扶正補血食療方含藥血清干預Notch通路調(diào)控骨髓造血干細胞化療后損傷的機制研究

汪旭，郝曉蓓，楊敏，潘婭嵐，王慶，徐桂華

（南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210023）

惡性腫瘤是全世界面臨的重大健康問題，其發(fā)病率和病死率正在迅速上升［1］。目前化療仍為惡性腫瘤臨床治療的主要措施，但約有80%的患者在此過程中會出現(xiàn)骨髓抑制［2］，表現(xiàn)為貧血、出血、免疫力降低等不良反應(yīng)，影響化療的療效甚至導致患者死亡［3］。化療誘導造血干細胞（hematopoietic stem cells，HSCs）的衰老，造成其自我更新能力受損，這是骨髓抑制發(fā)生最為關(guān)鍵的機制［4］。造血微環(huán)境（即造血龕）主要包括基質(zhì)細胞、細胞因子、細胞外基質(zhì)等，參與支持和調(diào)控造血干細胞的自我更新、靜息、凋亡等功能［5］。間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可分泌不同細胞因子和傳遞信號分子，具有免疫調(diào)節(jié)和支持造血的功能，是造血微環(huán)境中的重要成員之一［6-7］。臨床發(fā)現(xiàn)通過MSCs 和HSCs 共移植能夠促進造血微環(huán)境恢復［8］。同時，MSCs 與HSCs 體外共培養(yǎng)，對HSCs 體外增殖具有明顯的積極作用［9］。研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路可調(diào)控HSCs的自我更新能力，其受體和配體高表達于造血微環(huán)境和HSCs 中，同時Notch 通路在調(diào)節(jié)細胞增殖、分化過程中具有極為重要的作用［10］。

近年來基于多組分和多靶點的中醫(yī)藥治療骨髓抑制已引起廣泛關(guān)注，與口服升白藥等現(xiàn)代醫(yī)學治療藥物相比，毒副作用小，可明顯改善患者的骨髓抑制癥狀，提升其生活質(zhì)量。中醫(yī)食療是中醫(yī)藥學的重要組成部分，以食助藥力、藥助食威。研究表明中醫(yī)食療應(yīng)用于化療后骨髓抑制，是“藥、食、養(yǎng)”結(jié)合，臨床療效確切，同時具有簡單方便、適口性好的優(yōu)勢［11］。課題組在總結(jié)前期由黃芪、當歸、豬蹄為主要成分的歸芪豬蹄食療方改善化療后骨髓抑制臨床療效和對造血微環(huán)境保護作用的基礎(chǔ)上［12-14］，基于“精氣血”互生理論進行了處方優(yōu)化，加入黃精組成扶正補血食療方，提出扶正補血食療方可能對化療后HSCs發(fā)揮保護作用，因此本研究擬通過5-FU 損傷小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow-mesenchymal stem cells，BMSCs）和HSCs 體外共培養(yǎng)模型，觀察扶正補血食療方含藥血清對模擬“造血龕”中HSCs 增殖、凋亡以及Notch 信號通路基因表達的影響，初步探討扶正補血食療方調(diào)控骨髓造血功能的分子機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠20 只，雄性，3～4 周齡，體質(zhì)量（180 ± 20）g，購買于杭州醫(yī)學院，合格證號：SCXK（浙）2019-0002。SPF 級C57BL/6 小鼠，4～6 周齡，雄性，體質(zhì)量18～20 g；購于南京青紫蘭科技有限公司，合格證號：SCXK（蘇）2016-0010。于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行飼養(yǎng)，自由飲食、飲水，室溫（22 ±2）℃，濕度40%～60%，并已經(jīng)獲得南京中醫(yī)藥大學倫理委員會批準（批準號：201910A018）。

