骨癌痛及其動物模型研究進展

黃金路,郭澄

上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院 藥劑科，上海 200233

臨床上，乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、 肺癌、胃腸道癌等均可不同程度地發(fā)生骨轉移[1]，已發(fā)現(xiàn)癌轉移到骨的部位有脊椎、肋骨、骨盆、長骨。據(jù)報道，乳腺癌和前列腺癌晚期患者骨轉移的發(fā)生率高達90%[2]，且在我國呈上升趨勢；肺癌、甲狀腺癌和腎癌患者骨轉移的發(fā)生率高達40%[3]，其中女性甲狀腺癌的發(fā)病率增幅較快[4]。顯而易見，受骨癌痛影響的患者眾多。目前，臨床治療骨癌痛的藥物主要有非甾體抗炎藥（塞來昔布、吲哚美辛、對乙酰氨基酚等）、阿片類藥物（嗎啡、羥考酮等）、非阿片類中樞性鎮(zhèn)痛藥（曲馬多）及一些輔助藥物，如阿米替林、加巴噴丁、普瑞巴林。這些鎮(zhèn)痛藥物易誘發(fā)諸多不良反應，如成癮、耐受、便秘、呼吸抑制、皮膚瘙癢、骨量丟失誘發(fā)骨折、胃腸道不良反應等。2019年12月，美國FDA發(fā)出警告，用于治療神經(jīng)損傷引起的疼痛、纖維肌痛的加巴噴丁和普瑞巴林可能會引起嚴重的呼吸困難。因此，現(xiàn)有治療骨癌痛的鎮(zhèn)痛藥物在安全和療效方面的不足致使骨癌痛患者服用該類藥物的依從性大幅下降，繼而使疼痛得不到有效控制，形成惡性循環(huán)。

另一方面，迄今對骨癌痛的發(fā)生和發(fā)展機制尚未完全闡明，這也極大地阻礙了骨癌痛的有效治療。為此，眾多國內(nèi)外學者堅持不懈地探索著。在過去的30多年里，骨癌痛的治療盡管有了較大進展，但效果不盡人意。患者的痛苦催促學者們開發(fā)了不同類型的骨癌痛模型，對骨癌痛進行持續(xù)不斷的深入研究，以期探明骨癌痛的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)新型鎮(zhèn)痛藥物靶點及作用機制。

1985年意大利學者首次報道了硬膜外給予丁丙諾啡和嗎啡對骨癌痛的治療[5]，而骨癌痛模型的首次建立則是在15年后，Mantyh團隊利用NCTC2472小鼠骨肉瘤細胞制備了小鼠骨癌痛模型[6]。自此，骨癌痛動物模型已有近10種，取得了諸多進展。在此，我們簡要綜述骨癌痛動物模型的進展及相關研究。

1 骨肉瘤細胞誘導的骨癌痛模型及相關研究進展

1999年，Mantyh等利用NCTC2472小鼠骨肉瘤細胞首次建立了小鼠骨癌痛模型，此模型是將懸浮于20 μL含1%BSA的αMEM培養(yǎng)液的105個NCTC2472細胞自C3H/HeJ正常小鼠（體質量20～25 g）股骨的遠端注射入骨髓腔，注射21 d后發(fā)生明顯的骨損壞和疼痛行為反應，證明在手術側脊髓神經(jīng)膠質細胞大量肥大增生，而且發(fā)生強啡肽和c-Fos表達增強、P物質受體內(nèi)化等神經(jīng)化學和細胞重塑變化[6]；不久，他們又利用該骨肉瘤小鼠骨癌痛模型證明了炎性疼痛、神經(jīng)源性疼痛及骨癌痛的神經(jīng)化學變化的異同，提出骨癌痛是一種獨特的疼痛[7-8]。

