TRPC6 DNA甲基化在同型半胱氨酸致胰島β細(xì)胞焦亡中的作用研究*

揭育禎, 楊慧霞, 周瑜瑾, 張喜文, 虎小忠, 柳楊, 丁寧, 盧冠軍, 馬勝超△

1寧夏醫(yī)科大學(xué)國家衛(wèi)生健康委代謝性心血管疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(寧夏銀川 750004) ； 2寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科(寧夏銀川 750004)

同型半胱氨酸 (homocysteine，Hcy) 是體內(nèi)常見的一種含有氨基酸的硫醇基團(tuán)，循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明，高同型半胱氨酸血癥 (hyperhomocysteinemia，HHcy) 是心血管和其他代謝性疾病的獨(dú)立危險因素[1-2]，涉及臟器多，危害性大。流行病學(xué)調(diào)查顯示[3]2型糖尿病患者血漿Hcy水平明顯高于健康人，HHcy在2型糖尿病患者中的發(fā)生率為31%；最近研究發(fā)現(xiàn)[4]在高血糖的狀態(tài)下，胰島β細(xì)胞中Caspase-1表達(dá)增加，提示細(xì)胞焦亡可能是胰島β細(xì)胞功能損傷的重要機(jī)制，但機(jī)制未清。研究證據(jù)表明[5]Hcy可損傷胰島β細(xì)胞的功能，功能障礙是血糖升高的重要機(jī)制[6-7]，但Hcy能否引起胰島β細(xì)胞發(fā)生焦亡及其分子機(jī)制目前未見報(bào)道。瞬時感受器電位通道6 (transient receptor potential cation channel 6，TRPC6) 是一種具有Ca2+高選擇性的瞬時電位陽離子通道，其在大多數(shù)人體組織中廣泛表達(dá)，并參與許多生理過程[8]。He等[9]研究發(fā)現(xiàn)，TRPC6對葡萄糖濃度表現(xiàn)出較高的敏感性，因?yàn)槟承┢鞴僦械母咛谴碳わ@著提高了TRPC6的表達(dá)和功能。有證據(jù)表明[10]，TRPC6蛋白的表達(dá)模式在多種病理生理?xiàng)l件下上調(diào)，Cai等[11]在食管癌組織中也觀察到TRPC6表達(dá)高于正常食管組織，阻滯TRPC6通道后，食管癌細(xì)胞被阻滯在G2/M期，細(xì)胞生長周期受到抑制；然而，TRPC6在胰島β細(xì)胞功能障礙中的作用仍然未知。本研究2020年9月至2021年7月對Hcy介導(dǎo)胰島β細(xì)胞焦亡中TRPC6的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行探討，以TRPC6的分子調(diào)控為切入點(diǎn)，從胰島β細(xì)胞焦亡的角度闡明Hcy致病的機(jī)制，為進(jìn)一步研究糖尿病的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過寧夏醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會審查(寧醫(yī)大倫理第2017-033號)。

1 材料與方法

1.1 動物模型與分組 8周齡的C57BL/6J背景的胱硫醚β合成酶敲除雜合子小鼠 (cbs+/-)委托北京維通利華公司購于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室 [合格證號：SCXK(京)2016-0006]。cbs+/-小鼠隨機(jī)標(biāo)號分為兩組，每組10只：(1)對照組為正常普通飲食飼養(yǎng)；(2)高蛋氨酸組為高蛋氨酸飲食(普通飲食中加入1.7%蛋氨酸)飼養(yǎng)。小鼠均飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境內(nèi)，分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)相對濕度60%左右，溫度控制在25℃左右，動物飼養(yǎng)的籠具、飲水瓶定期消毒，所用墊料經(jīng)過高壓滅菌，飼養(yǎng)房內(nèi)定期紫外燈消毒并自由攝食和飲水。小鼠飼養(yǎng)12周后，剖取胰腺組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑和儀器 蛋白提取試劑盒 (凱基，南京)；基因組DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒 (天根，北京)；逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR試劑盒 (Thermo Fisher，美國)；DNA甲基化修飾試劑盒 (ZYMO，美國)；anti-NLRP3 (Abcam，英國)、anti-Caspase-1 (Abcam，英國)、anti-IL-1β (Abcam，英國)、anti-TRPC6 (Affinity，中國)、anti-DNMT1 (Gene Tex，中國)、anti-DNMT3a (Abcam，英國)、anti-DNMT3b (Affinity，中國)；辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的羊抗兔二抗 (博奧森，北京)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗 (中杉金橋，北京)，TRPC6引物由上海生工生物工程有限公司合成。勻漿儀(MP Biomedicals,美國)；垂直電泳儀 (Bio-Rad，美國)；超凈工作臺 (安泰，蘇州)；5415D型微量臺式離心機(jī) (Ep-pendorf，德國)；BS110S型精密天平 (Sartorius，德國)；實(shí)時熒光定量PCR儀 (analytikjena，美國)；全自動生化分析儀 (日立，北京)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 全自動生化分析儀檢測cbs+/-小鼠的血糖水平 收集cbs+/-小鼠眼球血液1.0 mL后置于1.5 mL EP管中靜置，然后按3 000 r/min的離心速度離心30 min，選取上層血清放入樣品杯中待用。采用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法分別檢測對照組和高蛋氨酸組cbs+/-小鼠的血糖水平。

