參棗滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

胡濤，劉渠，曾霞，梁生旺，王淑美，湯丹，張陸勇

（1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)重點(diǎn)研究室，廣東 廣州 510006；3.廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006；4.廣東藥科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；5.廣東藥科大學(xué)新藥研發(fā)中心，廣東 廣州 510006）

參棗滴丸是本課題組在研的中藥復(fù)方新藥，由廣棗、丹參、人參、降香、蘇合香、冰片六味藥組成，具有理氣止痛、活血化瘀等功效。本品另辟蹊徑，以理氣止痛治標(biāo)、活血化瘀達(dá)血脈通暢為本，標(biāo)本兼治，可久服，不傷正氣，用于氣滯血瘀型胸痹，西醫(yī)病癥為冠心病。方中廣棗和丹參為君藥，其中廣棗具有行氣活血、養(yǎng)心、安神之功，多用于氣滯血瘀、胸痹作痛、心悸氣短、心神不安。從目前臨床上比較推崇的“雙心治療”法來看，廣棗不僅能夠行氣活血，治療生理學(xué)上的心臟病變，也具有養(yǎng)心安神功效，可對(duì)患者術(shù)后的心理進(jìn)行輔助治療，從而達(dá)到雙心治療的效果。

廣棗中富含沒食子酸和有機(jī)酸，文獻(xiàn)報(bào)道沒食子酸可抑制心肌梗死后的心肌纖維化［1］，總有機(jī)酸對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用［2］，且廣棗中總黃酮具有抗心律失常作用、抗結(jié)腸癌細(xì)胞Caco?2增殖、抗氧化、抗炎［3?7］等藥理作用。2020年版《中國(guó)藥典》中將沒食子酸作為含量測(cè)定和薄層鑒別的指標(biāo)成分，因此本文將沒食子酸作為參棗滴丸的含量測(cè)定指標(biāo)，參考《中國(guó)藥典》2020年版一部制定了廣棗［8］45、丹參［8］1311、人參［8］8、蘇合香［8］172、冰片［8］615味藥的薄層鑒別方法和沒食子酸［8］45的含量測(cè)定方法，為參棗滴丸成品的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC?20AT島津高效液相色譜分析儀（日本島津株式會(huì)社）；SQP電子分析天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；ME104電子分析天平［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］；JJ500電子天平（常熟市雙杰測(cè)試儀器廠）；KQ?300DZ超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；Linomat 5?卡瑪薄層半自動(dòng)點(diǎn)樣儀（瑞士CAMAG公司）；默克硅膠G60板（德國(guó)默克有限公司）；青島海洋硅膠G板（青島海洋化工廠分廠）；黃海硅膠GF254板（煙臺(tái)江友硅膠開發(fā)有限公司）。

1.2 試藥

廣棗對(duì)照藥材（批號(hào)：121334?200401）、人參對(duì)照藥材（批號(hào)：120917?201712）、丹參對(duì)照藥材（批號(hào)：120923?201615）、蘇合香對(duì)照藥材（批號(hào)：120931?201804）、龍腦對(duì)照品（批號(hào)：110881?201709，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%）、沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：110831?201906，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.5%）、人參皂苷Rg1（批號(hào)：110703?201933，質(zhì)量分?jǐn)?shù)92.4%）、人參皂苷Re（批號(hào)：110754?202028，質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.4%）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)：110704?201827，質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.2%）、肉桂 酸 對(duì) 照 品（批 號(hào)：110786?201604，質(zhì) 量 分 數(shù)98.8%）、丹參素鈉對(duì)照品（批號(hào)：110855?201915，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97.8%）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；參棗滴丸中試樣品（批號(hào)20201011）、參棗滴丸中試滴丸成品樣品（批號(hào)：20201208、20201209、20201210）、參棗滴丸陰性樣品均為自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 廣棗薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細(xì)，取粉末1 g，5 mL純化水溶解，15 mL乙酸乙酯萃取2次，合并上層溶液，蒸干，甲醇定容至1 mL，即得供試品溶液。取缺廣棗陰性滴丸1 g，同法制成參棗滴丸缺廣棗陰性供試品溶液。取廣棗對(duì)照藥材1 g，加70%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇30 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，5 mL純化水溶解，其余步驟同供試品溶液制備方法，得廣棗對(duì)照藥材溶液。取沒食子酸對(duì)照品適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2020版［8］通則0502試驗(yàn)，吸取上述溶液各2μL，點(diǎn)于默克G60板上，使點(diǎn)樣斑點(diǎn)成條帶狀，置于展開劑（三氯甲烷?丙酮?甲酸，體積比7∶2∶1）中，展開，取出晾干，置雙槽展開缸中，以氨蒸氣為顯色劑，熏至黃色斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，供試品與對(duì)照藥材、對(duì)照品相同高度的位置上，顯相同黃色條帶斑點(diǎn)，缺廣棗陰性樣品無該條帶斑點(diǎn)，結(jié)果見圖1。

