胃癌組織DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α等8種分子的蛋白表達(dá)與脈管侵犯的關(guān)系

戴東方，陳德玉，李小琴，顧漢剛，王德強(qiáng)

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇鎮(zhèn)江212001）

我國(guó)每年新發(fā)胃癌病例近70萬(wàn)，位居世界首位［1－2］。根治性手術(shù)仍然是胃癌最主要的治愈性手段，但患者術(shù)后仍然普遍面臨復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）的胃癌臨床實(shí)踐指南將低分化、脈管侵犯、神經(jīng)侵犯、年齡＜50歲及非D2根治術(shù)均列為術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的高危因素［3］。其中，脈管侵犯與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的密切關(guān)系已有報(bào)道［4－6］，但伴脈管侵犯胃癌的分子特征尚不清楚。因此，本研究回顧性比較了有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者之間常見(jiàn)的8種免疫組化分子標(biāo)志物表達(dá)的差異。

1　對(duì)象與方法

1.1　病例

收集2012年1月1日至2014年1月1日在江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)治療的胃癌患者242例，其中男179例，女63例；年齡35～75歲，中位年齡60歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18～75歲；② 病理學(xué)確診為胃腺癌；③術(shù)前未行放化療及生物靶向治療。

1.2　主要試劑

微管蛋白 β3、胸苷酸合酶（thymidylate synthase，TS）、非轉(zhuǎn)移蛋白 23（nonmetastatic protein 23，NM23）、P糖蛋白、增殖標(biāo)記Ki-67、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α（topoisomerase 2-alpha，TOP2A）、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)酶1（excision repair cross-complementation group 1，ERCC1）及人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）的抗體，免疫組織化學(xué)染色試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺顯色試劑盒等均購(gòu)自珠海泉暉公司。

1.3　HE染色判斷脈管侵犯

石蠟包埋的組織樣本切片厚度為5μm，行HE染色。脈管侵犯的定義為腫瘤細(xì)胞對(duì)血管或淋巴管管壁的侵犯或者在內(nèi)皮細(xì)胞襯里的空間中發(fā)現(xiàn)瘤栓［7］。血管或淋巴管管腔的識(shí)別［5］：① 內(nèi)皮細(xì)胞襯里；②有平滑肌或彈性組織支撐；③有淋巴液或紅細(xì)胞填充。

1.4　免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)

免疫組織化學(xué)染色采用SP法，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，空白對(duì)照為PBS液，陽(yáng)性對(duì)照為各受檢分子的陽(yáng)性切片。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：HER2的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)病理學(xué)會(huì)和臨床腫瘤學(xué)會(huì)的專項(xiàng)指南［8］。其他分子標(biāo)志物的結(jié)果判讀采用半定量法，即染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例與染色強(qiáng)度等級(jí)之積［9］，具體為① 計(jì)算每張切片中陽(yáng)性細(xì)胞的百分比：選擇10個(gè)高倍視野（×400），每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞少于10%為0級(jí)，10%～25%為1級(jí)，26%～50%為2級(jí)，51%～75%以上為3級(jí)，76%～100%為4級(jí)；②判讀染色強(qiáng)度：無(wú)著色為0級(jí)，淺棕色為1級(jí)，棕色為2級(jí)，深棕色為3級(jí)；③ 根據(jù)二者之乘積，≥6為高表達(dá)，＜6為低表達(dá)。

1.5　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料采用雙側(cè)χ2檢驗(yàn)。雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者臨床病理特征的比較

242例患者中有脈管侵犯81例（33.5%）。在有脈管侵犯胃癌患者中，女性、腫瘤最大徑≥5cm、伴神經(jīng)侵犯及TNM分期Ⅲ－Ⅳ期的比例均顯著高于無(wú)脈管侵犯胃癌患者（P＜0.05或 P＜0.001）。見(jiàn)表1。

2.2　有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者8種分子的蛋白表達(dá)

如圖1所示，棕褐（黑）色顆粒為染色陽(yáng)性，染色陽(yáng)性的 Ki-67、TOP2A及ERCC1主要見(jiàn)于細(xì)胞核，而微管蛋白 β3、TS、NM23、P糖蛋白及 HER2在胞核胞質(zhì)均可見(jiàn)陽(yáng)性染色。有脈管侵犯胃癌患者的TOP2A高表達(dá)率為89.3%，顯著高于無(wú)脈管侵犯者的72.9%（P＜0.05），而微管蛋白 β3、TS、NM23、P糖蛋白、Ki-67、ERCC1及HER2的高表達(dá)率在兩組間無(wú)顯著差異（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

表1　有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者臨床病理特征的比較

圖1　各分子標(biāo)志物的陽(yáng)性染色（免疫組織化學(xué)染色×200）

表2　有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者8種分子的表達(dá)差異

續(xù)表

2.3　有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者TOP2A表達(dá)的亞組比較

有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者之間TOP2A高表達(dá)率的差異主要出現(xiàn)于女性（100%vs 72.2%，P＝0.045）和組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)的亞組中（89.3%vs 67.6%，P＝0.040）。在其他臨床病理特征的亞組中均未發(fā)現(xiàn)TOP2A高表達(dá)率在兩組間存在顯著差異。見(jiàn)表3。