1.3.2 Western blot檢測NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TRPC6、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b蛋白的表達(dá)水平 根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明書提取小鼠胰腺組織的總蛋白，加入蛋白上樣緩沖液于金屬浴中99℃煮沸變性5 min。取30 μg總蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠 (SDS-PAGE)電泳，0.3A恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h，5% 脫脂奶粉封閉4 h (室溫)，PBST洗滌3次，10 min/次，NLRP3、Caspase-1、IL-1β、TRPC6、DNMT1、DNMT3a以及DNMT3b特異性一抗4℃孵育過夜，第2天PBST洗滌3次，10 min/次；按1∶5 000稀釋辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG，二抗稀釋液孵育2 h (室溫)，PBST洗滌3次，10 min/次，加入ECL發(fā)光底物，在凝膠成像分析儀上進(jìn)行成像分析。以β-actin為內(nèi)參，分別計(jì)算各目的蛋白與β-actin的相對表達(dá)量并歸一化處理，比值進(jìn)行分析。

1.3.3 qRT-PCR檢測胰島β細(xì)胞中TRPC6、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b mRNA的表達(dá) 根據(jù)總RNA提取試劑盒說明書提取小鼠胰腺組織的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行qRT-PCR的檢測。采用GenBank數(shù)據(jù)庫查詢TRPC6基因序列并設(shè)計(jì)引物。TRPC6：上游：5′-GGCGGCTCTCTAAAGGCTG-3′；下游：5′-TGGGGTAGTAGCCATACGGTG-3′；DNMT1：上游：5′-GGGTCTTTGTGGCTGGGTCAAG-3′；下游：5′-AAGCAGCAGAGCAGAGCCTTTG-3′；DNMT3a：上游：5′-GATGAGCCTGAGTATGAGGATGG-3′；下游：5′-CAAGACACAATTCGGCCTGG-3′；DNMT3b：上游：5′-CGTTAATGGGAACTTCAGTGACC-3′；下游：5′-CTGCGTGTAATTCAGAAGGCT-3′。熒光定量PCR擴(kuò)增程序：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，70℃ 10 s，95℃ 15 s，共45個循環(huán)，并以內(nèi)參GADPH為對照進(jìn)行平衡，同體系擴(kuò)增目的基因的相對量。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)，根據(jù)公式2-ΔΔCt計(jì)算，ΔΔCt=CtTRPC6(待測樣本)-CtGADPH(待測樣本)]-[CtTRPC6(校正樣本)-CtGADPH(校正樣本)]。

1.3.4 巢式甲基化特異性PCR(nMS-PCR)檢測TRPC6 DNA甲基化水平 按DNA提取試劑盒說明書提取各組胰腺組織全基因組DNA，亞硫酸鹽修飾法對全基因組DNA進(jìn)行甲基化修飾。nMS-PCR法檢測TRPC6 DNA甲基化程度的改變。針對TRPC6啟動子區(qū)，在線(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)設(shè)計(jì)一對外引物及兩對內(nèi)引物(外引物：上游：5′-TTTTTTAGGAATTAGGAATATTTTA-3′，下游：5′-TTCTTAAATAACACCAAAAAAAA-3′；甲基化引物：上游5′-AGTTGTGGTTTTTAGATAGGGGTC-3′，下游：5′-CGCTAAAAAATTACTATATCAACCGTA-3′；非甲基化引物：上游：5′-GTTGTGGTTTTTAGATAGGGGTT-3′；下游：5′-CCACTAAAAAATTACTATATCAACCATA-3′)。(反應(yīng)體系：PCR MIX 12.5 μL、H2O 7 μL、上下游引物各1 μL、已修飾的DNA 3.5 μL，共25 μL)外引物擴(kuò)增的反應(yīng)條件為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，63℃ 30 s，72℃ 30 s，20個循環(huán)，每個循環(huán)降0.5℃至53℃，72℃ 7 min。以外引物的PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行內(nèi)外引物的擴(kuò)增，反應(yīng)條件同外引物。隨之，取10 μL PCR產(chǎn)物于2%的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像分析儀成像分析甲基化條帶及甲基化條帶的光密度，按如下公式進(jìn)行計(jì)算：甲基化%=甲基化OD值/(甲基化OD值+非甲基化OD值)×100%。