圖1 廣棗的薄層鑒別Figure 1 TLCidentification of Choerospondiatis Fructus

2.1.2丹參薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細(xì)，取粉末1 g，加純化水30 mL，超聲30 min，加濃鹽酸2滴，調(diào)pH小于2，20 mL乙酸乙酯萃取2次，合并上層溶液，蒸干，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺丹參陰性樣品1 g，同法制成參棗滴丸缺丹參陰性供試品溶液。取丹參對(duì)照藥材1 g，加純化水30 mL，加熱回流30 min，加濃鹽酸2滴，調(diào)pH小于2，其余步驟同供試品溶液制備方法，得丹參對(duì)照藥材溶液。取丹參素鈉對(duì)照品適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2020版［8］通則0502試驗(yàn)，吸取供試品溶液和陰性溶液5μL、對(duì)照品和對(duì)照藥材溶液2μL，點(diǎn)于青島海洋G板上，使點(diǎn)樣斑點(diǎn)成條帶狀，置于展開劑（三氯甲烷?丙酮?甲酸，體積比25∶10∶4）中，展開，取出，晾干，以氨蒸氣為顯色劑，熏蒸5 min，呈淡黃色條帶，105℃加熱5 min后，取出在紫外光燈（365 nm）下觀察，顯熒光條帶。供試品色譜中，供試品與對(duì)照藥材、對(duì)照品相同高度的位置上，顯相同黃色條帶或天藍(lán)色熒光條帶，缺丹參陰性樣品無該條帶斑點(diǎn)，結(jié)果見圖2。

圖2 丹參的薄層鑒別Figure 2 TLC identification of Salviae miltiorrhizae Radix et Rhizome

2.1.3 蘇合香薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細(xì)，取粉末1 g，加乙醚10 mL，超聲10 min，濾過，濾液揮干，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺蘇合香陰性樣品1 g，同供試品溶液方法制成參棗滴丸缺蘇合香陰性供試品溶液。取蘇合香對(duì)照藥材1 g，與供試品同法制備，得蘇合香對(duì)照藥材溶液。取肉桂酸對(duì)照品適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2020版［8］通則0502試驗(yàn)，吸取上述溶液，各2μL，點(diǎn)于黃海GF254板上，置于展開劑［石油醚（30~60℃）?正己烷?甲酸乙酯?甲酸，體積比10∶30∶15∶1］中，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下觀察。供試品色譜中，供試品與對(duì)照藥材和對(duì)照品相應(yīng)的位置上，顯相同高度的暗斑，缺蘇合香陰性樣品無暗斑，結(jié)果見圖3。

圖3 蘇合香的薄層鑒別Figure 3 TLCidentification of Styrax

2.1.4 人參薄層鑒別[9]取參棗滴丸適量，研細(xì)，取粉末4 g，加純化水20 mL，超聲30 min，乙酸乙酯萃取2次，每次20 mL，棄去上層溶液，水飽和正丁醇提3次，每次20 mL，合并上層溶液，用1%NaOH堿水洗滌2次，每次20 mL，棄去下層，正丁醇飽和水萃取2次，每次20 mL，棄去下層，取上層蒸至1~2滴溶液，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺人參陰性樣品1 g，同法制成參棗滴丸缺人參陰性供試品溶液。取人參對(duì)照藥材1 g，加甲醇30 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹兓?0 mL溶解，用乙酸乙酯萃取2次，其余步驟同供試品制備，得人參對(duì)照藥材溶液。取人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Re對(duì)照品及人參皂苷Rg1對(duì)照品，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為2 mg/mL的混合溶液，作為人參混標(biāo)對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2020版［8］通則0502試驗(yàn)，吸取上述溶液各2μL，點(diǎn)于默克G60板上，使點(diǎn)樣斑點(diǎn)成條帶狀，置于展開劑（三氯甲烷?乙酸乙酯?甲醇?水，體積比15∶40∶22∶10，10℃以下放置的下層溶液）中，展開，取出，晾干，以10%硫酸乙醇溶液為顯色劑顯色，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和紫外光燈（365 nm）下觀察。供試品色譜中，供試品與對(duì)照藥材和對(duì)照品相應(yīng)位置上，顯相同磚紅色斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，缺人參陰性樣品無該斑點(diǎn)，結(jié)果見圖4。

