基于cGMP-PKG/PKA信號(hào)通路探究奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠認(rèn)知功能的干預(yù)機(jī)制

高飛, 姚淑芳, 陶有亮

三門峽市中心醫(yī)院 1藥學(xué)部， 2神經(jīng)內(nèi)科(河南三門峽 472000)； 3三門峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)護(hù)學(xué)院(河南三門峽 472000)

急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)是臨床上常見的一種腦血管疾病，是由于患者腦供血突然中斷而導(dǎo)致的腦組織軟化和壞死，具有較高的致殘率和病死率，嚴(yán)重影響患者生命健康[1-2]。奧扎格雷作為一種高選擇性的TXA2合成酶抑制劑，可有效促進(jìn)前列環(huán)素的生成，進(jìn)而抑制各種炎性因子的分泌，可擴(kuò)張患者的腦血管，增加腦梗死區(qū)域的血流量，加快患者受損腦組織恢復(fù)進(jìn)程[3]。環(huán)磷酸鳥苷-蛋白激酶G(cGMP)是細(xì)胞內(nèi)普遍存在的第二信使，主要作用于三磷酸鳥苷，在腦卒中患者中激活的cGMP可促進(jìn)蛋白激酶G(PKG)活性的增強(qiáng)，進(jìn)而對(duì)梗死組織起到一定的保護(hù)作用[4-5]。蛋白激酶A(PKA)在神經(jīng)元突觸及生長中起著重要的作用[6]。鑒于此，本研究于2020年1月至2021年3月選取32只清潔及健康的雄性昆明大鼠，研究基于cGMP-PKG/PKA信號(hào)通路探究奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠認(rèn)知功能的干預(yù)機(jī)制。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。

1 材料與方法

1.1 材料 選取32只清潔及健康的雄性昆明大鼠，鼠齡為2～3個(gè)月，平均(2.63±0.22)個(gè)月，體重為200～300 g，平均(237.50±47.50)g，大鼠均購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可批號(hào)：SCXK(滬)2003-0002。大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境為：溫度27℃，濕度70%，自由飲食飲水。

1.2 方法

1.2.1 ACI模型大鼠的建立 從清潔及健康的32只大鼠中隨機(jī)選取24只建立ACI模型，腹腔注射40 mg/100 g水合氯醛，麻醉后沿大鼠頸部中線切開皮膚，暴露大鼠的右側(cè)頸總動(dòng)脈，然后夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈處剪一個(gè)小切口，切口處插入線栓，然后將線栓經(jīng)大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈處伸入大腦前動(dòng)脈，直至出現(xiàn)阻力。建模大鼠神經(jīng)行為學(xué)分級(jí)達(dá)到Ⅰ級(jí)以上說明模型建立成功[7]。

1.2.2 分組 建模的24只大鼠分為模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組，各8只，未建模的8只為正常組，模型組注射生理鹽水，低劑量奧扎格雷組注射4 mg/(kg·d)的奧扎格雷，高劑量奧扎格雷組注射8 mg/kg的奧扎格雷，所有大鼠連續(xù)干預(yù)2周。

1.2.3 認(rèn)知功能檢測(cè) 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)停留時(shí)間，定位航行實(shí)驗(yàn)觀察大鼠從4個(gè)象限入水后找到平臺(tái)的潛伏期，第6天開始空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去平臺(tái)，然后將大鼠從同一入水點(diǎn)放入水中，記錄大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)停留時(shí)間。

1.2.4 腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子(NGF)水平檢測(cè) 在大鼠隱靜脈處進(jìn)行采血，待大鼠固定后，將后腿外側(cè)區(qū)域剃毛后暴露采血點(diǎn)，將采血針刺入采血點(diǎn)，采集1 mL的血液，分離上層血清，用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)BDNF、NGF水平，先將BDNF、NGF稀釋，設(shè)置空白孔和待測(cè)樣品孔，將40 μL 各因子稀釋液加入酶標(biāo)包被板上的待測(cè)樣品孔中，用封板膜進(jìn)行封板，在37℃下溫育30 min，撕掉封膜板，棄去液體，甩干，每個(gè)孔中加滿洗滌液，靜置1 min，重復(fù)3次，每個(gè)孔中加入50 μL的酶標(biāo)試劑，溫育、洗滌，加入顯色劑，混勻，37℃下避光顯色30 min，加入50 μL Na2HPO4終止反應(yīng)，在波長450 nm酶標(biāo)儀上讀取各孔的吸光度，并準(zhǔn)確記錄BDNF、NGF水平。

