N6-甲基腺苷甲基化在心血管相關(guān)疾病中的研究進(jìn)展*

范雪，徐明國

中國醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市兒童醫(yī)院心血管內(nèi)科(廣東深圳 518038)

近年來，轉(zhuǎn)錄后修飾已成為生物科學(xué)研究的熱點,目前已有171種RNA轉(zhuǎn)錄后修飾被鑒定出來[1]。高達(dá)80%的RNA甲基化是由N6-甲基腺苷(N6- methyl adenosine, m6A)介導(dǎo)的，在mRNA近終止密碼子和3端非翻譯區(qū)出現(xiàn)集中現(xiàn)象[2]。m6A參與了mRNA的翻譯、降解、剪切、輸出和折疊等大部分的RNA代謝過程[3-4]。已有研究證明，m6A修飾及其相關(guān)酶在mRNA生命的不同階段發(fā)揮重要作用[5]，參與了人類復(fù)雜疾病的發(fā)生過程，在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中也起到了重要作用。在本文中，重點總結(jié)了m6A修飾的研究進(jìn)展，在心血管疾病中m6A甲基化的相關(guān)機(jī)制和功能以及今后主要的研究方向。

1 m6A修飾與相關(guān)蛋白

RNA的m6A 甲基化是腺嘌呤(A)第6位N通過甲基轉(zhuǎn)移酶催化形成的一種甲基化修飾[6]，近年來,研究表明m6A酶系統(tǒng)主要由3種蛋白組成，包括甲基化酶、去甲基化酶以及m6A閱讀蛋白[7]。

1.1 m6A與甲基化酶 第一類是負(fù)責(zé)催化m6A甲基化的writers，能夠?qū)⒓谆揎棇懭隦NA中，此過程是經(jīng)由甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合體介導(dǎo)的。它的主要內(nèi)容是甲基轉(zhuǎn)移酶3(methyltransferase-like 3，METTL3)和甲基轉(zhuǎn)移酶14(methyltransferase-like 14，METTLl4)，隨后以又出現(xiàn)了Wilms′瘤相關(guān)蛋白、甲基轉(zhuǎn)移酶16、RNA結(jié)合模體蛋白1、鋅指結(jié)構(gòu)域包含蛋白13等。其中，METTL3是最早發(fā)現(xiàn)的寫入基因，屬于S-腺 苷 甲 硫 氨 酸 結(jié)合蛋白，具有催化mRNA發(fā)生m6A修飾的功能，METTL14是MT-A70甲基轉(zhuǎn)移酶家族中與METTL3具有同源性的異二聚體,可以促進(jìn)與 RNA的結(jié)合[8-9]，兩者以1∶1的比例形成穩(wěn)定的異源二聚體，即Mettl3-Mettl14復(fù)合體，在此過程中發(fā)揮協(xié)同作用。Wilms′瘤相關(guān)蛋白本身無甲基轉(zhuǎn)移酶活，有研究顯示，它可能起引導(dǎo)作用，使METTL3-METTL14異二聚體在核斑中定位，從而促進(jìn)m6A沉積，并且識別共有基序RRACH[10]，影響細(xì)胞RNAm6A負(fù)荷，保證Mettl3-Mettl14復(fù)合體發(fā)揮催化作用。METTL16是近年新發(fā)現(xiàn)的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，其作用方式與 METTL3和METTLl4明顯不同,能以單一組分進(jìn)行催化，影響m6A的形成[11]。另外有報道稱，鋅指結(jié)構(gòu)域包含蛋白13可以將Wilms′瘤相關(guān)蛋白固定存在于核內(nèi),保證核定位，使轉(zhuǎn)錄合成的mRNA甲基化的順利進(jìn)行[12]。