1.2 實驗用試劑

DMEM-F12 培養(yǎng)基（美國，HyClone）；胎牛血清（美國，Gibco）；青霉素-鏈霉素（美國，Gibco）；0.25%胰蛋白酶（上海，碧云天生物技術(shù)有限公司）；CD29-FITC，CD44-FITC，CD117-APC（美國，eBioscience）；5-Fluorouracil（德國，Sigma）；Cell Counting Kit-8（日本，同仁）；細胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；細胞凋亡檢測試劑盒（南京福麥斯生物技術(shù)有限公司）；Ficoll 分離液（天津，TBD）；CD117 MicroBeads，mouse（德國，Miltenyi Biotec）；mouse SCF，mouse IL-3（上海，novoprotein）；TRIzol 試劑（美國，ABI）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，qPCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）。

1.3 實驗用儀器

CO2培養(yǎng)箱（日本，Panasonic）；垂直超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；Gallios 型流式細胞儀（美國，Beckman）；MACS 免疫磁珠分選系統(tǒng)（德國，Miltenyi Biotec）；Synergy H1MD 型多功能酶標儀（美國，Bio-Tek）；DMi8型倒置熒光顯微鏡（德國，Leica）；5810R 型高速冷凍離心機（德國，Eppendprf）；Step One Plus 實時熒光定量PCR儀（美國，ABI）。

2 方法

2.1 扶正補血食療方含藥血清制備

扶正補血食療方中當歸：黃芪：黃精：豬蹄質(zhì)量比例為1∶5∶2∶60。取豬蹄1 200 g洗凈切塊，放入砂鍋并加水煮沸，去除浮沫洗凈后再加入1 800 mL 清水，煮沸后改用文火熬制2.5 h。取當歸20 g、黃芪100 g、黃精40 g 加水浸泡0.5 h 后加入豬蹄湯內(nèi)，先大火煮沸10 min，后改文火煎50 min，過濾殘渣并置4 ℃過夜。第2天去除上層油脂，放入37 ℃水浴，旋蒸濃縮至生藥濃度為0.504 g/mL，分裝后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。相關(guān)藥材購于江蘇省中醫(yī)院，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定質(zhì)量合格，豬蹄購于南京市內(nèi)超市，具有食品合格證書。

20 只SD 大鼠隨機分為灌胃組和空白組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按照1 mL/100 g 劑量灌胃，灌胃組灌服扶正補血食療方，空白組灌服等體積生理鹽水，并于每天上午9 時灌胃1 次，連續(xù)7日。于末次灌胃1 h 后腹主動脈取血，室溫靜置2 h，3 000 r/min 離心20 min，取上清并于56 ℃水浴30 min，過濾除菌后，分裝凍存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)、傳代及鑒定

取4～6 周齡雄性C57BL/6 小鼠，脫頸處死，放入75%乙醇中浸泡3～5 min，無菌條件下分離雙側(cè)脛骨和股骨，剪去兩側(cè)骨端，用培養(yǎng)基反復沖洗骨髓腔至骨髓腔變白，吹打均勻后接種于60 mm無菌培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后全量換液，隨后每2～3 d 換液1 次，細胞長至70%～80%融合時，按1∶2 消化傳代，傳至第3 代后備用。收集第3 代的小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，調(diào)整細胞數(shù)為1 × 106個/管，分別加入抗小鼠CD29-FITC，CD44-FITC，CD117-APC，4 ℃避光孵育30 min 后，PBS 洗2次，流式細胞儀檢測。

2.3 小鼠骨髓CD117+造血干細胞免疫磁珠分選及鑒定

同“2.2”項下方法獲得骨髓細胞后，過200 目濾網(wǎng)，450 ×g離心10 min，棄上清。用1 mL 無菌PBS 重懸，加入2 mL 小鼠Ficoll 分離液中，400 ×g離心30 min。收集第二層環(huán)狀乳白色細胞層并加入PBS 重懸，400 ×g離心10 min。運用MACS 免疫磁珠分選系統(tǒng)分選CD117+細胞。調(diào)整細胞數(shù)為1×105每管，加入抗小鼠CD117-APC，4 ℃避光孵育30 min 后，PBS 洗2 次，流式細胞儀檢測。剩余HSCs 用DMEM-F12 培養(yǎng)基（含10% FBS、25 ng/mL SCF、25 ng/mL IL-3、1%青霉素-鏈霉素）重懸，調(diào)整細胞密度為1 × 106個/mL接種于培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.4 共培養(yǎng)細胞分組

