鞘內(nèi)注射賽庚啶緩解小鼠骨癌痛

杭黎華，衛(wèi)世有，徐振鍇，蔡玥嬌，李姝娜，彭生

（1.江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院麻醉科，江蘇昆山215300；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院耳鼻喉科，上海200092；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院麻醉科，上海200137）

SET domain containing lysine methyltransferase 7／9（SET7／9）是組蛋白 H3賴氨酸4甲基轉(zhuǎn)移酶，可使NF-κB、STAT3等轉(zhuǎn)錄因子甲基化，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄［1－2］。離體研究證實(shí)，SET7／9可通過激活 NF-κB p65，促進(jìn)炎癥基因的表達(dá)及炎性因子的產(chǎn)生［3］。多項(xiàng)研究證實(shí)，炎性因子與骨癌痛的產(chǎn)生存在著密切聯(lián)系［4－5］。但是，SET7／9是否參與骨癌痛的發(fā)生目前并不明確。因此，本研究擬采用行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、藥理學(xué)及蛋白質(zhì)印跡等方法來探討SET7／9在小鼠骨癌痛中的作用。

1　材料與方法

1.1　動(dòng)物及分組

雄性C3H／HeJ小鼠88只，體質(zhì)量20～25 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司（許可證號(hào)：SCXK2016-0001）。小鼠自由飲水、攝食，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。實(shí)驗(yàn)分2部分：第1部分實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組和骨癌痛組，每組8只小鼠；造模后觀察骨癌痛小鼠機(jī)械痛敏閾值（paw withdrawlmechanical threshold，PWMT）及SET7／9在骨癌痛小鼠脊髓背角中的表達(dá)變化。第2部實(shí)驗(yàn)分為假手術(shù)組、骨癌痛組、骨癌痛＋賽庚啶10 nmol組、骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組、骨癌痛＋SET7／9 0.2μg組、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組（鞘內(nèi)注射SET7／9 30 min后鞘內(nèi)注射賽庚啶）、骨癌痛＋氯苯那敏200μg組，每組8只小鼠；觀察鞘內(nèi)注射賽庚啶對(duì)骨癌痛小鼠痛行為學(xué)及脊髓背角SET7／9表達(dá)的影響。

1.2　小鼠骨癌痛模型的建立

按Schwei等［6］報(bào)道的方法建立小鼠骨癌痛模型。將保存于液氮罐中的NCTC 2472纖維肉瘤細(xì)胞株（美國(guó)ATCC公司）取出，迅速37℃水浴復(fù)蘇，然后將其注入有培養(yǎng)基的離心管中，20℃低速離心5 min。細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)基適當(dāng)稀釋后，在37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用α-MEM培養(yǎng)基懸浮腫瘤細(xì)胞，調(diào)整密度至1×107／mL，置于冰上備用。腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg／kg）麻醉小鼠后，在左膝關(guān)節(jié)處做一個(gè)長(zhǎng)0.5～1 cm的皮膚切口，顯露股骨平臺(tái)；用牙科鉆沿股骨長(zhǎng)軸方向鉆孔進(jìn)入股骨骨髓腔，抽取NCTC 2472腫瘤細(xì)胞懸液20μL（2×105個(gè)），由鉆孔向骨髓腔中緩慢注入。注射完畢后立即采用牙科汞合金封堵穿刺孔，最后縫合切口。

預(yù)實(shí)驗(yàn)中通過行為學(xué)、影像學(xué)及病理學(xué)等證實(shí)，該方法制模成功率在95%左右。本研究通過觀察骨癌痛小鼠PWMT，證實(shí)納入研究的樣本均制模成功。假手術(shù)組小鼠于股骨骨髓腔注射生理鹽水20 μL。第二部分實(shí)驗(yàn)于制模手術(shù)后15 d進(jìn)行鞘內(nèi)注射給藥。

1.3　小鼠鞘內(nèi)藥物注射

SET7／9抑制劑賽庚啶及氯苯那敏購(gòu)自上海Sigma-Aldrich公司；SET7／9蛋白為 Abcam公司產(chǎn)品。賽庚啶、氯苯那敏及 SET7／9均參照 Hylden等［7］的方法進(jìn)行鞘內(nèi)給藥。右手持25μL微量注射器與脊柱上方成20°角于L5～6間隙進(jìn)針，以鼠尾出現(xiàn)突然側(cè)向運(yùn)動(dòng)為成功標(biāo)志；緩慢注藥，注射時(shí)間為5 s，劑量為5μL，留針10 s。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，給10只小鼠鞘內(nèi)注射2%利多卡因，每只5μL，小鼠均出現(xiàn)雙后肢癱瘓，而雙前肢運(yùn)動(dòng)正常，阻滯持續(xù)10～20 min后，雙下肢活動(dòng)恢復(fù)正常，表明鞘內(nèi)注射部位正確。