2 結(jié)果

2.1 Hcy對cbs+/-小鼠血糖水平的影響 與對照組比較，高蛋氨酸組中小鼠的血糖水平明顯升高 (P<0.01)。見表1。

表1 兩組cbs+/-小鼠血糖水平比較

2.2 高蛋氨酸飲食對胰島β細(xì)胞焦亡的影響 與對照組比較，高蛋氨酸組NLRP3、Caspase-1以及IL-1β的表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)。見表2、圖1。

圖1 Western blot檢測胰腺組織中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β蛋白的表達(dá)

表2 兩組cbs+/-小鼠胰腺組織中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β蛋白的表達(dá)

2.3cbs+/-小鼠胰腺組織中TRPC6的表達(dá) 與對照組比較，高蛋氨酸組TRPC6的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高 (P<0.01)，見表3。

表3 兩組cbs+/-小鼠胰腺組織中TRPC6的mRNA和蛋白表達(dá)水平

2.4cbs+/-小鼠胰腺組織中TRPC6 DNA甲基化水平的改變 利用生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測TRPC6啟動子區(qū)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)在啟動子上游48～218 bp的位置存在一個CpG島 (圖2-A)。接著采用MSP檢測TRPC6啟動子區(qū)的改變，結(jié)果顯示，與對照組相比，高蛋氨酸組TRPC6啟動子區(qū)DNA甲基化水平降低 (圖2-B)。兩組TRPC6啟動子區(qū)甲基化水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表4。

注：A：生物信息學(xué)分析預(yù)測TRPC6啟動子區(qū)CpG島；B：MSP檢測TRPC6啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。M為甲基化,U為非甲基化

表4 兩組cbs+/-小鼠TRPC6啟動子區(qū)DNA甲基化水平

2.5cbs+/-小鼠胰腺組織中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表達(dá) 與對照組相比，高蛋氨酸組小鼠胰腺組織DNMT1蛋白及mRNA表達(dá)水平明顯降低，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而DNMT3a和DNMT3b變化兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表5、6。

表5 兩組cbs+/-小鼠胰腺組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的mRNA表達(dá)水平

表6 兩組cbs+/-小鼠胰腺組織中DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白表達(dá)

2.6cbs+/-小鼠胰腺組織中TRPC6甲基化水平與血糖水平以及NLRP3、Caspase-l和IL-1β蛋白的相關(guān)性分析 TRPC6甲基化水平與血糖水平 (r=-0.782 4，P=0.007 5)以及NLRP3 (r=-0.777 5，P=0.008 1)、Caspase-1 (r=-0.899 2，P=0.000 4)、IL-1β (r=-0.669 1，P=0.034 4)蛋白表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)，見圖3。

注：A：胰腺組織中TRPC6甲基化水平與血糖水平的相關(guān)性分析；B：胰腺組織中TRPC6甲基化水平與細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白NLRP3的相關(guān)性分析；C：胰腺組織中TRPC6甲基化水平與細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1的相關(guān)性分析；D：胰腺組織中TRPC6甲基化水平與細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白IL-1β的相關(guān)性分析

3 討論

胰島β細(xì)胞是一種內(nèi)分泌細(xì)胞，約占胰島細(xì)胞總數(shù)的70%，主要位于胰島中央部，專一產(chǎn)生和分泌胰島素調(diào)節(jié)血糖含量[12]。當(dāng)胰腺組織中產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞無法產(chǎn)生和(或)釋放足夠的胰島素來克服外周胰島素抵抗時，就會導(dǎo)致高糖血癥[13]。細(xì)胞焦亡 (pyroptosis) 是近年來發(fā)現(xiàn)的一種通過Caspase-1介導(dǎo)，細(xì)胞質(zhì)膜破壞、細(xì)胞成分、促炎性介質(zhì)釋放到胞外為特征的程序性炎癥細(xì)胞死亡，主要為Caspase-1依賴的經(jīng)典炎癥小體信號通路[14-15]。大量研究表明，炎癥小體活化可促進(jìn)炎癥因子IL-1β的成熟和分泌引起細(xì)胞焦亡。此外，越來越多的研究報(bào)道NLRP3炎癥小體激活在觸發(fā)焦亡介導(dǎo)的細(xì)胞死亡和促進(jìn)糖尿病視網(wǎng)膜病變 (diabetic retinopathy，DR) 的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[16]。炎癥是導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙和死亡的關(guān)鍵機(jī)制，其中炎性細(xì)胞因子IL-1β在糖尿病中起主要作用[17]。臨床研究報(bào)告稱，在2型糖尿病患者中，IL-1受體拮抗劑或IL-1β抗體抑制IL-1β可改善血糖和胰島β細(xì)胞功能[18]。且IL-1β分泌主要由半胱氨酸蛋白酶Caspase-1介導(dǎo)，它主要由NLRP3炎癥小體激活。