1.2.5 大鼠梗死面積檢測(cè)、神經(jīng)功能評(píng)分評(píng)估 采用線栓法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損，0分為無神經(jīng)功能缺損，不能伸展對(duì)側(cè)前爪為1分，大鼠身體向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈為2分，向手術(shù)對(duì)側(cè)傾倒為3分，不能自動(dòng)行走、意識(shí)喪失為4分。大鼠麻醉后迅速斷頭取腦，將前腦冠狀切成2 mm厚的腦片，在0.5%氯化三苯基四氮唑溶液中染色10 min，然后使用10%甲醛溶液固定，染色結(jié)束后正常組織呈白色，梗死組織呈紅色，使用軟件分析梗死范圍。

1.2.6 病理學(xué)觀察 將大鼠的腦組織放置在冰盒上，在-25℃下速凍20 min，然后用刀片去除大鼠腦組織的嗅球和小腦部分，從腦前極開始進(jìn)行冠狀切片，片厚2 mm，使用10%甲醛溶液固定，在氯化三苯基四氮唑溶液中染色處理，在37℃的烘箱中避光孵育25 min，10 min后將腦片翻面，顯微鏡下觀察病理學(xué)。

1.2.7 cGMP、PKG、PKA蛋白檢測(cè) Western blot法檢測(cè)cGMP、PKG、PKA蛋白，將取出的腦組織超聲粉碎，加入1 mL的RIPA裂解液和10 μL的PMSF，取上清液加入蛋白上樣緩沖液，在100℃下變性15 min，然后將樣品進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，每個(gè)孔中加入40 μg的總蛋白，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜時(shí)間為60 min，5%脫脂奶粉封閉60 min，然后加入cGMP、PKG、PKA的一抗抗體，在4℃下過夜，第2天取出后在37℃下放置60 min，TBST洗膜3次，15 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，在37℃下孵育1 h，TBST洗膜3次，15 min/次，然后加入ECL暗室曝光，利用Image J軟件掃描條帶灰度值，計(jì)算cGMP、PKG、PKA的量，以GAPDH為內(nèi)參蛋白。

2 結(jié)果

2.1 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠認(rèn)知功能的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組逃避潛伏期較多，穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)停留時(shí)間少(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠逃避潛伏期較少，穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)停留時(shí)間較多(P<0.05)。見表1。

表1 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠認(rèn)知功能的影響

2.2 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分較高(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分較低(P<0.05)。見表2。

表2 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠梗死面積、神經(jīng)功能評(píng)分的影響

2.3 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠BDNF、NGF水平的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠BDNF、NGF水平較低(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠BDNF、NGF水平較高(P<0.05)。見表3。

表3 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠BDNF、NGF水平的影響

2.4 各組大鼠病理學(xué)觀察 正常組大鼠腦組織腦細(xì)胞排列整齊，無水腫現(xiàn)象；模型組大鼠腦組織水腫、腦細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞核仁模糊、小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多；低劑量奧扎格雷組大鼠腦組織水腫減小，小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多；高劑量奧扎格雷組腦細(xì)胞排列基本整齊，與正常組大鼠基本相似。見圖1。

注:A:正常組;B:模型組;C:低劑量奧扎格雷組;D:高劑量奧扎格雷組

2.5 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠cGMP、PKG、PKA蛋白的影響 與正常組大鼠相比，模型組、低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠cGMP、PKG水平較高，PKA水平較低(P<0.05)；與模型組大鼠相比，低劑量奧扎格雷組、高劑量奧扎格雷組大鼠cGMP、PKG水平較低，PKA水平較高(P<0.05)。見表4和圖2。

圖2 cGMP、PKG、PKA蛋白Western blot檢測(cè)