進入21世紀后，該團隊在Nature Medicine和Cancer Research報道，在骨肉瘤小鼠骨癌痛模型上護骨蛋白（osteoprotegerin）能夠顯著阻斷骨癌痛和脊髓神經(jīng)化學重塑，并改善手術側股骨的骨密度[9-10]。在這些研究基礎上，Mantyh團隊在使用該小鼠骨癌痛模型對骨癌痛發(fā)病的驅動機制的研究方面又不斷有新的進展。比如Ghilardi等報道辣椒素受體TRPV1（transient receptor potential vanilloid subtype 1）在支配小鼠股骨的神經(jīng)元細胞中高表達，給予TRPV1選擇性拮抗劑JNJ-17203212（皮下注射）、ABT-102（口服）或干擾TRPV1基因表達可明顯減輕持續(xù)性和運動誘發(fā)的傷害性疼痛行為，口服給予Trk選擇性高效抑制劑 ARRY-470（對 TrkA、TrkB、TrkC 的 IC50分別為6.5、8.1和10.6 nmol/L）也可有效減輕骨癌痛和降鈣素基因相關肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）表達[11-13]；Sevcik等皮下給予緩激肽B1受體選擇性強效拮抗劑（LF22-0542、B6769）也可減輕骨癌痛[14]，注射抗-NGF抗體能夠顯著降低骨癌痛及其伴隨的外周和中樞敏化的生物標記物（如 CGRP、TrkA、c-Fos等）的表達[15]，緩解 40%～70%的疼痛[16]；Halvorson等靜脈注射伊班膦酸能夠快速減輕骨癌痛的疼痛和中樞敏化的神經(jīng)化學指標（如GFAP、c-Fos、強啡肽原等）[17]。

后來該模型也逐漸被其他研究團隊所認可并使用。我國學者在該小鼠骨癌痛模型上證明脊髓Mas相關G蛋白偶聯(lián)受體亞型C（Mas-related G-protein-coupled receptor subtype C，MrgC）泛素化后，可能通過降低神經(jīng)元鈣離子濃度而減輕骨癌痛[18]；另一研究小組在該小鼠骨癌痛模型上外源性給予L-NMMA（一種一氧化氮合成酶抑制劑）可有效降低骨癌痛[19]；隨后證明了依那西普可通過降低骨癌誘導的TNF-α升高以及疼痛相關的行為[20]。以上研究表明利用NCTC2472小鼠骨肉瘤細胞股骨內(nèi)孵育建立的骨癌痛模型得到了很好的應用。

不僅在股骨注射癌細胞可產(chǎn)生骨癌痛模型，其他部位的骨（如跟骨）也能制備骨癌痛模型。Wacnik等用 10 μL含 2×105NCTC2472骨肉瘤細胞的無菌PBS細胞懸液在近遠端注射入C3H/He小鼠的跟骨，植入后第7 d開始產(chǎn)生機械性疼痛。在此模型上研究表明掌內(nèi)注射內(nèi)皮素A受體拮抗劑BQ-123可部分阻斷腫瘤相關的機械性疼痛[21]；表皮神經(jīng)纖維的數(shù)量隨著疼痛的發(fā)生而減少[22]。然而，該小鼠骨癌痛模型可能由于操作不便等原因，并未被廣泛使用。