圖4 人參的薄層鑒別Figure 4 TLC identification of Ginseng Radix et Rhizoma

2.1.5 冰片薄層鑒別 取參棗滴丸適量，研細(xì)，取粉末1 g，加乙醚10 mL，超聲10 min，濾過，濾液揮去乙醚，甲醇定容至1 mL，得供試品溶液。取參棗滴丸缺冰片陰性樣品1 g，同法制成參棗滴丸缺冰片陰性供試品溶液。取冰片對(duì)照品龍腦適量，加甲醇，制得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的作為對(duì)照品溶液。照《中國(guó)藥典》2020版[8]通則0502試驗(yàn)，分別吸取上述溶液各2μL，點(diǎn)于青島海洋G板上，置于展開劑（乙酸乙酯?正己烷，體積比3∶7）中，展開，取出，取出，晾干，以1%香草醛硫酸液為顯色劑顯色，于105℃下加熱至各斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，與對(duì)照藥材相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，缺冰片陰性樣品無該斑點(diǎn)，結(jié)果見圖5。

圖5 冰片的薄層鑒別Figure 5 TLCidentification of Borneol

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 采用FeiniGe‐nXPeonyx AQ?C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，柱溫設(shè)為25℃，流動(dòng)相：甲醇?0.3%冰乙酸（體積比1∶99）等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm，流速：1.0 mL/min，進(jìn)樣量：10μL。

在上述色譜條件下，沒食子酸基本上可達(dá)到基線分離，分離度＞1.5。理論塔板數(shù)以沒食子酸峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸14.53 mg，于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液1.0 mL于10 mL量瓶，稀釋10倍，為中間稀釋液。精密吸取中間稀釋液0.5 mL，于10 mL容量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得質(zhì)量濃度為7.265μg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取適量滴丸，研細(xì)，精密稱取l g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液的制備 按參棗滴丸的處方配比和工藝制備缺廣棗陰性對(duì)照樣品，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備廣棗陰性供試品溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10 mL，按“2.2.1”項(xiàng)方法條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖6?？梢姡瑓椀瓮铔]食子酸測(cè)定供試品和沒食子酸對(duì)照品在對(duì)應(yīng)的位置上，可以檢測(cè)相同的色譜峰，光譜吸收行為基本一致；同時(shí)，在參棗滴丸缺廣棗陰性樣品色譜圖與指標(biāo)成分沒食子酸相對(duì)應(yīng)位置上，未檢測(cè)到干擾成分，表明該方法專屬性良好。

圖6 沒食子酸對(duì)照品、參棗滴丸供試品及參棗滴丸廣棗陰性供試品HPLC色譜圖Figure 6 HPLC chromatograms of Gallic acid,Shenzao drip‐ping pills sample,Shenzao dripping pills Choerospondiatis Fructus negativesample

2.2.6 線性關(guān)系考察 精密稱定沒食子酸對(duì)照品10.34 mg，加甲醇定容至10 mL，搖勻，作為沒食子酸母液，精密吸取母液適量，甲醇稀釋定容，配得質(zhì)量濃度為0.437 5、2.068 0、6.204 0、10.340 0、12.408 0μg/mL的系列對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量為10μL，進(jìn)行液相分析得峰面積，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）、對(duì)照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸分析，得回歸方程Y=26 625X-5 813.3，r=0.999 9。結(jié)果表明，沒食子酸質(zhì)量濃度在0.437 5~12.408 0μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)沒食子酸對(duì)照品溶液1份，進(jìn)樣量為10μL，進(jìn)行液相分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定沒食子酸的峰面積，計(jì)算峰面積RSD值。結(jié)果顯示，沒食子酸的峰面積RSD值為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取一份參棗滴丸中試樣品（批號(hào)20201011），按按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算峰面積RSD值。結(jié)果顯示，沒食子酸的峰面積RSD值為0.92%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批參棗滴丸中試樣品（批號(hào)20201011）共6份，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣，記錄其峰面積，分別計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RSD值。結(jié)果顯示，沒食子酸的RSD值為0.76%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批參棗滴丸中試樣品（批號(hào)20201011）共6份，每份精密加等量的對(duì)照品溶液，按照“2.2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣，計(jì)算回收率，結(jié)果如表1。可見，6份供試品中沒食子酸的加樣回收率在95.32%~97.87%之間，RSD值為1.08%，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表1 參棗滴丸中試樣品沒食子酸加樣回收率性試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Recoveries of gallic acid in Shenzao dripping pills pilot finished product(n=6)