選擇對數(shù)生長期的小鼠BMSCs，按1.5×106個/孔種植于6孔板，待細胞貼壁之后，換無血清DMEM/F12培養(yǎng)基使細胞生長同步化12 h，干預24 h后將“2.3”項下方法分離提取的CD117+細胞按5 × 105個/mL 與下面3 組BMSCs進行共培養(yǎng)。隨機分為以下3組：空白組，BMSCs+10% 空白血清；5-FU 組，BMSCs+10% 空白血清+50μg/mL 5-FU；扶正補血食療方含藥血清組，BMSCs+10%扶正補血食療方含藥血清+50μg/mL 5-FU。共培養(yǎng)48 h以后收集CD117+細胞做后續(xù)相關(guān)檢測。

2.5 CCK-8法檢測小鼠骨髓造血干細胞增殖

按“2.5”項下方法進行細胞分組，將小鼠BMSCs和HSCs種植于24孔板中，每組設(shè)3個復孔，其中BMSCs為5 × 104個/孔、HSCs 為1 × 104個/孔。收集各組懸浮的CD117+細胞，每孔樣本單獨離心，加入無血清DMEM/F12培養(yǎng)基重懸混勻后添加至96孔板中，并加入CCK-8試劑10μL/孔，于37 ℃CO2敷箱中孵育5 h，使用酶標儀在450 nm處的吸光度值，實驗重復3次取平均值。

存活率（IR）=［（實驗組OD 值均數(shù)-空白組OD 值均數(shù)）/（對照組OD值均數(shù)-空白組OD值均數(shù)）］×100%

2.6 流式細胞術(shù)分析小鼠骨髓造血干細胞的細胞周期

收集各組懸浮的CD117+細胞，PBS 洗滌2 次，離心去上清，加入500μL 70%冷乙醇4 ℃固定2 h。染色前用PBS，1 000 rpm 離心3 min 洗去固定液，加入500μL PI/RNase A 工作液（RNase A∶PI比例為1∶9），室溫避光孵育30 min，上流式細胞儀分析CD117+細胞的細胞周期。

2.7 流式細胞術(shù)分析小鼠骨髓造血干細胞的細胞凋亡

收集各組懸浮的CD117+細胞，用預冷的PBS 洗細胞2 次，用100μL 緩沖液重懸細胞，加入5μL Annexin V/Alexa Fluor 647 和10μL 20μg/mL 的碘化丙錠溶液，混勻后于室溫避光孵育15 min，在管中加400 μL PBS混勻后上機，流式細胞儀分析。

2.8 qRT-PCR 檢測小鼠骨髓造血干細胞中Notch 信號通路相關(guān)的基因表達

收集各組懸浮的CD117+細胞，PBS 洗滌2 次，采用TRIzol法提取CD117+細胞的總RNA，檢測RNA 濃度和純度并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH 作為內(nèi)參，做qRTPCR 檢測骨髓造血干細胞中Notch 信號通路相關(guān)的基因表達，所用引物序列見表1，采用2-△△T法計算均值作為相對表達量。

表1 引物序列

2.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0軟件進行對數(shù)據(jù)分析，結(jié)果用±s表示，滿足正態(tài)性和方差齊性的計量資料采用單因素方差分析；方差不齊者采用Dunett′s T3檢驗，不符合正態(tài)性者采用Kruskal-Wallis H 非參數(shù)檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)48 h 后絕大部分細胞已經(jīng)貼壁，并呈現(xiàn)多角形、梭形、圓形等不均一的細胞形態(tài)等（見圖1A）。培養(yǎng)6～8 d后，細胞大部分呈扁平形或紡錘形，細胞融合達50%～60%（見圖1B）。傳至第3 代后細胞主要呈長梭形排列，細胞基本在24 h內(nèi)貼壁，不規(guī)則雜細胞較少，間充質(zhì)干細胞逐漸純化（見圖1C）。流式細胞術(shù)檢測小鼠BMSCs 中97.5%呈CD29 陽性，98.8%呈CD44陽性，僅0.17%呈C-kit陽性（見圖2A～C）。