2 前列腺癌細胞誘導的骨癌痛模型及相關研究進展

受小鼠骨肉瘤骨癌痛模型研究的啟發(fā)，Mantyh團隊的Halvorson等后來又將含105犬前列腺癌ACE-1細胞的20 μL Hank's溶液注射于無胸腺裸鼠的股骨骨髓腔內(nèi)，率先建立了前列腺癌小鼠骨癌痛模型，在該模型上發(fā)現(xiàn)腹腔注射抗-NGF抗體可減輕骨癌痛，其機制可能是阻斷了由NGF激活或敏化的TrkA和p75疼痛受體[23]。在另一研究中，運用該小鼠骨癌痛模型，口服給予多靶點（CSF1R、c-kit、FLT3）拮抗劑PX3397可減輕ACE-1前列腺癌細胞誘導的骨痛，鎮(zhèn)痛效率約50%[24]。在另一個研究小組，Zhang等則在雄性大鼠脛骨內(nèi)孵育另一種前列腺癌細胞AT3.1建立了骨癌痛模型，并誘發(fā)模型大鼠的脊髓GFAP和OX-42免疫熒光增強，表明星形膠質細胞和小膠質細胞被顯著激活，同時手術側脊髓星形膠質細胞IL-1β表達升高[25]。然而該前列腺癌細胞誘導的骨癌痛模型并未被廣泛使用，可能是由于AT3.1前列腺癌細胞系獲得較困難。

3 乳腺癌細胞誘導的骨癌痛模型及相關研究進展

英國的Medhurst等在2002年率先運用MRMT大鼠乳腺癌細胞系在大鼠脛骨外側注射3 μL含MRMT細胞的Hank's液到骨髓腔內(nèi)，10 d后產(chǎn)生進展性機械性疼痛，表明用該方法成功建立了大鼠骨癌痛模型[26]。Meng等用該模型研究發(fā)現(xiàn)骨癌痛大鼠顯示了骨損壞和敏感的疼痛行為，同時在脊髓伴隨白細胞浸潤增加，星形膠質細胞激活、線粒體裂變-融合動力學的不平衡以及降低SIRT1（mammalian silentinformation regulator2 homolog）蛋白表達和磷酸化，并升高Drp1蛋白（dynamin-related protein 1）；鞘內(nèi)注射2-溴棕櫚酸酯和SIRT1激動劑SRT1720可明顯減輕骨癌痛大鼠的疼痛行為，同時降低脊髓炎癥，反轉脊髓線粒體裂變-融合動力學的不平衡，并進一步抑制線粒體凋亡[27]。

此外，在該骨癌痛模型上發(fā)現(xiàn)了多種可能的鎮(zhèn)痛靶點，如神經(jīng)肽Y[28]、傷害感受素/孤兒素FQ受體系統(tǒng)[29]、Src激酶[30]、P2X7 受體[31]、酸敏感離子通道 3（ASIC3）[32]、GDNF[33]、賴氨酸特異性脫甲基化 酶 1（lysine-specific demethylase 1，LSD1）[34]、KCNQ/M（Kv7）鉀離子通道[35]、TRPV1[36]、BDNF[37]、大麻素受體[38]等

在另一個由Vanderah領導的研究小組，Lozano-Ondoua等首次將105小鼠乳腺癌66.1細胞注射入BALB/cfC3H小鼠，14 d后手術側足爪縮腳反應閾值較對照組明顯減低，表明此種方法可成功建立骨癌痛模型。在該骨癌痛模型上，系統(tǒng)性給予大麻素（cannabinoid）2型受體激動劑AM1241、JWH015，激動大麻素2型受體后不僅可顯著減輕癌細胞增殖和炎癥介質的產(chǎn)生、降低骨重塑，而且更為重要的是可有效減輕嚴重骨癌痛、骨量丟失以及癌癥相關的骨折發(fā)生率[39]。在前期研究基礎上，F(xiàn)orte等證明Ang（1-7）/MasR激活可顯著減輕骨癌痛，而注射MasR拮抗劑A-779可降低其鎮(zhèn)痛效應[40]。

2005年，我國科研團隊創(chuàng)新性地在脛骨骨髓腔內(nèi)接種Walker256大鼠乳腺癌細胞，制備了骨癌痛模型[41]。Yang等利用該模型證明骨癌導致腦脊液中ATP水平升高，脊髓小膠質細胞中P2X7受體、磷酸化p38、IL-18升高，而抑制脊髓P2X7/p-38/IL-18通路可明顯降低進展期骨癌痛[42]。此外，我國另一個科研團隊報道在該模型上激活脊髓GLP-1受體和α7煙堿型乙酰膽堿受體可誘發(fā)IL-10/β內(nèi)啡肽的表達和釋放，從而對骨癌痛產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用[43-44]。