3　討論

脈管侵犯是腫瘤細(xì)胞對(duì)血管或淋巴管的侵犯，在各種腫瘤中均較為常見(jiàn)。在胃癌中，伴脈管侵犯者的比例報(bào)道不一。在一項(xiàng)中國(guó)南方人群的研究中，采用HE染色法從1 148例胃癌患者中發(fā)現(xiàn)伴脈管侵犯者比例為 35.2%（404例）［5］。此前，del Casar等［10］采用HE染色與CD34免疫組化檢測(cè)相結(jié)合的方法在胃癌中辨別脈管侵犯，報(bào)道的比例為31.9%。以上均與本組人群33.5%的脈管侵犯比例相近。但是，Kim等［11］完全采用D2－40及CD34免疫組化法在胃癌中檢測(cè)得到的結(jié)果為44.3%，表明不同方法對(duì)結(jié)果有影響。HE染色法是目前應(yīng)用最廣泛且簡(jiǎn)單易行的判定脈管侵犯的方法，并且該方法所得結(jié)果與腫瘤患者臨床結(jié)局之間具有顯著相關(guān)性，表明了該方法的可靠性［12－14］。

脈管侵犯是腫瘤局部擴(kuò)散的重要途徑。研究顯示，脈管侵犯與腫瘤侵襲能力及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，同時(shí)提示脈管侵犯與腫瘤預(yù)后的相關(guān)性［12－15］。在胃癌中，早期的數(shù)項(xiàng)小樣本研究均發(fā)現(xiàn)脈管侵犯者的生存期較無(wú)脈管侵犯者短［10－11，16］。而 Li等［5］包括了1 148例胃癌患者的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)脈管侵犯是預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。最近，Zhao等［4］在1 019例中國(guó)西部胃癌患者中的結(jié)果也證實(shí)了脈管侵犯獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測(cè)作用，且與淋巴結(jié)計(jì)數(shù)和腫瘤大小聯(lián)合可以進(jìn)一步提高預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

表3　有和無(wú)脈管侵犯胃癌患者TOP2A表達(dá)的亞組比較

脈管侵犯與胃癌臨床病理特征關(guān)系的報(bào)道較為一致，例如與腫瘤大小、分化、神經(jīng)侵犯及分期等顯著相關(guān)［4－6，10－11，16］，本研究的結(jié)果亦與之相符。本研究結(jié)果表明，有脈管侵犯者的TOP2A高表達(dá)率顯著高于無(wú)脈管侵犯者，且這種差異在女性及組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)的患者中尤為明顯，提示伴脈管侵犯者尤其是某些亞組有獨(dú)特的分子特征。

TOP2A基因編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶2α，通過(guò)對(duì)DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的控制，在DNA轉(zhuǎn)錄和復(fù)制過(guò)程中起著關(guān)鍵作用［17］。最近，一項(xiàng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究和一項(xiàng)基因芯片研究均提示TOP2A是胃癌發(fā)生過(guò)程中的關(guān)鍵性基因［18－19］。更為重要的是，Terashima等［20］發(fā)現(xiàn)TOP2A基因mRNA表達(dá)水平與胃癌復(fù)發(fā)有關(guān)，是胃癌復(fù)發(fā)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。因此，本研究關(guān)于脈管侵犯者TOP2A高表達(dá)率較高的結(jié)果，可能提示了脈管侵犯及其預(yù)后差的一種分子機(jī)制。

TOP2A是蒽環(huán)類化療藥的直接靶標(biāo)。最近的一項(xiàng)納入了2 012例早期乳腺癌患者的3期臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TOP2A與蒽環(huán)類藥物輔助化療的療效有關(guān)［21］。蒽環(huán)類也是胃癌的有效治療藥物，3期臨床試驗(yàn)證實(shí)了含表柔比星化療方案在胃癌術(shù)后輔助化療 中 的 療 效［22－24］。此 外，Terashima等［20］發(fā) 現(xiàn)TOP2A高表達(dá)胃癌患者在替吉奧輔助化療后的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間顯著劣于低表達(dá)者，提示TOP2A與氟尿嘧啶類藥物療效有關(guān)。因此，本研究關(guān)于脈管侵犯者TOP2A高表達(dá)率較高的結(jié)果，可能也提示此類患者對(duì)上述藥物的抗性，值得進(jìn)一步研究。

綜上所述，伴脈管侵犯胃癌患者的TOP2A蛋白表達(dá)升高，特別是在女性和組織學(xué)分級(jí)Ⅲ級(jí)患者中更為明顯。結(jié)合 TOP2A現(xiàn)有的臨床意義，提示TOP2A在伴脈管侵犯胃癌患者中的臨床相關(guān)性，可以作為未來(lái)的研究方向之一。

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