3.2 小鼠CD117+細胞的形態(tài)及鑒定

倒置顯微鏡觀察分選出的小鼠骨髓造血干細胞體積偏小，細胞形態(tài)為圓形（見圖1D），行臺盼藍染色后99%細胞拒染。流式細胞術(shù)檢測小鼠HSCs 中90.3%呈CD117 陽性（見圖2D）。

3.3 共培養(yǎng)各組細胞形態(tài)

共培養(yǎng)空白組可見底層小鼠BMSCs 細胞呈梭形生長，排列緊密，融合度高；小鼠CD117+細胞為圓形細胞，成團或單獨懸浮生長于底層細胞表面，少數(shù)散落在底層小鼠BMSCs 間隙中（見圖3A）。共培養(yǎng)5-FU 組可見底層小鼠BMSCs 細胞形狀不規(guī)則，小鼠CD117+細胞呈圓形懸浮生長于底層細胞表面，數(shù)量均顯著減少（見圖3B）。共培養(yǎng)扶正補血食療方含藥血清組底層小鼠BMSCs 和小鼠CD117+細胞形態(tài)和生長狀態(tài)基本同共培養(yǎng)5-FU 組，但細胞數(shù)量明顯增加（見圖3C）。

3.4 CCK-8法檢測小鼠骨髓造血干細胞增殖

與空白組相比，5-FU 組小鼠CD117+細胞活性顯著降低（P＜0.05）；與5-FU 組相比，扶正補血食療方含藥血清干預后明顯促進小鼠CD117+細胞增殖（P＜0.05）。見表2。

表2 扶正補血食療方含藥血清對HSCs細胞增殖的影響（±s，n=3）

表2 扶正補血食療方含藥血清對HSCs細胞增殖的影響（±s，n=3）

注：與空白組比較，1）P ＜0.05；與5-FU組比較，2）P ＜0.05。

組別空白組5-FU組扶正補血食療方注A450nm 3.30±0.44 1.15±0.061）1.81±0.192）存活率（%）-0.32±0.031）0.54±0.022）

3.5 流式細胞術(shù)分析小鼠骨髓造血干細胞細胞凋亡和細胞周期

與空白組相比，應(yīng)用5-FU 刺激后小鼠CD117+細胞總凋亡率顯著增加（P＜0.05）；而小鼠CD117+細胞經(jīng)扶正補血食療方含藥血清處理后，含藥血清組的細胞總凋亡率下降（P＜0.05）。與空白組相比，5-FU 組小鼠CD117+細胞的G0/G1 期細胞占比明顯增加（P＜0.05）；與5-FU 組比較，扶正補血食療方含藥血清組的G0/G1 期細胞占比減少（P＜0.05），這表明共培養(yǎng)條件下5-FU 組的小鼠CD117+細胞出現(xiàn)G1 期阻滯，而扶正補血食療方含藥血清干預抑制了小鼠CD117+細胞的休眠狀態(tài)，細胞周期更加活躍。見表3。

表3 扶正補血食療方含藥血清對HSCs細胞凋亡和細胞周期阻滯的影響（±s，n=3）

表3 扶正補血食療方含藥血清對HSCs細胞凋亡和細胞周期阻滯的影響（±s，n=3）

注：與空白組比較，1）P ＜0.05；與5-FU組比較，2）P ＜0.05。

組別空白5-FU扶正補血食療方G0/G1期（%）49.82±0.67 55.44±0.141）52.68±0.072）凋亡率（%）5.81±0.75 27.69±2.211）13.77±1.312）

3.6 qRT-PCR 檢測小鼠骨髓造血干細胞中Notch 信號通路相關(guān)的基因表達結(jié)果

與空白組相比，5-FU 組小鼠CD117+細胞Jagged1、Notch1、Notch2 基因表達降低（P＜0.05），經(jīng)扶正補血食療方含藥血清干預，含藥血清組細胞Jagged1、Notch1、Notch2 基因表達均增加（P＜0.05）。見表4。