2.2.11 樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 3批中試參棗滴丸（批號(hào)20201208、20201209、20201210，規(guī) 格2 g/袋）每批各取2份樣品，按照“2.2.1”項(xiàng)條件進(jìn)樣，并計(jì)算樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果測(cè)得3批樣品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為337.21、360.45、339.27μg/袋，平均值為345.64μg/袋。

3 討論

本研究參考2020年版《中國(guó)藥典》［8］和文獻(xiàn)[9?10]，采用TLC法對(duì)參棗滴丸中五味藥材進(jìn)行定性鑒別。對(duì)廣棗和丹參的薄層色譜研究過程中，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)樣形狀呈點(diǎn)狀的分離效果較差，而成條帶狀的分離效果較好；丹參的定性鑒別參考《中國(guó)藥典》中復(fù)方丹參滴丸的薄層鑒別方法，并進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)丹參素鈉與氨氣反應(yīng)后的黃色斑點(diǎn)，經(jīng)105℃烘烤5 min后在紫外365 nm下熒光效果最強(qiáng)，因而確定該顯色條件。在蘇合香薄層色譜中，陰性樣品在紫外254 nm照射下未見暗斑，因樣品乙醚提取后，僅蘇合香中成分在紫外254 nm產(chǎn)生暗斑。在人參薄層鑒別中，萃取步驟較多，人參皂苷易在提取過程中損失，需對(duì)溶液進(jìn)行充分振搖、靜置過夜或離心分離，以達(dá)到更好的提取效果。本研究前期對(duì)薄層展開溫度和不同廠家薄層板進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)人參在4℃條件下薄層展開效果最好；煙臺(tái)黃海GF254板相比于默克G60和青島海洋硅膠G板，能夠更好地對(duì)肉桂酸干擾斑點(diǎn)進(jìn)行分離，無需控溫。

采用HPLC法對(duì)沒食子酸進(jìn)行測(cè)定，通過查閱2020年版《中國(guó)藥典》[8]和文獻(xiàn)[11?13]，比較了4種沒食子酸含量測(cè)定的前處理方法，考察不同濃度甲醇、不同提取方式、不同提取時(shí)間對(duì)沒食子酸的含量影響，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于超聲提取、加熱回流0.5 h和50%甲醇提取，70%甲醇加熱回流提取1 h的前處理方法沒食子酸含量最高。最終采用70%甲醇加熱回流1 h為本品的前處理方法。

通過查閱2020年版《中國(guó)藥典》和文獻(xiàn)[14?15]，對(duì)降香進(jìn)行了多次薄層展開試驗(yàn)，但均未顯現(xiàn)特異性斑點(diǎn)，未能完成參棗滴丸中降香的薄層鑒別，后期考慮采用HPLC法對(duì)其質(zhì)量控制進(jìn)行研究，以完善參棗滴丸的質(zhì)量控制體系。本研究作為初步的參棗滴丸質(zhì)量控制研究，將君藥廣棗作為滴丸質(zhì)量控制的一個(gè)重點(diǎn)，為臨床前研究的滴丸質(zhì)量控制提供依據(jù)，在后續(xù)研究中，將繼續(xù)對(duì)滴丸中人參、丹參等貴重藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，在滿足藥物療效的同時(shí)，對(duì)企業(yè)的質(zhì)量控制成本進(jìn)行合理分析，以此確定最終的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

本文通過對(duì)參棗滴丸的君藥廣棗進(jìn)行定性和定量鑒別，并制定了參棗滴丸中丹參、人參、冰片和蘇合香薄層鑒別方法，質(zhì)量可控，分離度較好，重現(xiàn)性高，可以作為參棗滴丸的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，為參棗滴丸的制劑提供了質(zhì)量控制依據(jù)，為臨床用藥的有效性和合理性提供了質(zhì)量保障。