低氮脅迫誘導木薯幼苗花青素積累及其基因表達

鄒良平 郭鑫，2 起登鳳 翟敏 李壯 趙平娟 彭明 牛興奎

（1 . 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所，?？?571101；2. 華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術(shù)學院，武漢 430070；3. 武警后勤部直屬保障大隊，北京 100089；4. 四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130）

花青素屬于內(nèi)黃酮家族中的一類，為水溶性色素，幾乎在所有的植物中存在，其作為植物重要的次生代謝產(chǎn)物之一具有超強清除活性氧的功能［1］。當植物處于生物或非生物脅迫環(huán)境中會產(chǎn)生大量的自由基，從而對植物造成損傷，為了抵御不良環(huán)境對植物的影響，合成花青素的相關(guān)酶基因此時被激活表達，植物體內(nèi)花青素合成增加，從而增強植物能夠順利度過脅迫環(huán)境的機會［2］。植物花青素的合成和積累受到多種生物或非生物因子的影響，如病毒、光、溫度、水分、糖、激素、磷和氮等都參與了花青素合成的調(diào)節(jié)和控制［3］。

氮素是植物花青素合成和積累中的一個重要調(diào)控因子。土壤中能夠被植物直接吸收利用的氮素主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。一般來說，植物在低氮環(huán)境條件下能夠促進花青素的合成，而高氮環(huán)境條件下則抑制其合成和積累［4-6］。但是對于不同作物，不同氮素濃度在影響花青素的合成方面卻有所不同：比如在紅色卷心菜中，增施150 kg/ha氮素能夠誘導高含量的花青素產(chǎn)生；在紫色水稻中施用氮肥也能夠增加花青素的積累［7］；但是在擬南芥［6，8-9］、蘋果［10］、葡萄［11］、紅色萵苣［12］等植物中，氮素缺乏或低氮環(huán)境條件下卻有利于促進花青素的合成和積累。即使在低氮環(huán)境條件下，氮素的不同形態(tài)對花青素的誘導合成在不同作物中也表現(xiàn)各異：比如在對擬南芥紅色愈傷組織pap1-D（production of anthocyanin pigment 1-Dominant）中不同氮素濃度和形態(tài)配比的研究表明，銨態(tài)氮（9.8 mmol/L）會降低紅色愈傷組織花青素的含量［5］；在非洲菊中，低濃度的銨態(tài)氮抑制了花瓣花青素的積累［13］；氮在玉米B73中，1 mmol/L銨態(tài)氮卻能夠誘導花青素的累積，而1 mmol/L硝態(tài)氮和缺氮條件下卻不能誘導花青素的產(chǎn)生［14］，但是在蘋果［15］和擬南芥［16］中，低濃度硝態(tài)氮卻能夠促進花青素的合成。由此可見，即使在氮素水平受到控制的環(huán)境條件下，花青素的合成也可能與植物發(fā)育的不同階段及各種環(huán)境因子相關(guān)，并且各因子之間相互作用復雜，因此，植物花青素的合成和積累是植物與各種環(huán)境因子相互作用后最終達成的結(jié)果。

木薯屬于大戟科雙子葉短日照熱帶作物［17］，是世界上繼玉米、水稻、小麥、馬鈴薯和大豆后的第六大類糧食作物。木薯塊根中淀粉含量高、品質(zhì)優(yōu)良［18-19］，被稱為“淀粉之王”，是非洲及南亞等發(fā)展中國家8億人的口糧。木薯作為一種熱帶經(jīng)濟作物，粗生易栽、適應性強，在干旱貧瘠的山地丘陵地也能獲得較高的產(chǎn)量。木薯作為一種經(jīng)濟作物，其基礎(chǔ)研究近年得到了國家和地方的大力支持，木薯的高產(chǎn)高效栽培成為當前研究的主要方向，但相對于其他作物而言總體上還是比較薄弱。本研究通過設(shè)置不同的氮肥濃度及形態(tài)處理對木薯植株花青素合成和積累以及植株農(nóng)藝性狀的影響進行研究，以期通過花青素直觀表型變化來作為木薯對氮素需求的可視化指標，并結(jié)合植物的生長狀態(tài)，為木薯高效栽培的合理施氮提供理論參考和直觀判斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯無菌苗材料Arg7號得益于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所趙平娟副研究員的饋贈。木薯無菌苗培養(yǎng)用的廣口玻璃瓶購置于海口瓊山乾美實驗用品中心。