表4 扶正補血食療方含藥血清對HSCs中Notch mRNA表達水平的影響（±s，n=3）

表4 扶正補血食療方含藥血清對HSCs中Notch mRNA表達水平的影響（±s，n=3）

注：與空白組比較，1）P ＜0.05；與5-FU組比較，2）P ＜0.05。

組別空白組5-FU組扶正補血食療方組Jagged1/GAPDH 1.03±0.27 0.17±0.101）1.69±0.542）Notch1/GAPDH 1.01±0.19 0.14±0.041）0.67±0.212）Notch2/GAPDH 1.00±0.12 0.64±0.261）1.37±0.062）

4 討論

骨髓抑制是接受化療的惡性腫瘤患者常見的劑量限制副作用，目前促進造血功能恢復的可用方法仍然有限。造血是通過HSCs協(xié)調(diào)的自我更新、增殖和分化而發(fā)生的一個連續(xù)的血細胞產(chǎn)生過程。因此當高劑量化療損害HSCs的再生和分化潛能時，就會發(fā)生以全血細胞減少為主的造血功能不足，甚至演變成危及生命的并發(fā)癥。骨髓造血微環(huán)境由多種細胞和因子共同構(gòu)成構(gòu)成，主要為HSCs提供存活所需要的養(yǎng)分和傳導信號，達到調(diào)控HSCs 的功能的作用。MSCs 是骨髓造血生態(tài)位的重要組成部分，在造血譜系細胞的發(fā)育、維持和增殖中發(fā)揮作用［15］。研究發(fā)現(xiàn)MSCs和HSCs共培養(yǎng)構(gòu)成的造血“龕”，提供了類似骨髓的微環(huán)境，有利于促進HSCs的維持和增殖。同時MSCs能夠分泌多種與造血相關(guān)的細胞因子，如IL-6、LIF、SCF 等，直接促進HSC 增殖［16］。王曉玲等［17］通過模擬輻射旁效應(yīng)HSCs與BMSCs 的共培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)“芪歸藥對”載藥血清可能通過抑制NF-κB 通路，降低HSCs 凋亡率并促進其增殖，抵抗了HSCs輻射損傷。當MSCs與HSCs直接接觸時，MSCs 分泌多種黏附因子，HSCs 上也表達相應(yīng)的配體［18］，與其他共培養(yǎng)方式相比，二者直接接觸支持HSCs 增殖的效果更明顯［19］。因此本研究選擇將BMSCs 和HSCs 共培養(yǎng)，建立化療后骨髓抑制的造血“龕”模型，探究扶正補血食療方是否可以通過保護造血“龕”功能，達到保護造血“龕”中造血干細胞的目的。

Notch 信號通路具有高保守性并廣泛存在于脊椎和非脊椎動物中。Notch是一種跨膜受體，由配體-受體相互作用激活，被裂解釋放其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，直接影響靶基因的轉(zhuǎn)錄。此過程通過介導細胞間信號傳導，在造血系統(tǒng)中發(fā)揮著調(diào)節(jié)造血的關(guān)鍵作用［20］。Rafii 課題組發(fā)現(xiàn)，輻照后重度骨髓抑制小鼠的Notch 信號激活，有利于抵抗HSCs 損傷和維持HSCs 自我更新［21］。在HSCs中Notch信號通路高度活化，成骨細胞中Notch配體Jagged1 表達，并激活HSCs 上Notch 受體Notch1 的表達，HSCs 數(shù)量顯著增加［22］。VARNUM-FINNEY 等認為通過Jagged1-Notch2信號調(diào)控5-FU 化療后骨髓抑制小鼠短期和長期造血重建，且抑制了髓系分化［23］。研究證明MSCs上激活的Jagged1表達增強了Notch2信號，抑制p63 并促進抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，減少HSCs 凋亡并改善造血恢復［24］。同時，Notch 信號通路下游主要靶分子也在HSCs 高表達［25］。提示Notch 信號途徑可能在HSCs 維持和再生過程中發(fā)揮著重要調(diào)控作用。