1.2 m6A與去甲基化酶 第二類是負(fù)責(zé)將RNA甲基化修飾信號擦除的erasers，主要功能是介導(dǎo)RNA的去甲基化修飾過程，它的內(nèi)容主要包括脂肪量與肥胖相關(guān)蛋白(fat mass and obesity associated protein，F(xiàn)TO)和Fe(Ⅱ) 和-KG依賴的雙加氧酶AlkB家族成5[AlkB family of nonheme Fe(Ⅱ)/-ketoglutarate(-KG)-dependent dioxygenases 5.ALKBH5][13]。FTO是最先被人們發(fā)現(xiàn)與肥胖相關(guān)的m6A去甲基化酶，位于第16號染色體(16q12.2)并廣泛存在于成人和胚胎的組織中，最近的一項研究表明，F(xiàn)TO能去除m6A甲基修飾，將細(xì)胞內(nèi)m6A去甲基化，且當(dāng)受抑制時能夠增高整體mRNA的m6A修飾水平[14]。研究中發(fā)現(xiàn)ALKBH5主要集中在核散斑中，通過將已經(jīng)m6A修飾的mRNA發(fā)生去甲基化，參與調(diào)控mRNA相關(guān)的代謝過程[15]。

1.3 m6A與閱讀蛋白 第三類是與RNA中的m6A甲基化位點結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮不同下游效應(yīng)的readers[16]。它們是含有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白家族成員，包括YTHDFs和YTHDCs兩個亞型，都具有保守的m6A結(jié)構(gòu)域，可以通過直接結(jié)合甲基化修飾的靶基因在細(xì)胞核以及細(xì)胞質(zhì)中參與下游RNA的翻譯、降解等過程。據(jù)報道，YTHDF1蛋白可以將翻譯起始因子募集，進(jìn)一步加快m6A甲基化mRNA的翻譯效率[17]，YTHDF2 蛋白與 m6A 位點結(jié)合使mRNA 的半衰期縮短，促進(jìn)mRNA的降解[18]。YTHDC1通過影響mRNA剪接，mRNA輸出以及特定轉(zhuǎn)錄本的衰變在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控作用[19-20]，YTHDC2廣泛存在于核內(nèi)、外，具有螺旋酶和蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，能夠選擇性地與非編碼 RNA 上的 m6A 位點結(jié)合，通過解旋酶作用可以提高翻譯效率，同時降低mRNA的豐度[21]，隨后又發(fā)現(xiàn)了真核起始因子3 (eIF3)，能與m6A的mRNA 5′UTR直接結(jié)合，是非常復(fù)雜的起始因子[22]，還有人胰島素樣生長因子2 mRNA 結(jié)合蛋白，可以通過識別共有序列GG(m6A)C，作用于mRNA 轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步增強(qiáng)mRNA 的穩(wěn)定性和翻譯效率[23]。近年來還發(fā)現(xiàn)了人異質(zhì)性細(xì)胞核核糖蛋白C，它不與m6A直接結(jié)合的蛋白，通過與結(jié)構(gòu)改變的RNA結(jié)合，促進(jìn)這些 RNA的加工轉(zhuǎn)運，參與mRNA的轉(zhuǎn)錄和成熟等過程[24]。

1.4 m6A與檢測方法 近年來隨著人們對m6A的認(rèn)識和深入研究，其檢測方法也在不斷進(jìn)步，傳統(tǒng)技術(shù)中薄層色譜、高效液相色譜和斑點雜交法均無法確定其在mRNA轉(zhuǎn)錄本中的位置，局限性很明顯。斑點雜交技術(shù)在分子生物學(xué)中用于DNA、RNA和蛋白質(zhì)樣品的半定量或定量檢測方法，主要是對m6A的半定量檢測，缺點是它只能驗證m6A的存在或進(jìn)行不同組間m6A含量的比較[25]。2012年出現(xiàn)了高通量測序與抗體免疫沉淀相結(jié)合的方法[26]，之后又出現(xiàn)了光交聯(lián)輔助m6A測序技術(shù)[27]，該技術(shù)可以提高m6A位點的分辨，除此之外，還有兩個相似的技術(shù)分別為miCLIP和m6A-CLIP[28-29]。生物信息學(xué)的快速發(fā)展使其在m6A的甲基化位點的預(yù)測方面也得到了廣泛應(yīng)用，最早提出的是隱藏馬爾科夫模型來預(yù)測已知位點周邊的殘余位點[30]，隨后又開發(fā)了pRNAm-PC 方法、iRNA-Methyl 方法、RNA-methylPred 方法、TargetM6A 方法，技術(shù)也在逐漸的提高，使預(yù)測過程更快速、穩(wěn)定[31-34]。目前來看，m6A的檢測方法有限，需要更深入的研究，進(jìn)一步認(rèn)識m6A的作用機(jī)制和生物學(xué)功能。