蔗糖，硝酸鉀，硝酸鈉等購于海南合輝實業(yè)有限公司；植物凝膠、琥珀酰胺，MS缺氮培養(yǎng)基，矢車菊素-3-氧-槐糖苷，甲酸，RNA提取試劑盒，cDNA合成用FastQuant RT Ki試劑盒等購買于北京艾科懷曼生物科技有限公司；RT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 不同氮素形態(tài)和濃度配比培養(yǎng)基準備及培養(yǎng)條件 基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基除了缺氮外與MS（Murashige和Skoog）完全相同。用于本實驗中的不同培養(yǎng)基是在MS缺氮培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加不同氮素濃度和形態(tài)配備而成。具體培養(yǎng)基配比為：（1）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+；（2）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 40 mmol/L NO3-；（3）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 20 mmol/L NH4+；（4）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+；（5）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 0.4 mmol/L NO3-；（6）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 0.2 mmol/L NH4+；（7）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 1 mmol/L（N）；（8）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 5 mmol/L（N）；（9）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 9 mmol/L（N）；（10）基礎(chǔ)MS缺氮培養(yǎng)基 + 13 mmol/L（N）；蔗糖濃度3%（W/V），植物凝膠0.4%（W/V），pH5.8，121℃滅菌20 min。本實驗所用材料均在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術(shù)研究所光照培養(yǎng)房中處理，培養(yǎng)房生長條件為28℃光照16 h，26℃黑暗8 h。

1.2.2 花青素合成相關(guān)基因?qū)崟r定量RT-PCR 培養(yǎng)40 d的無菌苗去除根后用剪刀把莖和葉片剪碎后用液氮快速冷凍，樣品總RNA提取用植物RNA提取試劑盒（OMEGA），cDNA合成用FastQuant RT Kit（TIANGEN）試劑盒。Real-Time PCR在StepOneTMReal-Time PCR儀器（Applied Biosystems）上進行，所 用試劑為SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit（Takara）。每個實驗樣品生物學重復3次。RT-PCR擴增程序為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，30 s；45個循環(huán)?；ㄇ嗨睾铣山Y(jié)構(gòu)基因特異引物見表1。

表1 花青素合成相關(guān)基因特異引物Table 1 Specific primers for the genes related to anthocyanin biosynthesis

1.2.3 總花青素含量測定 木薯樣品去除根部，用剪刀將莖段、葉柄及葉片剪碎后置入加有液氮的研缽中研磨成粉，稱取0.1000 g樣品，加入1 mL 5%甲酸溶液，渦旋混勻，超聲提取；12 000 r/min 4℃離心10 min；收集上清于新的離心管中；向沉淀中加入1 mL 5%甲酸溶液繼續(xù)提取；重復上述步驟數(shù)次，直至上清無色為止；530 nm處測定吸光度值，以5%甲酸溶液作為空白。所用儀器為多功能酶標儀（賽默飛Multiskan GO，美國），酶標板為康寧（美國），要求目標波長下孔間差異小于0.02。按照如下公式計算花青素含量：花青素含量（μg/g）=C×V/M。

其中C為根據(jù)標準曲線計算出的結(jié)果；M為實際稱量質(zhì)量；V為提取液總體積，具體操作請見參考文獻［20-21］。GraphPad Prism 8和SPSS軟件用于花青素含量與氮素濃度之間的相關(guān)性分析，P＜0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 氮素濃度和形態(tài)對木薯品種Arg7幼苗的影響

硝態(tài)氮和銨態(tài)氮是植物利用的主要氮素來源，為了闡明硝態(tài)氮和銨態(tài)氮不同濃度配比對木薯相關(guān)性狀的影響，本研究在MS缺氮培養(yǎng)基中分別配比了6種氮素濃度對Arg7幼苗進行處理。結(jié)果表明，木薯品種Arg7無菌苗在添加有40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+（對照），40 mmol/L NO3-和20 mmol/L NH4+的MS缺氮培養(yǎng)基中生長至40 d時整個植株之間沒有觀察到有差異表型（圖1-A，B和C）；與對照相比，在40 mmol/L NO3-條件下的株高和初生根根長沒有顯著差異（圖1-J，K），但初生根根數(shù)顯著減少（圖1-L），而在20 mmol/L NH4+條件下其株高、初生根根長和初生根根數(shù)都受到極顯著抑制（圖1-J，K，L）。

木薯品種Arg7幼苗在含有0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+的MS缺氮培養(yǎng)基中處理至15 d，在葉柄處出現(xiàn)淡紅色表型，這種表型隨著處理時間延長而逐漸加深；在處理至40 d時，葉柄處深紅色表型已延展至木薯莖段部位（圖1-D，E和F）；與對照相比，在0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+條件下的株高、初生根根長和根數(shù)都極顯著降低（圖1-J，K，L），葉片退綠變黃老化（圖1-D，E和F）；當處理至90 d時，葉片黃化更明顯，深紅色表型出現(xiàn)在葉片主脈中（圖1-G，H，I）。