中醫(yī)古籍中并沒有骨髓抑制的記載，可將其歸屬于“血虛”“虛勞”范疇［26］。大多數(shù)學者認為骨髓抑制的病因為“脾腎兩虛”“氣血不足”，因此中醫(yī)主張健脾補腎、補血益氣［27-28］。中醫(yī)食療方主要起到健脾養(yǎng)胃的功效，可有效改善臨床患者化療期間如乏力、疼痛、失眠和食欲低下等的不良反應(yīng)［29］。本研究中扶正補血食療方由當歸、黃芪、黃精及豬蹄組成，方中重用黃芪，黃芪為補中益氣之要藥，補氣而行血；當歸補血活血，以使陽生陰長，氣旺血生；黃精補氣養(yǎng)陰、益腎填精，平補肺、脾、腎三經(jīng)；豬蹄甘、咸、平，養(yǎng)腎填精。精氣血互生，共奏固本培元之功，契合中醫(yī)對惡性腫瘤化療后骨髓抑制的治療理念。課題組通過高效液相色譜實驗檢測扶正補血食療方發(fā)現(xiàn)，本食療方含有多種活性成分，如黃芪甲苷、當歸多糖、黃精皂苷、阿魏酸等，現(xiàn)代藥理研究證明其具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化和保護臟器的功效［30-31］，同時也可直接或間接促進HSCs 增殖，改善造血干細胞衰老［32-33］。豬蹄中豐富的膠原蛋白及被消化分解后產(chǎn)生的小分子肽，也具有補血、抗氧化及抗癌的積極作用［34］。

研究結(jié)果顯示，扶正補血食療方含藥血清可以顯著提高5-FU損傷的小鼠HSCs細胞活力，同時使停滯在靜止期的HSCs 減少，細胞總凋亡率下降，說明扶正補血食療方可以通過促進小鼠HSCs G0/G1 期細胞向S 期轉(zhuǎn)變，促進HSCs 增殖。扶正補血食療方可能通過增強BMSCs 和HSCs 之間的黏附作用，使更多的HSCs進入增殖期，為減少周期依賴性化療藥物5-FU 摻入到增殖的HSCs 的RNA 中，抑制其DNA 合成或干擾分化而發(fā)揮輔助作用，減少HSCs 受損。與對照組相比，5-FU 組小鼠CD117+細胞Jagged1、Notch1、Notch2 基因表達降低；與5-FU組相比，扶正補血食療方含藥血清組細胞Jagged1、Notch1、Notch2 基因表達均增加，結(jié)果說明，扶正補血食療方能在一定程度上促進HSCs增殖，其機制可能與激活Notch 信號通路，上調(diào)Jagged1、Notch1、Notch2 的表達有關(guān)。基于組成本食療方的中藥和食物的成分多樣，本研究選用含藥血清進行體外實驗，更符合食療方在體內(nèi)被消化、吸收、代謝和入血的過程，并得到最終的有效物質(zhì)成分［35］。本研究表明拮抗HSCs化療后損傷的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能與其富含的多種抗炎抗氧化、補血、抗癌的活性成分有關(guān)，同時Notch信號通路參與調(diào)控，通過上調(diào)Notch 通路關(guān)鍵因子Jagged1、Notch1、Notch2表達水平，調(diào)節(jié)造血“龕”功能，進而促進HSCs增殖，降低凋亡率，緩解HSCs化療損傷程度。綜上所述，本研究初步闡釋了扶正補血食療方拮抗化療毒副作用的機制，為中醫(yī)食療應(yīng)用于臨床防治骨髓抑制提供了實驗依據(jù)。但目前仍存在一定局限性，課題組計劃對食療方中主要有效成分進行全面分析和提純，更加明確其作用機制。同時，對于Notch 信號通路蛋白表達情況，上、下游靶點以及具體調(diào)控機制，仍需進一步深入研究。