芪歸益腎方對缺血再灌注致急性腎損傷小鼠的保護作用

姜玉勤， 孫曉怡， 汪繼濤， 唐余燕， 劉何晶， 陸 迅， 魏明剛*

(1.蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇 蘇州 215006；2.蘇州市立醫(yī)院北區(qū)，江蘇 蘇州 215000)

急性腎損傷主要指以腎小球濾過率迅速下降，同時患者血清肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)水平升高為特點的臨床綜合征[1]。2015年世界腎臟病協(xié)會報道表明，全球范圍內(nèi)每年受到急性腎損傷影響的人約有1 300萬，而每年因缺血再灌注腎損傷導(dǎo)致的死亡人數(shù)約170萬人[2]。缺血再灌注損傷是引起急性腎損傷的主要原因之一，但目前仍欠缺預(yù)防缺血再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷針對性的藥物[3]，因此積極探究缺血再灌注引起的急性腎損傷的機制，尋找和發(fā)現(xiàn)有效預(yù)防和治療的藥物至關(guān)重要。

缺血再灌注引起的急性腎損傷可使氧自由基大量產(chǎn)生，氧化應(yīng)激狀態(tài)被激活，是目前公認(rèn)影響急性腎損傷的主要因素[4]，因此氧自由基的清除成為治療急性腎損傷的關(guān)鍵手段。血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是血紅素分解的限速酶，催化血紅素生成等摩爾的一氧化碳(CO)、膽紅素和亞鐵離子，這些分解產(chǎn)物在氧化應(yīng)激中起著保護組織細(xì)胞的作用[5-6]。過量氧自由基導(dǎo)致抗氧化狀態(tài)失衡，引起核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nrf2)的表達(dá)增加，從而增加HO-1的表達(dá)增強抗氧化，發(fā)揮細(xì)胞保護作用[7]。在課題組前期實驗中證實芪歸益腎方對順鉑導(dǎo)致的急性腎損傷具有確切的保護作用，本研究旨在探討芪歸益腎方對缺血再灌注引起的急性腎損傷小鼠腎功能的保護作用及相關(guān)機制，為臨床患者的腎功能保護治療提供理論支持。

1 材料

1.1 動物 SPF級雄性ICR小鼠32只，體質(zhì)量(20±3)g，由蘇州大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)20170005。

1.2 試劑 黃芪(批號170828015)、當(dāng)歸(批號170803015)、川芎(批號170702015)、懷牛膝(批號170718015)飲片由蘇州市天靈中藥飲片有限公司提供，按3∶1∶1∶1的比例煎至質(zhì)量濃度為2.5 g/mL，均符合2015年版《中國藥典》相關(guān)要求，劑量根據(jù)課題組前期研究結(jié)果確定[8]。硫酸鋅注射液(批號2001081)。SOD試劑盒(批號20101103)、MDA試劑盒(批號20201107)、Scr試劑盒(批號20201012)、BUN試劑盒(批號20201009)、HO-1抗體(批號GB12104)、Nrf2抗體(批號KF742)、蛋白磷酸酶抑制劑(批號W061-1-1)、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(批號GB23301)均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 儀器 電泳儀、電泳槽、電轉(zhuǎn)槽、全自動凝膠成像系統(tǒng)，購自美國Bio-Rad公司；臺式低速離心機，購自上海精密科學(xué)儀器有限公司；高速微量臺式冷凍離心機，購自美國Thermo公司；全自動酶標(biāo)儀，購自美國Bio-Tek公司；Axio Imager M1m顯微鏡，購自德國Zeiss公司。

2 方法

2.1 分組與造模 將32只ICR小鼠按隨機數(shù)字法分成假手術(shù)組、模型組、芪歸益腎方組和硫辛酸組，每組8只，芪歸益腎方給藥劑量為50 g/kg[8]，按照人常規(guī)劑量與小鼠用藥換算關(guān)系[9]，確定硫辛酸組給藥劑量為0.1 g/kg，每天給藥1次，連續(xù)1周。1周后，除假手術(shù)組，其余各組利用右腎切除、左腎動脈夾閉45 min后再灌注的方法建立小鼠急性腎損傷模型。

小鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，仰臥固定，常規(guī)消毒，沿腹正中線做切口，逐層分離組織，進(jìn)入腹腔，暴露出雙側(cè)腎臟，模型組、芪歸益腎方和硫辛酸組暴露右側(cè)腎動脈及腎蒂，結(jié)扎右腎動脈后將腎切除，再分離左腎動脈并用絲線結(jié)扎，可見左腎顏色由粉紅變?yōu)榘导t，表明腎缺血模型成功，25 min后松開絲線恢復(fù)供血，腎臟顏色由暗紫變?yōu)轷r紅，顏色有所恢復(fù)。假手術(shù)組用同樣方法切除右腎后，游離左側(cè)腎蒂只穿線不結(jié)扎。造模24 h后打開小鼠胸腔，心臟采血，全血靜置30 min，3 500 r/min離心10 min，取上清，血清于-20 ℃冰箱中保存。采血后迅速剖取左腎，縱行剖開，一部分用10%甲醛固定，另一部分預(yù)冷并用PBS清洗，液氮處理后于-80 ℃冰箱中保存，進(jìn)行病理及分子生物學(xué)檢測。

2.2 血清Scr、BUN水平檢測 取小鼠血清，參照相關(guān)試劑盒說明書操作檢測Scr、BUN水平。

2.3 氧化應(yīng)激分子水平檢測 取小鼠血清，根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書檢測SOD活性及MDA水平。

2.4 腎組織HE染色 將甲醛固定的小鼠腎組織石蠟包埋后，制備2 μm厚的切片，HE染色，顯微鏡下觀察腎組織病理改變，每張切片隨機選取8個視野觀察腎小管-間質(zhì)病理變化，進(jìn)行腎小管-間質(zhì)病變半定量評分[10]。

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測HO-1、Nrf2表達(dá) 小鼠腎組織石蠟切片，PBS磷酸緩沖鹽溶液沖洗，滴加一抗4 ℃孵育過夜，PBS沖洗后加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗后DAB顯色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，光鏡下觀察，以棕黃色顆粒區(qū)域為陽性表達(dá)，每張切片隨機觀察6個非重疊視野，應(yīng)用病理圖文分析軟件進(jìn)行半定量表達(dá)程度的分析。

2.6 Western blot檢測HO-1、Nrf2蛋白表達(dá) 取適量小鼠腎組織，加入裂解液和蛋白酶、磷酸酶抑制劑，充分研磨裂解，離心取上清，BCA法檢測樣本蛋白濃度。每個樣本取20 μg上樣，10% SDS-PAGE凝膠電泳分離，電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，加入5%脫脂奶粉溶液，在搖床上封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色曝光。

3 結(jié)果

3.1 芪歸益腎方對小鼠腎功能指標(biāo)變化的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清Scr、BUN水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，芪歸益腎方組和硫辛酸組小鼠血清Scr、BUN水平均降低(P<0.05)，見圖1。

注：與對照組比較，▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖1 各組小鼠血清Scr、BUN水平Fig.1 Serum levels of Scr and BUN of mice in each

3.2 芪歸益腎方對小鼠血清氧化應(yīng)激的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠血清SOD活性降低(P<0.05)，MDA水平升高(P<0.05)；與模型組比較，芪歸益腎方組和硫辛酸組小鼠血清SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)；與硫辛酸組比較，芪歸益腎方組小鼠血清SOD活性升高(P<0.05)，MDA水平降低(P<0.05)，見圖2。

注：與假手術(shù)組比較，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與硫辛酸組比較，△P<0.05。圖2 各組小鼠血清SOD活性及MDA水平Fig.2 Serum SOD activity and MDA level of mice in each

3.3 芪歸益腎方對小鼠腎組織病理學(xué)評分的影響 假手術(shù)組小鼠腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰，小管上皮細(xì)胞排列整齊，無明顯炎性細(xì)胞浸潤；模型組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)破壞，上皮細(xì)胞有不同程度的腫脹、變性、壞死，刷狀緣脫落，腎小管擴張，間質(zhì)充血、水腫并伴有炎性細(xì)胞浸潤；與模型組比較，芪歸益腎方組和硫辛酸組小鼠腎組織損傷均減輕(P<0.05)，見圖3～4。

圖3 各組小鼠腎組織病理變化(HE，×200)Fig.3 Renal pathological changes of mice in each group(HE, ×200)

注:與假手術(shù)組比較， ▲P<0.05；與模型組比較，△P<0.05。圖4 各組小鼠腎小管損傷評分Fig.4 Renal tubular injury scores of mice in each group

3.4 芪歸益腎方對小鼠HO-1、Nrf2蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠腎臟組織中HO-1、Nrf2 表達(dá)均降低(P<0.05)；與模型組比較，芪歸益腎方組和硫辛酸組小鼠腎臟組織中HO-1、Nrf2表達(dá)均升高(P<0.05)；與硫辛酸組比較，芪歸益腎方組小鼠腎臟組織中HO-1、Nrf2表達(dá)升高(P<0.05)，見圖5～6。

