GC-FID內(nèi)標法測定活血止痛搽劑中乙醇的含量

李世學，郭小玲，易洪宇

萍鄉(xiāng)市婦幼保健院臨床藥學室(江西 萍鄉(xiāng) 337000)

活血止痛搽劑為萍鄉(xiāng)市婦幼保健院骨科臨床使用多年的經(jīng)驗方，該方具有活血止痛，祛瘀通絡(luò)的功效，用于跌打損傷等骨科疾病。活血止痛搽劑制備方法采用不同濃度的乙醇浸泡兩周，取上清液，濾過，分裝，即得。該搽劑通過乙醇提取，醇沉工藝制備而成。其制備所得酊劑中乙醇濃度的多少，決定著該制劑的有效成分的保留率和無效成分的去除率。因此對其乙醇濃度的精準測定，決定著產(chǎn)品的質(zhì)量[1-2]。在對含乙醇的制劑中乙醇含量的測定，目前常見的測定方法主要包括酒精計法、計算法、倍數(shù)法[3]，此三種測定方法，均為工業(yè)生產(chǎn)制劑中乙醇含量的大致測定方法，均不能精準的測定其乙醇濃度[4]，同時，測定結(jié)果不穩(wěn)定，測定結(jié)果與實際測定結(jié)果偏差較大。

目前測定乙醇的含量(GC)已有文獻報道[5-7]，參考文獻報道確立了本方法，建立GC-FID內(nèi)標法，以期為活血止痛搽劑中乙醇含量的測定提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1儀器與試藥Agilent 7820A氣相色譜儀、Agilent7820AGC Remote Controller ChenStation Edition氣相工作站?；钛雇床雱?自制，批號：20210320，20210321，20210322)，乙醇、正丙醇為色譜純，水為超純水。

1.2色譜條件色譜柱：DB-1鍵合交聯(lián)聚乙二醇為固定液的毛細管柱(60 m×0.32 mm×0.32 μm，Agilent Technologies)；柱溫起始溫度50 ℃，維持7 min，再以10 ℃/min的速率升溫至110 ℃；進樣口溫度190 ℃；檢測器溫度220 ℃；CT-1A型氮氫空氣發(fā)生器(杭州伽軒科技有限公司，JP-300型)，固定分流比為10∶1；進樣量1 μL；采樣時間7 min，理論板數(shù)按乙醇峰計算應(yīng)不低于8 000，乙醇峰與正丙醇峰的分離度大于1.5。

2 方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1 對照品溶液制備 精密量取恒溫至20 ℃的無水乙醇5 mL，置于100 mL量瓶中，精密加入恒溫至20 ℃的正丙醇(內(nèi)標物質(zhì))5 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻作為對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取20 ℃的活血止痛搽劑一批(批號2021032)5 mL，置100 mL量瓶中，精密加入恒溫至20 ℃的正丙醇5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

2.1.3 校正因子測定 精密量取恒溫至20 ℃的無水乙醇4 mL、5 mL、6 mL，分別置100 mL量瓶中，分別精密加入恒溫至20 ℃的正丙醇(內(nèi)標物質(zhì))5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述各溶液1 mL，分別置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取上述3種溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，分別連續(xù)進樣3次，測定峰面積，計算校正因子f。

f=(As/Cs)/(AR/CR)

As：內(nèi)標物質(zhì)的峰面積；AR：對照品的峰面積；Cs：內(nèi)標物質(zhì)溶液的濃度；CR：對照品溶液的濃度。

2.2方法學試驗

2.2.1 專屬性考察 取超純水空白溶液、對照品溶液和供試品溶液，按1.2色譜條件，分別進樣1 μL，采集氣相色譜圖，結(jié)果顯示乙醇色譜峰與內(nèi)標物正丙醇色譜峰完全分離，供試品乙醇色譜峰保留時間與對照品對應(yīng)一致且無干擾，分離度>1.5，空白溶液在相應(yīng)的保留時間位置無干擾峰出現(xiàn)，表明該方法專屬性良好，見圖1。

A：對照品溶液；B：供試品溶液；C空白溶液。

2.2.2 線性關(guān)系考察 取上述制備的對照品溶液，分別精密量取恒溫至20 ℃的無水乙醇1、2、5、10、25、50 mL，分別置于100 mL量瓶中，精密加入恒溫20 ℃的正丙醇(內(nèi)標物質(zhì))5 mL，加水稀釋定容至100 mL，搖勻，精密量取上述溶液1 mL，分別置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，制備為不同系列的對照品溶液，按上述1.2色譜條件，分別進樣1 μL，采集氣相色譜圖，記錄峰面積，以進樣濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸分析，繪制標準曲線，計算回歸方程，回歸方程為Y=2.578 1×103X-10 224.80，r=0.999 7(n=6)。結(jié)果表明：乙醇在0.001%～0.05%的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3 精密度考察 取上述對照品溶液，按1.2項色譜條件連續(xù)進樣6次，每次進樣1 μL，記錄峰面積，結(jié)果，乙醇峰面積RSD=0.81%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取上述制備的供試品溶液，按1.2項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h時，分別進樣1 μL，記錄峰面積，結(jié)果，乙醇峰面積的RSD=1.67%(n=6)；表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗 取活血止痛搽劑(批號20210320)，按供試品制備方法，制備6份，按1.2項下色譜條件，分別進樣1 μL，記錄乙醇和正丙醇色譜圖，以內(nèi)標法計算乙醇的含量，結(jié)果乙醇平均濃度為74.26%，RSD=1.55%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 加樣回收率試驗 精密量取活血止痛搽劑(批號20210320)3 mL，連續(xù)量取6份，分別置于100 mL量瓶中，分別加入無水乙醇2 mL，然后精密加入恒溫至20 ℃的正丙醇5 mL，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按上述1.2項下色譜條件進行測定，分別進樣1 μL，記錄乙醇和正丙醇色譜圖，以內(nèi)標法計算峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率為100.33%，RSD=1.57%(n=6)，結(jié)果表明該實驗良好，數(shù)據(jù)可靠，方法可行。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.33批活血止痛搽劑中乙醇的濃度測定3批活血止痛搽劑中乙醇的平均濃度為74.70%，止痛搽劑中乙醇濃度的RSD為0.54%，表明3批樣品乙醇濃度偏差較小，乙醇濃度相當，見表2。

表2 3批活血止痛搽劑中乙醇的濃度結(jié)果

3 討論

采用氣相色譜法以氦或氬等作為載氣，通過將乙醇液體稀釋后注入色譜柱中，采用合適的檢測溫度，將所需測定組分分離，從而測定其待測組分的含量[8-9]，該方法應(yīng)用范圍廣，樣品用量少，靈敏度高，可測得實際濃度[10]。

本實驗采用氣相色譜-毛細管柱法，建立GC-FID，正丙醇作內(nèi)標物法測定活血止痛搽劑中乙醇濃度，用此方法準確度高，可準確測定其制劑制備過程中的乙醇濃度控制和成型制劑后的質(zhì)量檢測提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。雖然本實驗測定的乙醇濃度準確度較高，但是乙醇濃度的不同，導(dǎo)致其制劑中有效成分的溶出情況不同，因此后續(xù)將根據(jù)溶出的有效成分，進行最佳乙醇濃度的工藝篩選，同時對活血止痛搽劑的藥理及臨床療效研究，將為后續(xù)研究的重點。