2 m6A與心血管疾病

隨著m6A相關(guān)檢測技術(shù)以及表觀遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的逐步深入，m6A mRNA甲基化與心血管疾病的關(guān)系逐漸成為人們的關(guān)注熱點，目前的研究表明RNA m6A轉(zhuǎn)錄后修飾在多種病理生理過程中起著關(guān)鍵作用，且與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

2.1 m6A與主動脈瘤 主動脈瘤在臨床上以腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA)最為常見，AAA是指腹主動脈的局限性瘤樣擴(kuò)張，其管腔直徑超過3 cm或超過正常直徑的1.5倍，是一種慢性炎癥血管性疾病，如出現(xiàn)破裂，病死率可達(dá)到90%[35]。AAA瘤壁組織的病理改變包括慢性透壁性炎癥、細(xì)胞外基質(zhì)破壞性重構(gòu)、血管平滑肌細(xì)胞凋亡等。

研究表明,許多經(jīng)典受體以及補(bǔ)體等先天免疫系統(tǒng)均參與了AAA的形成[36]。目前臨床還沒有發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制AAA發(fā)生、發(fā)展的藥物，手術(shù)治療是AAA唯一有效的治療方法[37]。近年來的研究工作者主要把關(guān)注點放在如何延緩AAA的發(fā)展上，這可能對疾病是一種潛在的治療手段。研究發(fā)現(xiàn)，METTL3可以激活與AAA聯(lián)系密切的經(jīng)典信號通路NF-κB[38-39]。m6A修飾可以介導(dǎo)miRNA前體加工，METTL3可以促進(jìn)這一過程的發(fā)展，進(jìn)而使成熟的微小RNA數(shù)量增加[40],進(jìn)一步研究證實，miRNA通過抑制靶基因在AAA各種病理生理過程中的表達(dá)起著重要的作用[41]。He等[42]研究發(fā)現(xiàn)，YTHD3、FTO和MTTTL14在內(nèi)的m6A調(diào)節(jié)因子在人類AAA發(fā)病機(jī)制中有重要作用，提示了臨床AAA表觀遺傳學(xué)改變的潛在機(jī)制。

2.2 m6A與心室重塑 心室重塑是心室肌細(xì)胞對多種刺激因素的復(fù)雜反應(yīng)，持續(xù)的壓力負(fù)荷過重、容量負(fù)荷過重以及基因突變可以產(chǎn)生病理性心肌重塑, 臨床均可表現(xiàn)為心肌肥厚。當(dāng)心臟受到損傷時，心肌細(xì)胞不能完成分裂，數(shù)量不會增加，表現(xiàn)為細(xì)胞體積增大、心室壁增厚和心肌纖維排列紊亂等肥厚表型[43]。臨床中常見的病理性心肌肥厚是指心臟發(fā)生了重構(gòu)，此過程與基因表達(dá)和轉(zhuǎn)錄后修飾的變化有關(guān)[44-45]。心肌肥厚發(fā)病是復(fù)雜的，涉及多種細(xì)胞信號通路之間的復(fù)雜相互作用，其機(jī)制尚不完全清楚,持續(xù)進(jìn)展往往導(dǎo)致心力衰竭和猝死等不良事件的發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)， METTL3介導(dǎo)了成肌細(xì)胞中的m6A修飾，影響了mRNA 水平，利于肌肉的生長發(fā)育[46]。近年來有報道，METTL3 是一種最早被鑒定出的m6A甲基轉(zhuǎn)移酶，在肥厚刺激下增強(qiáng)，是心肌細(xì)胞正常肥厚反應(yīng)的必要條件，增強(qiáng)的m6A RNA甲基化導(dǎo)致代償性心肌肥厚，而減弱的m6A導(dǎo)致偏心性心肌細(xì)胞重構(gòu)和障礙, 同時證明了心肌細(xì)胞中m6A的發(fā)生且在肥大條件下會發(fā)生動態(tài)變化[47]。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO基因的傳遞可以減弱缺血誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)，通過增加RNA中的m6A,進(jìn)而降低心肌細(xì)胞的收縮功能，提示FTO調(diào)控的m6A機(jī)制在心臟重構(gòu)和修復(fù)中的重要功能，同時還與心臟缺陷的發(fā)生有關(guān)[48]。