圖1 氮素濃度和形態(tài)對木薯Arg7幼苗的影響Fig.1 Influences of the concentration and the forms of nitrogen onsterile cassava variety Arg7 seedling

2.2 木薯品種Arg7花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達

為了明確木薯品種Arg7在低氮條件下在葉柄和莖段處產(chǎn)生的深紅色表型與花青素合成過程中相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達的相關(guān)性，本研究根據(jù)擬南芥和矮牽牛中花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因序列，在phytozome（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!search?show= KEYWORD &method=Org_Mesculenta）網(wǎng)站上通過BLAST查找出木薯相關(guān)基因，篩選出與擬南芥和矮牽牛同源性高的木薯相關(guān)基因合成特異引物（表1）并進行RT-PCR。結(jié)果（圖2）表明，花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因PAL，4CL，CHS，F(xiàn)3H，DFR，ANS在低濃度氮素（0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+）處理條件下的轉(zhuǎn)錄水平比高濃度氮素（40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+，40 mmol/L NO3-和20 mmol/L NH4+）處理條件下的表達量高，即木薯花青素合成結(jié)構(gòu)基因PAL，4CL，CHS，F(xiàn)3H，DFR，ANS在Arg7品種中能夠被低濃度氮素誘導表達。由此表明，在木薯品種Arg7中產(chǎn)生的深紅色表型可能與花青素相關(guān)。

圖2 不同氮素處理條件下花青素合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因的表達Fig. 2 Expressions of genes related to anthocyan in biosynthesis under different concentration and forms of nitrogen

2.3 木薯品種Arg7產(chǎn)生的花青素與氮素的相關(guān)性分析

由于花青素水溶液在酸性條件下呈紅色，在520 nm存在特征吸收峰，并且吸收峰大小與樣品花青素含量呈正比例關(guān)系。據(jù)此原理，我們用酶標儀對花青素總含量進行了測定。結(jié)果表明，在低氮（0.4 mmol/L NO3-+ 0.2 mmol/L NH4+，0.4 mmol/L NO3-和0.2 mmol/L NH4+）條件下的植株，其花青素含量相較于在高氮（40 mmol/L NO3-+ 20 mmol/L NH4+，40mmol/L NO3-和20 mmol/L NH4+）條件下的含量高，其最高含量（213.75 ± 3.22 μg/g）比最低含量（22.10± 1.51μg/g）增加了約10倍（圖3）。

圖3 不同氮素處理條件下的花青素含量Fig. 3 Content of anthocyanin under different nitrogen treatment conditions

為了進一步明確木薯品種Arg7中產(chǎn)生的花青素與氮素之間的相關(guān)性，將該品種無菌苗分別轉(zhuǎn)接至含有1 mmol/L，5 mmol/L，9 mmol/L和13 mmol/L氮素的MS培養(yǎng)基中處理。當處理至15 d時，含有1 mmol/L氮素的植株葉柄處即出現(xiàn)紅色花青素；處理至20 d時，含有5 mmol/L氮素的植株葉柄處開始出現(xiàn)紅色花青素，而此時1 mmol/L氮素處理的植株葉柄處積累的紅色花青素開始向莖段中擴展；當處理至30 d的時候，含有9 mmol/L氮素的植株葉柄處才開始出現(xiàn)淡淡的紅色花青素；直至處理至40 d，在含有13 mmol/L氮素的植株中也沒有觀察到花青素產(chǎn)生（圖4-A-D）。

將上述處理40 d的植株進行花青素含量測定，然后將氮素濃度與花青素含量進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，木薯品種Arg7中產(chǎn)生的花青素含量隨著氮素濃度的增加而降低，即花青素含量與氮素濃度存在負相關(guān)關(guān)系（相關(guān)系數(shù)R2=0.96，圖4-E）。

圖4 花青素含量隨著氮素濃度遞增而呈負相關(guān)關(guān)系Fig.4 Anthocyanin content negatively correlated with the increase of nitrogen concentration