1.4　小鼠機(jī)械痛敏閾值的檢測(cè)

采用von Frey纖毛測(cè)定小鼠PWMT［8］。小鼠于測(cè)試籠中適應(yīng)30 min，采用對(duì)數(shù)級(jí)數(shù)的von Frey纖毛垂直刺激小鼠左后肢足底中部，當(dāng)小鼠出現(xiàn)快速縮足或甩足時(shí)為陽性反應(yīng)，用 up-down法［9］計(jì)算50%縮足閾值。第1部分實(shí)驗(yàn)檢測(cè)術(shù)前1 d及術(shù)后5、7、12、15 d假手術(shù)組與骨癌痛組小鼠 PWMT；第2部分實(shí)驗(yàn)檢測(cè)鞘內(nèi)給藥前（0 h）及鞘內(nèi)給藥后1、3、6 h各組PWMT。

1.5　蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)小鼠脊髓SET7／9的表達(dá)

鞘內(nèi)注射賽庚啶組脊髓背角取材時(shí)間為鞘內(nèi)注射后6 h。第一部分實(shí)驗(yàn)假手術(shù)組、骨癌痛組及第二部分實(shí)驗(yàn)骨癌痛組、骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組小鼠深麻醉后斷頸處死（n＝4），冰上取小鼠左側(cè)脊髓背角L4～6節(jié)段。溶解于裂解液中，4℃，15 000×g離心15 min，取上清液。SDS-PAGE膠垂直電泳分離蛋白，PVDF轉(zhuǎn)膜45 min，5%脫脂奶粉溶液與室溫孵育1 h；PBST洗膜3次，每次10 min；小鼠抗SET7／9（1∶1 000，Abcam公司）、β-肌動(dòng)蛋白（1∶5 000，Sigma公司）4℃孵育過夜；辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗（1∶500，碧云天生物技術(shù)公司）室溫孵育1 h；滴加化學(xué)發(fā)光液反應(yīng) 1 min，吸干膜上的水分，暗室曝光，圖片掃描。Image J軟件對(duì)圖片進(jìn)行灰度分析。

1.6　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。行為學(xué)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　骨癌痛小鼠痛行為學(xué)改變

兩組小鼠在15 d的觀察期限內(nèi)健康狀況良好，兩組小鼠術(shù)前1 d的PWMT差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與假手術(shù)組比較，骨癌痛組手術(shù)后7，12，15 d PWMT明顯降低（P＜0.05或 0.01）；與術(shù)前1 d相比，骨癌痛組術(shù)后7，12，15 d的PWMT逐漸降低（P＜0.05或0.01）。見表1。

表1　兩組小鼠機(jī)械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

表1　兩組小鼠機(jī)械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與術(shù)前1 d比較

手術(shù)后5 d　7 d　12 d　15 d假手術(shù)組　1.93±0.51　1.83±0.49　1.90±0.52　1.87±0.49　1.8組別　術(shù)前1 d 7±0.48骨癌痛組　1.87±0.48　1.85±0.47　1.38±0.46a　0.83±0.28b　0.51±0.21b t值0.417　0.379　0.032　0.007　0.003 0.697　0.821　5.607　9.773　12.851 P值

2.2　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，術(shù)前1 d假手術(shù)組和骨癌痛組小鼠脊髓背角SET7／9的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與術(shù)后15 d假手術(shù)組或自身術(shù)前1 d相比，術(shù)后15 d骨癌痛組小鼠脊髓背角SET7／9的表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01）。見圖1。

圖1　骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9表達(dá)變化

2.3　鞘內(nèi)注射賽庚啶對(duì)造模后15 d小鼠痛行為學(xué)及脊髓背角SET7／9表達(dá)的影響

由表2可見，鞘內(nèi)注射前（0 h）骨癌痛各組的PWMT均明顯低于假手術(shù)組（P＜0.05）；鞘內(nèi)注射賽庚啶10、20 nmol呈劑量依賴性地增加造模手術(shù)后15 d骨癌痛小鼠的PWMT，在鞘內(nèi)注射賽庚啶3 h后PWMT值達(dá)最高。與鞘內(nèi)注射前0 h相比，骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg組、骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組及骨癌痛＋氯苯那敏200μg組在鞘內(nèi)給藥后1，3，6 h的PWMT均無明顯變化（均 P＞0.05）。

與骨癌痛組相比，骨癌痛＋賽庚啶20 nmol組小鼠在鞘內(nèi)給藥6 h后脊髓背角SET7／9表達(dá)明顯降低（P＜0.01）。見圖2。

表2　鞘內(nèi)注射賽庚啶對(duì)造模手術(shù)后15 d骨癌痛小鼠機(jī)械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