2.3 m6A與心肌纖維化 心肌纖維化是指由于心肌組織結(jié)構(gòu)中膠原纖維的變化，引起細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加及過度沉積，出現(xiàn)瘢痕組織形成，致使心臟處于非正常的生理功能狀態(tài)中。在心肌纖維化的過程中心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及炎癥細(xì)胞均發(fā)揮了作用[49]。心肌纖維化可以改變心肌的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致心臟功能障礙和心律失常的發(fā)生，進(jìn)而影響心力衰竭患者的結(jié)果和預(yù)后[50]。近年來隨著高通量甲基化測序等新技術(shù)體系的不斷更新，發(fā)現(xiàn)其調(diào)控機(jī)制在心肌纖維化的相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，提供了新的有效手段。有研究發(fā)現(xiàn)，METTL3沉默后，心肌纖維化相關(guān)基因的m6A修飾和細(xì)胞穩(wěn)定性，特別是膠原相關(guān)基因的表達(dá)和m6A水平發(fā)生改變，提示METTL3沉默可以通過抑制心肌成纖維的活化來減輕心肌梗死引起的心肌纖維化[51]。另一研究中，我們確定了線粒體功能與FTO的肌源蛋白表達(dá)之間是存在一定聯(lián)系的，并提示FTO可以調(diào)控肌源性分化，同時還參與了心臟的保護(hù)機(jī)制[52]。最近的一項研究也證明了，F(xiàn)TO的確參與了心肌纖維的調(diào)控[48]。這些研究表明m6A修飾與心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系，但是能否成為心肌纖維化相關(guān)疾病的診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)尚不清楚。

2.4 m6A與心力衰竭 心力衰竭是由于各種嚴(yán)重心臟疾病引起心肌結(jié)構(gòu)和功能的變化，導(dǎo)致心室充盈和射血障礙，進(jìn)而出現(xiàn)一系列不良的臨床后果[53]。表觀遺傳過程的失調(diào)和異常的基因表達(dá)是心力衰竭的重要機(jī)制。Mathiyalagan等[48]報道了m6A甲基化參與心肌梗死周圍區(qū)域的再生，Dorn等[47]和Kmietczyk等[54]也發(fā)現(xiàn)了METTL3敲除小鼠肥厚反應(yīng)的改變導(dǎo)致了心力衰竭的發(fā)生。最近一項研究發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞限制敲除RNA去甲基酶FTO的小鼠表現(xiàn)出心臟功能受損，m6A RNA甲基化改變的RNA主要與代謝和調(diào)控途徑有關(guān)，會影響基因表達(dá)調(diào)控非常早期的步驟，RNA表達(dá)水平的改變主要表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)可塑性的改變，提示了m6A RNA甲基化改變會引起蛋白質(zhì)豐度的變化，與mRNA水平無關(guān)，因此，m6A RNA甲基化可能對心臟表型產(chǎn)生更大的影響，該過程可能是一個潛在的治療靶點[55]。