3 討論

氮素是影響植物生長發(fā)育的重要礦質(zhì)營養(yǎng)元素［22］。其不僅作為營養(yǎng)物質(zhì)參與生物大分子如核苷酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、葉綠素、激素、生物堿、酶等的構(gòu)成，同時也作為一個重要信號分子參與植物的多個生命活動過程［23-24］。植物在低氮環(huán)境條件下生長發(fā)育會受到嚴重影響。一系列的研究表明，植物中積累的花青素在抵御低氮生長環(huán)境過程中發(fā)揮著極其重要的作用。通常情況下，低氮環(huán)境能夠通過促進苯丙烷途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因，包括PAL，4CL，CHS，CHI，F(xiàn)3H，DFR，ANS和UFGT的增量表達來達到增加花青素產(chǎn)生和積累的目的，從而增加在低氮脅迫環(huán)境中存活的機會。這些結(jié)構(gòu)基因受到包 含TTG1-TT8/GL3-PAP1，TTG1-TT8/GL3-PAP2，TTG1-TT8/GL3-MYB113和TTG1-TT8/GL3-MYB114在內(nèi)的保守MBW（MYB-bHLH-WD40/WDR）蛋白復合體的調(diào)控［1，10，25-26］。擬南芥中過量表達柑橘CsMYB3能有效抑制AtCHS、AtF3H、AtDFR和AtANS等花青素合成結(jié)構(gòu)基因的表達，并最終影響氮缺失條件下花青素的積累［27］。在低氮條件下，擬南芥tt3（DFR）突變體表現(xiàn)出非常低的存活率，說明花青素對擬南芥耐低氮脅迫至關(guān)重要［1］。過量表達轉(zhuǎn)錄因子基因PAP1，能夠顯著提高PAL1，C4L，CHS，F(xiàn)3`H，F(xiàn)3H，DFR，ANS和GT的 表 達［28］?；ㄇ嗨氐暮铣沙耸艿組BW的調(diào)控外，還受到花青素合成負調(diào)控因子LBD（lateral organ boundary domain，LBD）37，LBD38和LBD39的調(diào)控［4］。增施氮素，能夠激活LBD37，LBD38和LBD39基因的表達，花青素合成被抑制。

土壤中能夠被植物直接吸收利用的氮素主要是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮。目前研究更多的是不同濃度的硝態(tài)氮對花青素合成的影響。相對于硝態(tài)氮而言，銨態(tài)氮對植物花青素的影響研究較少，且其研究結(jié)果還因植物不同而出現(xiàn)對花青素合成產(chǎn)生不一樣的效果［5，13-14］。本研究通過木薯品種Arg7在缺氮MS培養(yǎng)基中添加不同氮素濃度和形態(tài)處理后發(fā)現(xiàn)，該品種花青素的產(chǎn)生只受到氮素濃度而非形態(tài)影響，并且花青素的產(chǎn)生和積累與氮素濃度存在負相關(guān)關(guān)系。

在擬南芥中，氮素受到限制或者在氮饑餓生長條件下，葉綠體含量降低，葉片中花青素含量增加，并且促進根特別是側(cè)根的生長［29］。在本實驗中，木薯品種Arg7在低濃度的氮素生長條件下，花青素合成結(jié)構(gòu)基因表達水平升高，花青素含量增加，葉片由黃變白，根和地上部分生長都受到抑制，與玉米B73的研究結(jié)果比較相似［14］。

花青素能夠在非生物脅迫條件下被誘導產(chǎn)生和積累，對于提高應對不利脅迫環(huán)境的生存能力極其重要。花青素的這種可視化生理現(xiàn)象在擬南芥中已經(jīng)作為氮缺乏等營養(yǎng)不足的一種代謝標記［3］，這種標記也為我們在實驗可控條件下研究木薯在生長過程中花青素產(chǎn)生和積累所需要的最大氮素濃度閾值提供了可能。我們后續(xù)目標主要集中在研究這種最大氮素濃度閾值與木薯產(chǎn)量之間的相關(guān)性。如果木薯產(chǎn)量（木薯塊莖）在這種氮素濃度下與常規(guī)栽培條件下的產(chǎn)量沒有顯著性差異，就可以在栽培中利用花青素作為一個需肥可視生理指標用于指導實踐。當然，花青素的產(chǎn)生受到多種脅迫（氮素脅迫，磷脅迫，光脅迫，低溫脅迫，干旱脅迫等自然環(huán)境非生物脅迫）影響，要利用花青素在栽培上作為一個可靠的可視生理指標，還需要對影響花青素合成的主要脅迫因子進行詳細研究，在實驗可控條件下分別闡明影響花青素產(chǎn)生的最大閾值，建構(gòu)木薯最優(yōu)栽培模型并應用于生產(chǎn)，從而為木薯在未來栽培過程中減施增效提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

木薯品種Arg7幼苗植株中花青素的誘導表達和積累只與氮素濃度相關(guān)，而與氮素形態(tài)無關(guān)。