圖5 各組小鼠腎組織中HO-1、Nrf2表達(dá)(免疫組化，×200)Fig.5 Expressions of HO-1 and Nrf2 in renal tissue of mice in each group(immunohistochemistry, ×200)

4 討論

急性腎損傷是住院患者最常見的并發(fā)癥之一，嚴(yán)重危及患者生命[11]。缺血再灌注是臨床導(dǎo)致急性腎損傷的最主要原因。腎臟缺血時引起腎臟微血管改變和線粒體代謝障礙，導(dǎo)致ROS增加；再灌注則誘導(dǎo)ROS過量產(chǎn)生，ROS的累積進(jìn)一步加重腎損傷，導(dǎo)致氧化應(yīng)激?？寡趸到y(tǒng)的清除能力下降表現(xiàn)抗氧化酶SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)等水平的降低。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的氧化損傷使急性腎損傷進(jìn)一步加重[12-13]。MDA是ROS介導(dǎo)的腎臟過氧化的終產(chǎn)物，因此可以反映氧化應(yīng)激水平，從而反應(yīng)缺血再灌注急性腎損傷腎損傷程度[14-15]。

缺血再灌注引起氧化應(yīng)激后，腎臟細(xì)胞通過氧化還原敏感的線粒體酶促反應(yīng)進(jìn)行自我保護，其中HO-1發(fā)揮重要作用。HO-1可將血紅素催化降解成膽綠素、CO和自由鐵[5-6]。其中膽綠素能有效地清除ROS并抑制過氧化，其還原產(chǎn)物膽紅素可以抑制蛋白激酶C和NADPH氧化酶的活性，從而阻斷氧化應(yīng)激的產(chǎn)生；HO-1源性CO可以使有絲分裂原激活的蛋白激酶恬性增加，加強有絲分裂原激活的蛋白激酶對SOD和GSH-Px的刺激作用；自由鐵誘導(dǎo)生成的鐵蛋白可以與活性鐵結(jié)合，使細(xì)胞從氧化損傷的超敏狀態(tài)轉(zhuǎn)為低敏狀態(tài)，從而免受游離鐵的不良作用[16-17]。Nrf2是激活抗氧反應(yīng)元件(ARE)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過上調(diào)多種細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)來預(yù)防腎功能障礙。研究表明Nrf2可通過調(diào)控HO-1的表達(dá)[18]，促進(jìn)抗氧化分子如SOD、GSH-Px的表達(dá)，同時抑制MDA的水平[19-20]，從而抑制急性腎損傷中氧化應(yīng)激損傷。

注：與對照組比較，★P<0.05；與模型組比較，▲P<0.05；與硫辛酸組比較，△P<0.05。圖6 各組小鼠腎臟組織中Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)Fig.6 Protein expressions of HO-1 and Nrf2 in renal tissue of mice in each

腎缺血再灌注損傷歸屬于中醫(yī)的“關(guān)格”“水腫”范疇，病機為血脈瘀阻，腎元虧虛。芪歸益腎方的設(shè)立原則為“補腎祛濁、活血化瘀”，主要成分包括黃芪、當(dāng)歸、懷牛膝、川芎等。其中黃芪補氣行血、扶正祛邪；當(dāng)歸和川芎補血活血，通絡(luò)化瘀；懷牛膝益腎活血且可引諸藥歸腎經(jīng)，視為佐藥[21]。以上藥物相輔相成，顧元化瘀、通經(jīng)活絡(luò)，共同作用減輕腎缺血再灌注損傷。

本實驗探究了芪歸益腎方對缺血再灌注導(dǎo)致的急性腎損傷的保護作用。結(jié)果表明，芪歸益腎方可顯著改善模型小鼠的腎功能，藥物干預(yù)組腎小管結(jié)構(gòu)損傷減輕，變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等現(xiàn)象減少。與模型組比較，芪歸益腎方組小鼠血清SOD活性和腎組織Nrf2、HO-1表達(dá)均增加，血清MDA水平降低，提示芪歸益腎方對缺血再灌注腎損傷的保護機制是通過激活抗氧化系統(tǒng)，有效清除氧自由基，減少氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，芪歸益腎方對缺血再灌注所致急性腎損傷模型小鼠腎功能有確切的保護作用，其機制與調(diào)控Nrf2/HO-1通路有關(guān)，且療效優(yōu)于硫辛酸。因此，中藥復(fù)方芪歸益腎方的干預(yù)對缺血再灌注引起的急性腎損傷的療效值得進(jìn)一步研究。