表2　鞘內(nèi)注射賽庚啶對(duì)造模手術(shù)后15 d骨癌痛小鼠機(jī)械痛敏閾值的變化g，±s，n＝8

a：P＜0.05，與同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組比較；b：P＜0.05，與同時(shí)間點(diǎn)骨癌痛組比較；c：P＜0.05，與自身鞘內(nèi)注射前0 h比較

組別　鞘內(nèi)注射前0 h 1 h　3 h　6 h　F值　P值鞘內(nèi)注射后假手術(shù)組　1.87±0.48　1.81±0.44　1.82±0.51　1.85±0.53　2.891　0.901骨癌痛組　0.50±0.18a　0.54±0.16a　0.52±0.17a　0.50±0.15a　3.142　0.974骨癌痛 ＋賽庚啶10 nmol組　0.53±0.19a　0.55±0.18a　0.96±0.24a，b，c　0.54±0.17a　3.443　0.043骨癌痛 ＋賽庚啶20 nmol組　0.51±0.17a　0.89±0.23a，b，c 1.53±0.41b，c　0.55±0.16a　4.761　0.001骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg組　0.52±0.17a　0.51±0.16a　0.53±0.17a　0.52±0.15a　2.761　0.837骨癌痛 ＋SET7／9 0.2μg＋賽庚啶20 nmol組　0.51±0.18a　0.54±0.18a　0.58±0.18a　0.52±0.16a　3.004　0.887骨癌痛 ＋氯苯那敏200μg組　0.52±0.18a　0.52±0.14a　0.53±0.14a　0.52±0.14a　2.998　0.864 F值3.681　4.207　4.539　3.740 P值0.004　0.001　0.000　0.003

圖2　鞘內(nèi)注射賽庚啶對(duì)骨癌痛小鼠脊髓SET7／9表達(dá)的影響

3　討論

表觀遺傳學(xué)是指基于非基因序列改變所致基因表達(dá)水平的變化，即通過組蛋白修飾、DNA甲基化及非編碼 RNA調(diào)控等方式對(duì)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控［10］。組蛋白修飾包括甲基化、乙酰化、磷酸化等。研究表明，表觀遺傳學(xué)參與慢性疼痛的調(diào)控過程［11］。SET7／9是催化染色質(zhì)組蛋白H3K4單甲基化的關(guān)鍵酶。Laumet等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)病理性疼痛模型中，組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a在背根神經(jīng)節(jié)中表達(dá)明顯增加，鞘內(nèi)注射G9a抑制劑UNC0638可明顯減輕小鼠的痛覺過敏。本研究結(jié)果顯示，骨癌痛小鼠脊髓背角SET7／9的表達(dá)顯著增加，鞘內(nèi)注射SET7／9抑制劑賽庚啶可明顯減輕小鼠骨癌痛且顯著降低脊髓背角SET7／9的表達(dá)水平，提示SET7／9可能參與小鼠骨癌痛的發(fā)展過程。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射賽庚啶20 nmol可明顯緩解小鼠骨癌痛，鞘內(nèi)預(yù)先注射SET7／9 0.2μg對(duì)骨癌痛小鼠痛行為學(xué)沒有影響，但卻可抵消20 nmol賽庚啶緩解骨癌痛的作用，提示SET7／9在骨癌痛中起重要作用。預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射賽庚啶60 nmol對(duì)自主小鼠的痛行為學(xué)沒有明顯影響，故本實(shí)驗(yàn)中選擇賽庚啶10、20 nmol鞘內(nèi)注射，應(yīng)可排除賽庚啶本身的藥理作用對(duì)小鼠痛行為學(xué)的干擾，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。這一觀察結(jié)果與Suh等［13］的研究相似，該研究證實(shí)鞘內(nèi)注射賽庚啶0.31～62 nmol對(duì)自主小鼠痛行為學(xué)沒有影響。鞘內(nèi)注射是研究藥物作用于脊髓的好方法［7］，但鞘內(nèi)注射賽庚啶不可避免地也可作用于背根神經(jīng)節(jié)。因此，本研究結(jié)果顯示賽庚啶可減輕骨癌痛，也可能包含背根神經(jīng)節(jié)SET7／9參與骨癌痛的外周機(jī)制。賽庚啶除了對(duì)SET7／9有抑制作用外，還有潛在的拮抗H1受體的作用。研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射足量拮抗H1受體作用的氯苯那敏 200μg［14］，對(duì)骨癌痛小鼠痛行為學(xué)沒有明顯影響，提示賽庚啶減輕骨癌痛主要是通過抑制SET7／9。綜上所述，脊髓SET7／9可能參與小鼠骨癌痛的發(fā)展過程。

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