表4 奧扎格雷對(duì)ACI模型大鼠cGMP、PKG、PKA蛋白的影響

3 討論

ACI是臨床上常見的一種腦血管疾病，常發(fā)生于中老年人群中，該病與患者腦動(dòng)脈狹窄、血液流動(dòng)力學(xué)改變、血液成分異常、微栓子脫落、血管內(nèi)皮損傷等因素有關(guān)[8]，ACI患者由于腦部供血不足再加上嚴(yán)重缺氧，會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷患者的神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)而出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙的現(xiàn)象[9]。

本研究通過觀察大鼠的逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)、平臺(tái)停留時(shí)間，得出奧扎格雷可有效改善大鼠的認(rèn)知功能。奧扎格雷對(duì)患者神經(jīng)元具有一定的保護(hù)作用，可有效改善患者神經(jīng)功能缺損和認(rèn)知功能，降低梗死面積，增加患者腦部缺血區(qū)域的血流量，使患者受損腦組織快速恢復(fù)[10-11]。研究指出[12]，奧扎格雷在改善患者腦能量代謝與缺血腦區(qū)域血流量的過程中，抑制神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡和血栓的形成，在抗血小板聚集中起到重要作用。ACI患者認(rèn)知功能障礙的發(fā)生與患者腦部血管病變、腦組織缺血、缺氧密切相關(guān)，可對(duì)患者的神經(jīng)組織和腦部認(rèn)知記憶造成嚴(yán)重的損傷[13-14]。

神經(jīng)功能缺損評(píng)分和梗死面積是評(píng)估ACI的兩項(xiàng)重要內(nèi)容，其中大腦中動(dòng)脈閉塞可導(dǎo)致神經(jīng)功能嚴(yán)重受損[15-16]。本研究顯示，奧扎格雷可明顯降低ACI模型大鼠的梗死面積，改善神經(jīng)功能評(píng)分，促進(jìn)大鼠康復(fù)，高劑量奧扎格雷效果更為明顯。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一，可促進(jìn)神經(jīng)元的存活和生長，調(diào)節(jié)突觸的可塑性。研究指出[17]，BDNF在維持ACI患者神經(jīng)元功能、防止神經(jīng)元退行性病變等過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還參與大腦的學(xué)習(xí)和記憶過程，提示BDNF可反映出大鼠認(rèn)知功能受損程度。NGF作為一種神經(jīng)生長因子，可拮抗神經(jīng)細(xì)胞的凋，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元功能，誘導(dǎo)軸突末端的生長，保護(hù)基底前腦膽堿能神經(jīng)元，改善記憶能力[18-19]。國外研究指出[20]，BDNF、NGF水平的降低與大鼠認(rèn)知功能障礙關(guān)系極為密切。ACI患者腦部缺血、缺氧、梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性等一系列問題發(fā)生后會(huì)影響神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞功能，損傷患者的神經(jīng)元，進(jìn)而影響患者認(rèn)知功能。本研究顯示，奧扎格雷可通過提高大鼠體內(nèi)BDNF、NGF水平改善大鼠的認(rèn)知功能。

本研究顯示奧扎格雷通過調(diào)控cGMP、PKG、PKA蛋白水平來改善大鼠的認(rèn)知功能。cGMP、PKG是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與腦部缺血再灌注損傷過程，當(dāng)腦部周圍神經(jīng)受損時(shí)cGMP、PKG含量會(huì)急劇增加，參與ACI發(fā)病過程。研究指出[21]，與正常大鼠相比，ACI模型大鼠體內(nèi)含量較低，推測(cè)PKA蛋白的激活是低于腦損傷的重要神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，在神經(jīng)元生長、突觸的可塑性中起著正向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，高劑量奧扎格雷可通過調(diào)控cGMP、PKG、PKA蛋白水平減少逃避潛伏期，增加穿越平臺(tái)次數(shù)及平臺(tái)停留時(shí)間，進(jìn)而改善大鼠認(rèn)知功能，減少大鼠梗死面積和神經(jīng)功能評(píng)分，提高BDNF、NGF水平，為臨床上治療ACI提供新的方向。

利益相關(guān)聲明：所有作者均聲明不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：高飛負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)施和論文撰寫；姚淑芳和陶有亮負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)、數(shù)據(jù)分析和指導(dǎo)。