高碑店社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心）

糖尿病周?chē)窠?jīng)病變（diabetic peripheral neuropathy，DPN）發(fā)病率可高達(dá)30%～90%，是糖尿病（diabetes mellitus，DM）常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥，且缺乏特效的西藥，是DM患者致殘甚至致死的主要原因。大量研究表明，DPN的發(fā)病機(jī)制與缺血缺氧、氧化應(yīng)激、山梨醇通路紊亂等諸多因素相關(guān)[1-2]。周?chē)窠?jīng)是DPN的研究焦點(diǎn)，但對(duì)與周?chē)窠?jīng)相關(guān)的胞體的關(guān)注相對(duì)不足。胞體是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的中心，研究DPN相關(guān)神經(jīng)元胞體的病理變化對(duì)進(jìn)一步探討DPN的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。遠(yuǎn)志為我國(guó)常用的中草藥，有益智強(qiáng)志之功效，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有良好的保護(hù)作用[3-4]。本研究旨在通過(guò)觀察DPN大鼠背根節(jié)神經(jīng)元凋亡的變化，探討遠(yuǎn)志對(duì)DPN大鼠背根節(jié)神經(jīng)元胞體損傷的預(yù)防保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 成年Wistar大鼠36只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：905075。遠(yuǎn)志水煎液的制備：將中藥遠(yuǎn)志浸泡、煎煮、過(guò)濾，濃縮成含生藥1g/ml的水煎液；鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ，美國(guó)Sigma公司）；小鼠抗Bcl-2、Bax單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；TUNEL檢測(cè)試劑盒（德國(guó)Roche公司）；SP免疫組織化學(xué)試劑盒（北京四正柏生物科技有限公司）。

1.2 動(dòng)物分組與給藥 36只大鼠隨機(jī)分為3組：空白對(duì)照組，DPN模型組及遠(yuǎn)志預(yù)防組，每組12只。DPN模型組及遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠以2%的STZ按25mg/kg的劑量腹腔注射3d，以血糖≥16.7mmol/L為標(biāo)準(zhǔn)建立DM模型。DM模型建成后，遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠給予遠(yuǎn)志（生藥2.7g/kg/d）灌胃6周；DPN模型組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)6周，以尾部感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度（sense nerve conduction velocity，SNCV）＜30m/s為DPN成模標(biāo)準(zhǔn)；空白對(duì)照組大鼠給予同等容積蒸餾水灌胃6周。用藥結(jié)束后，各組大鼠斷頭處死后迅速分離并取出與坐骨神經(jīng)對(duì)應(yīng)的背根節(jié)，一側(cè)背根節(jié)入液氮保存，另一側(cè)背根節(jié)入Bouins液固定。

1.3 SP免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)背根節(jié)Bcl-2、Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) 取Bouins液固定的背根節(jié)，常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚5μm。一抗按1：80稀釋?zhuān)珼AB顯色，以PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。Bcl-2以背根節(jié)神經(jīng)元胞漿顯現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)，Bax以背根節(jié)神經(jīng)元胞漿及核膜顯現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng)。每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取3張切片在400倍顯微鏡下攝片，每張切片隨機(jī)選3個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野Bcl-2、Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4 免疫印跡法檢測(cè)背根節(jié)Bcl-2、Bax蛋白的表達(dá) 取液氮中保存的背根節(jié)標(biāo)本，提取蛋白后采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，置于95℃熱水中變性10min，12% SDS-PAGE凝膠電泳，電壓80～120V（2h），70V穩(wěn)壓轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂奶粉封閉2h。加入一抗（β-actin 1：1000，Bcl-2 1：200，Bax 1：200）4℃孵育12h；二抗以1：5000稀釋?zhuān)谑覝叵轮糜趽u床孵育1h，超敏發(fā)光液顯影后膠片感光成像。應(yīng)用Gel-Pro Analyzer 4.0圖像分析軟件分析顯影條帶，分別將Bcl-2、Bax與β-actin條帶的積分光密度（IOD）值的比值作為Bcl-2、Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 TUNEL法檢測(cè)背根節(jié)神經(jīng)元凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI） 取Bouins液固定的背根節(jié)，常規(guī)石蠟包埋，切片，片厚5μm。采用TUNEL法檢測(cè)，DAB顯色，用熒光素標(biāo)記的dUTP作為陰性對(duì)照，以背根節(jié)神經(jīng)元胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽(yáng)性反應(yīng)。每個(gè)標(biāo)本取3張切片于400倍顯微鏡下攝片，每張切片隨機(jī)觀察3個(gè)視野，以視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)占視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的百分比作為AI，取平均值。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05說(shuō)明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 背根節(jié)神經(jīng)元Bcl-2、Bax的表達(dá) 與空白對(duì)照組大鼠比較，DPN模型組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少、Bcl-2的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）；與DPN模型組大鼠比較，遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多、Bcl-2的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）（附表）。與空白對(duì)照組大鼠比較，DPN模型組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多、Bax的表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；與DPN模型組大鼠比較，遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元Bax陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少、Bax的表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見(jiàn)附表：