Hcy是一種在必需氨基酸甲硫氨酸代謝過程中形成的含硫非蛋白氨基酸[19-20]，流行病學(xué)調(diào)查顯示[21]伴有胰島素抵抗和胰島素分泌受損的肥胖患者中Hcy水平升高，甚至在非糖尿病的胰島素抵抗人群中也增加。本研究中我們也觀察到Hcy可損傷胰島β細(xì)胞功能引起胰島素分泌異常，進(jìn)而引起機(jī)體內(nèi)血糖水平的升高，可見Hcy與血糖異常密切相關(guān)。研究證據(jù)表明[22]，促炎細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生會導(dǎo)致糖尿病，胰島中局部產(chǎn)生的IL-1β會導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙從而降低胰島素的產(chǎn)生能力，表明胰島β細(xì)胞焦亡可能是其功能障礙的中心環(huán)節(jié)[23-24]。本研究中我們也發(fā)現(xiàn)Hcy可顯著上調(diào)胰島β細(xì)胞中NLRP3、Caspase-1和IL-1β等焦亡相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)水平，提示Hcy引起的胰島β細(xì)胞功能障礙是血糖升高的重要機(jī)制。同時有研究表明，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽等抗氧化劑可被N-同型半胱氨酸化導(dǎo)致巰基暴露，且暴露后的巰基極易被氧化，進(jìn)而引起蛋白質(zhì)的氧化損傷，發(fā)生氧化應(yīng)激[25]。Yan等[26]研究也發(fā)現(xiàn)NLRP3可被線粒體ROS激活，形成NLRP3-ASC-pro-Caspase-1炎癥小體復(fù)合物，活化的Caspase-1切割焦亡效應(yīng)物Gasdermin D(GSDMD)蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡發(fā)生。

TRPC通道屬于非選擇性滲透鈣的陽離子通道超家族[27]，TRPC蛋白形成非選擇性陽離子通道，在各種細(xì)胞中發(fā)揮生理作用。近年來研究表明，高糖會特異性地增加足細(xì)胞中TRPC6的表達(dá)，且葡萄糖以時間濃度依賴性方式增強(qiáng)TRPC6啟動子活性[28]，提示TRPC6與血糖水平之間存在一定的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，高糖通過TRPC6的ROS激活引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[29]。線粒體凋亡信號刺激可以激活了Caspase-1并通過NLRP3炎性體在引發(fā)的巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-1β分泌[30]。在目前的研究中，我們也觀察到高蛋氨酸飲食的cbs+/-小鼠胰腺組織中NLRP3、Caspase-1以及IL-1β表達(dá)水平明顯升高；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在cbs+/-高蛋氨酸組中TRPC6的表達(dá)顯著增加。從表觀遺傳學(xué)調(diào)控開始，Hcy在甲基轉(zhuǎn)移的代謝中作為唯一甲基供體可以使得蛋白發(fā)生甲基化，有研究發(fā)現(xiàn)[31]，Hcy能夠下調(diào)DNMT1的表達(dá)水平并影響下游基因的DNA甲基化水平。鑒于DNA甲基化在增強(qiáng)靶基因轉(zhuǎn)錄中起著關(guān)鍵作用，我們檢測了TRPC6的啟動子區(qū)DAN甲基化以及DNMT1表達(dá)水平的變化。發(fā)現(xiàn)TRPC6 DNA甲基化水平降低，且DNMT1表達(dá)明顯減少；將其與血糖水平以及細(xì)胞焦亡基因進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示TRPC6低甲基化表達(dá)與血糖水平的變化以及胰島β細(xì)胞焦亡密切相關(guān)。可見TRPC6參與了Hcy誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞焦亡的過程。

綜上所述，TRPC6是Hcy引起血糖異常的關(guān)鍵基因，其中DNA低甲基化參與了高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的cbs+/-小鼠胰島β細(xì)胞焦亡的調(diào)控，這進(jìn)一步為Hcy引起的血糖異常升高這一常見臨床現(xiàn)象提供更多的研究資料和實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

利益相關(guān)聲明：論文的全部作者聲明，在課題研究和論文撰寫過程中不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)說明：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及論文撰寫由揭育禎(第一作者)和楊慧霞(第二作者)完成；實(shí)驗(yàn)實(shí)施由周瑜瑾(第三作者)、張喜文(第四作者)、虎小忠(第五作者)和柳楊(第六作者)完成；實(shí)驗(yàn)評估由丁寧(第七作者)、盧冠軍(第八作者)和馬勝超(通信作者)完成。通過了盲法評估。