在該大鼠骨癌痛模型上，也證明了脊髓D-型氨基酸氧化酶（D-amino acid oxidase，DAAO）的高表達有助于骨癌痛的發(fā)生和維持，而且不管系統(tǒng)性還是局部鞘內(nèi)給予DAAO特異性高效抑制劑CBIO（IC50=90～188 nmol/L），能夠劑量依賴性地抑制脛骨內(nèi)孵育Walker256大鼠乳腺癌細胞誘導的骨癌痛，最大效能為40%～50%，其機制可能是抑制脊髓過氧化氫的產(chǎn)生，進而抑制脊髓星形膠質細胞的活化，從而減輕骨癌痛[45]；后又在該模型上證明用鉤吻堿（gelsemine）激活α3甘氨酸受體也可產(chǎn)生鎮(zhèn)痛作用，最大鎮(zhèn)痛效果為50%～60%[46]。經(jīng)過國內(nèi)外眾多學者的驗證，該模型已被廣泛認可并使用，利用該模型已發(fā)現(xiàn)有數(shù)十種靶標分子參與骨癌痛的病理過程。2016年，Shenoy等對此進行了系統(tǒng)總結，新發(fā)現(xiàn)的靶點有TLR4、NMDA、EphB1/B2受體、DAAO等[47]。我們也率先報道了神經(jīng)酰胺激酶（ceramide kinase，CerK）和鞘氨醇-1-磷酸受體 1（sphingosine-1-phosphate receptor 1，S1PR1）可能是神經(jīng)酰胺代謝系統(tǒng)中治療骨癌痛的2個靶點分子[48]。上述許多潛在的鎮(zhèn)痛靶點是由國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)的。因此，國內(nèi)學者在此領域做出了重要貢獻。也由此足見，骨癌痛的發(fā)病機制極其復雜。

目前開發(fā)的骨癌痛模型有近10種，可從不同的角度對其進行分類。從動物角度主要有大鼠和小鼠模型；而從制備骨癌痛模型使用的細胞類型角度分類，主要有乳腺癌細胞系（如大鼠乳腺癌細胞MRMT和Walker256細胞系、小鼠乳腺癌細胞66.1細胞系）、前列腺細胞系（犬前列腺癌細胞ACE-1細胞系和大鼠前列腺癌細胞AT3.1細胞系）、骨肉瘤細胞系（小鼠骨肉瘤細胞NCTC2472細胞系），這幾種癌種在臨床上發(fā)生骨轉移的概率較高。如前所述，骨轉移發(fā)生概率較高的癌種中還有甲狀腺癌、肺癌、胃腸道癌，但針對這幾種癌種的骨癌痛模型尚未見報道。另外，從接種癌細胞的骨的部位可分為跟骨部位的骨癌痛模型、脛骨部位的骨癌痛模型及股骨部位的骨癌痛模型等3種類型。國內(nèi)學者使用Walker256乳腺癌細胞脛骨內(nèi)孵育制備骨癌痛大鼠模型較多，主要原因可能是由于Walker256大鼠乳腺癌細胞是懸浮細胞，獲得方便，易于培養(yǎng)和收集；在大鼠的脛骨部位接種癌細胞比較方便，易于制備且可重復；該種骨癌痛模型能夠非常好地模擬人類骨癌痛的病理學特征，與臨床具有很高的相關性，這也是最重要的一點。骨癌痛動物模型的開發(fā)為闡明骨癌痛的發(fā)病機制、靶點驗證奠定了試驗基礎，更重要的是為研發(fā)安全有效治療骨癌痛的藥物提供了新思路，具有重要且長遠的社會和經(jīng)濟意義。