附表 各組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元Bcl-2、Bax的表達(dá)及AI值（±s ，n=12）

附表 各組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元Bcl-2、Bax的表達(dá)及AI值（±s ，n=12）

與空白對(duì)照組比較：*P＜0.01；與DPN模型組比較：△P＜0.01

組別 Bcl-2 Bax AI值陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) Bcl-2表達(dá) 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù) Bax表達(dá)空白對(duì)照組 44.33±2.40 1.13±0.05 10.14±2.48 0.66±0.03 7.47±1.49 DPN模型組 13.56±3.54* 0.49±0.02* 30.80±5.65* 1.21±0.03* 45.25±3.67*遠(yuǎn)志預(yù)防組 33.00±2.87△ 0.97±0.02△ 11.67±2.87△ 0.81±0.02△ 11.95±1.44△images/BZ_10_1211_2802_1234_2835.png

2.2 背根節(jié)神經(jīng)元的AI值 DPN模型組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的AI值明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.01），遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元的AI值明顯低于DPN模型組（P＜0.01）。見(jiàn)附表。

3 討論

WHO的一項(xiàng)研究表明，到2030年DM患者將達(dá)到3.53億，而我國(guó)已成為DM患者最多的國(guó)家之一。DPN是DM最常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，發(fā)病率隨病程延長(zhǎng)逐年升高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，且很大程度上增加了患者和社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此，對(duì)DPN的預(yù)防和治療具有重要意義[5]。

目前，多數(shù)關(guān)于DPN的研究均將周?chē)窠?jīng)纖維作為焦點(diǎn)，對(duì)胞體的關(guān)注相對(duì)不足。作為神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的中心，胞體維持著神經(jīng)元的正常生理功能及神經(jīng)纖維旺盛的再生能力。以往研究表明，周?chē)窠?jīng)損傷可逆行性導(dǎo)致胞體受損乃至死亡[6]。細(xì)胞凋亡是受基因精準(zhǔn)調(diào)控的細(xì)胞自主程序化死亡，Bcl-2蛋白家族為重要的凋亡調(diào)控因子之一。根據(jù)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響可將Bcl-2家族分為兩類(lèi)，一類(lèi)是抗凋亡Bcl-2家組成員，如Bcl-2、Bcl-xL等；一類(lèi)是促凋亡Bcl-2家族成員，如Bax、Bad等。Bcl-2位于線粒體內(nèi)膜和細(xì)胞質(zhì)中，具有維持線粒體電位、抗凋亡的作用。Bax可與Bcl-2形成異二聚體，對(duì)Bcl-2產(chǎn)生阻抑作用。

本研究發(fā)現(xiàn)DPN模型組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元胞體抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)明顯增多，且AI值明顯升高，表明DM時(shí)因?yàn)樽巧窠?jīng)相關(guān)神經(jīng)元發(fā)生凋亡導(dǎo)致了周?chē)窠?jīng)損傷。

目前，對(duì)于DPN的防治尚缺乏有效措施，中藥因能多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)治療疾病，且長(zhǎng)期使用副作用小而備受研究者們的關(guān)注。遠(yuǎn)志，又名繞、等，是我國(guó)常用的中草藥。遠(yuǎn)志中的主要化學(xué)成分包括三萜皂苷類(lèi)、糖酯類(lèi)等，具有益智、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠等生物活性[7]。已有研究表明，遠(yuǎn)志可通過(guò)抗氧化、穩(wěn)定線粒體膜電位等機(jī)制保護(hù)神經(jīng)元。本課題組以往研究表明，遠(yuǎn)志可延緩DPN大鼠尾部SNCV下降，降低坐骨神經(jīng)中醛糖還原酶的活性、使坐骨神經(jīng)微絲蛋白的表達(dá)升高，對(duì)DPN大鼠坐骨神經(jīng)損傷具有良好的預(yù)防和保護(hù)作用[8]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠背根節(jié)神經(jīng)元抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著增多、促凋亡蛋白Bax的表達(dá)顯著降低，且遠(yuǎn)志預(yù)防組大鼠背根節(jié)的AI值明顯降低，提示遠(yuǎn)志還可通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，延緩DPN大鼠背根節(jié)神經(jīng)元胞體損傷。

綜上所述，DPN大鼠坐骨神經(jīng)相關(guān)神經(jīng)元胞體Bcl-2表達(dá)減少和Bax的過(guò)度表達(dá)可能是DPN的發(fā)病機(jī)制之一。遠(yuǎn)志可通過(guò)調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá)抑制背根節(jié)神經(jīng)元凋亡，保護(hù)DM時(shí)大鼠坐骨神經(jīng)相關(guān)神經(jīng)元胞體，延緩周?chē)窠?jīng)損傷。