2.5 m6A與高血壓 高血壓的主要表現(xiàn)是動脈血壓高于正常范圍，常伴有心臟、血管等重要器官病理性改變的臨床綜合征，有較高的患病率，西歐國家的發(fā)病率為44%，北美國家為28%[56]，其病情進(jìn)展慢，容易并發(fā)靶器官受損的發(fā)。最近，人們發(fā)現(xiàn)m6A在RNA的動態(tài)調(diào)控過程中參與了脂肪生成、細(xì)胞分化、免疫和炎癥反應(yīng)等，在肥胖、2型糖尿病、心血管疾病等代謝性疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[57]。有研究報道，大約10%血壓相關(guān)的m6A單核苷酸多態(tài)性與冠狀動脈疾病或中風(fēng)有關(guān)，結(jié)果表明，m6A可能在BP調(diào)控中發(fā)揮重要作用[58]。另一研究中發(fā)現(xiàn)，大量自發(fā)性高血壓大鼠周細(xì)胞的平均m6A在周細(xì)胞中表現(xiàn)出全身性的降低，揭示m6A參與了高血壓發(fā)展過程，同時確定了哺乳動物高血壓形成過程中的一個表位切割機(jī)制[59]。目前，m6A在高血壓中的甲基化作用尚未完全闡明，待進(jìn)一步研究。

2.6 m6A與其他心血管相關(guān)疾病 m6A是真核生物中最豐富的RNA修飾，近年來，越來越多的證據(jù)證明m6A修飾能夠從生命的起始階段就對mRNA的生成產(chǎn)生影響，對基因的表達(dá)發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。有研究，經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理細(xì)胞中，沉默METTLE3可以增強(qiáng)自噬，抑制其凋亡，增強(qiáng)METTL3表達(dá)或抑制ALKBH5表達(dá)的作用是相反的，提示m6A甲基化和其調(diào)節(jié)因子之間的功能研究為局部缺血性心臟病的治療提供了新方向[60]。另一研究中發(fā)現(xiàn)鈣化動脈和硫酸吲哚氧基誘導(dǎo)的動脈平滑肌細(xì)胞中METTL14的表達(dá)增加，從而增加了RNA中m6A水平，降低了血管修復(fù)功能，減少METTL14的鈣化動脈中表達(dá)，減少動脈粥樣硬化引起的m6A增加和動脈平滑肌細(xì)胞鈣化減少，證實了METTL14依賴性血管m6A甲基化在鈣化過程中血管功能中的重要功能性[61]。冷燕等[62]發(fā)現(xiàn)利用高葡萄糖刺激增強(qiáng)FTO表達(dá)，可引起m6A的降低和FOXO1表達(dá)升高，且FOXO1是糖脂代謝和心血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育過程中的重要參與者。

3 結(jié)語與展望

近年來，越來越多的證明表明，m6A修飾在基因調(diào)控和心血管疾病發(fā)展中具有重要作用， RNA中的m6A甲基化水平與細(xì)胞內(nèi)寫入、擦除基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，讀取基因表達(dá)的蛋白分子則與m6A甲基化位點相關(guān)，揭示了m6A修飾相關(guān)酶可能為心血管系統(tǒng)疾病提供了潛在治療靶點，需進(jìn)一步挖掘心血管疾病的分子生物學(xué)機(jī)制。隨著過去幾年里，m6A檢測技術(shù)的進(jìn)步，使我們對m6A的作用機(jī)制產(chǎn)生了新的認(rèn)識，解釋了m6A與mRNA代謝之間的關(guān)系，盡管m6A 在心血管系統(tǒng)中的作用已經(jīng)逐漸被揭示，但很多疾病的其分子作用機(jī)制仍不明確，許多關(guān)鍵問題還需進(jìn)一步研究。深入解釋m6A 甲基化修飾在心血管系統(tǒng)發(fā)生發(fā)展中的調(diào)節(jié)機(jī)制將有助于解決疾病的診斷、治療及預(yù)后判斷，為今后m6A的靶向治療心血管系統(tǒng)疾病提供了科學(xué)依據(jù)。

利益相關(guān)聲明:論文所有作者共同認(rèn)可論文無相關(guān)利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明:范雪進(jìn)行了起草論文及文獻(xiàn)查閱，徐明國進(jìn)行了論文修改和指導(dǎo)工作。