流動(dòng)相對(duì)液相色譜法測(cè)量乳制品中三聚氰胺影響的探究

陳茂姣，鄧燕琴，何娓娓，蘭 寧，張紅梅

四川新希望乳業(yè)有限公司洪雅陽平分公司，四川眉山 620360

0 引言

高效液相色譜法因其具有測(cè)量精度高、穩(wěn)定性好、測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在定量檢測(cè)中。但檢測(cè)結(jié)果也受到很多因素的影響[1]，比如儀器的各項(xiàng)參數(shù)設(shè)置、色譜柱的種類和長短、色譜柱的填充物和孔徑、流動(dòng)相的比例等。其中流動(dòng)相的比例對(duì)目標(biāo)物的出峰時(shí)間、峰型的良好與否有很大的關(guān)系。不適宜的流動(dòng)相有可能造成雙峰、拖尾峰、峰展寬、保留時(shí)間不斷變動(dòng)、靈敏度不高的問題，檢測(cè)出的結(jié)果也不可靠，可能會(huì)導(dǎo)致假陽性或假陰性。合適的流動(dòng)相比例可以使目標(biāo)物的峰型左右對(duì)稱，與雜峰分離良好，獲得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。本文通過液相色譜儀檢測(cè)三聚氰胺的含量[2]，研究不同流動(dòng)相比例對(duì)三聚氰胺檢測(cè)結(jié)果的影響，從而找出方法中最適宜檢測(cè)三聚氰胺的流動(dòng)相比例。

1 試驗(yàn)流程

本文使用方法為《GB/T 22388—2008 原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中的第一法高效液相色譜法。待測(cè)樣品經(jīng)過三氯乙酸和乙腈的提取后[3]，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化，氮吹后用流動(dòng)相定容，經(jīng)有機(jī)濾頭過濾后，用高效液相色譜測(cè)定，外標(biāo)法定量。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試驗(yàn)試劑與材料

甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），默克化工技術(shù)（上海）有限公司；三氯乙酸（優(yōu)級(jí)純）、氨水（分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；檸檬酸（分析純），福晨（天津）化學(xué)試劑有限公司；辛烷磺酸鈉（優(yōu)級(jí)純），成都市科隆化學(xué)品有限公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.5%），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

配制離子對(duì)試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉，加入約980 mL水溶解，調(diào)節(jié)pH至3.0后，定容至1 L備用。

2.2 試驗(yàn)儀器

高效液相色譜儀[LC-1260（VWD）]，安捷倫科技（中國）有限公司；渦旋振蕩器，上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司；調(diào)速多用振蕩器，常州市凱航儀器有限公司；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；分析天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、5.0 mL濃度為100 mg/L的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相分別定容至刻度線，混勻備用，得到0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用流動(dòng)相進(jìn)行定容的，測(cè)試不同流動(dòng)相比例需要重新配制相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 儀器參數(shù)

2.4.1 色譜柱

C18柱，4.6×250 mm，5μm，安捷倫科技（中國）有限公司。

2.4.2 參數(shù)設(shè)置

進(jìn)樣量：20μL；波長：240nm；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min。

2.4.3 流動(dòng)相

離子對(duì)試劑緩沖液和乙腈按照不同比例混勻。

2.5 具體步驟

稱取2 g（精確至000.1 g）試樣于50 mL離心管中，加入15 mL 2%三氯乙酸溶液和5 mL乙腈，超聲10 min，取出后震蕩10 min，最后6000 r/min離心10 min，離心后的上清液經(jīng)定性濾紙過濾至25 mL比色管中，用2%三氯乙酸溶液定容至25 mL。取5 mL濾液與5 mL超純水混勻，經(jīng)固相萃取柱凈化后，用5%的氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，在50 ℃水浴下用氮吹儀吹至近干，最后用1 mL流動(dòng)相定容，用0.22 μm有機(jī)濾頭過濾后上機(jī)測(cè)定。

每次上機(jī)檢測(cè)需要測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線（當(dāng)前流動(dòng)相比例定容）、標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)連續(xù)測(cè)3 次、陰性本底、陰性本底加標(biāo)，并做三次平行。觀察標(biāo)準(zhǔn)曲線的出峰時(shí)間、本底加標(biāo)的回收率、標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的峰型與峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 流動(dòng)相比例為85:15的檢測(cè)結(jié)果

離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為85:15時(shí)，出峰時(shí)間為9 min左右，回收率為91.9%~92.0%，但分離度不好，與雜峰有粘連，如表1和圖1所示。

表1 流動(dòng)相比例為85:15的檢測(cè)結(jié)果

圖1 流動(dòng)相比例為85:15的峰型

3.2 流動(dòng)相比例為88:12時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為88:12時(shí)，出峰時(shí)間為12.9 min左右，回收率為79.9%~84.8%，回收率差，且峰型有輕微拖尾，如表2和圖2所示。

表2 流動(dòng)相比例為88:12的檢測(cè)結(jié)果

圖2 流動(dòng)相比例為88:12的峰型

3.3 流動(dòng)相比例為90:10時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為90:10時(shí)，出峰時(shí)間為17.3 min左右，回收率為92.1%~96.2%，分離度較好，峰型左右對(duì)稱，如表3和圖3所示。

表3 流動(dòng)相比例為90:10的檢測(cè)結(jié)果

圖3 流動(dòng)相比例為90:10的峰型

3.4 流動(dòng)相比例為92:8時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為92:8時(shí)，出峰時(shí)間為24.5 min左右，回收率為82.5%~86.2%，但分離度不好，雜峰較多，如表4和圖4所示。

表4 流動(dòng)相比例為92:8的檢測(cè)結(jié)果

圖4 流動(dòng)相比例為92:8的峰型

3.5 流動(dòng)相比例為95:5時(shí)的檢測(cè)結(jié)果

離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例為95:5時(shí)，出峰時(shí)間為40.7 min左右，出峰時(shí)間太長，回收率為89.3%~109.9%，回收率不穩(wěn)定，與雜峰分離度不好，峰拖尾，如表5和圖5所示。

表5 流動(dòng)相比例為95:5的檢測(cè)結(jié)果

圖5 流動(dòng)相比例為95:5的峰型

4 結(jié)論

流動(dòng)相中離子對(duì)試劑緩沖液與乙腈的比例對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果起著至關(guān)重要的作用。乙腈含量高時(shí)，目標(biāo)峰出峰時(shí)間相對(duì)短一些，能提高檢測(cè)速度，乙腈含量低時(shí)，目標(biāo)峰出峰時(shí)間相對(duì)長一些，檢測(cè)時(shí)間較長。選擇流動(dòng)相比例時(shí)要綜合考慮目標(biāo)峰保留時(shí)間的長短，與雜峰和溶劑峰的分離度，峰型，是否拖尾，目標(biāo)物的回收率等情況[3]。流動(dòng)相比例為92:8與95:5時(shí)，目標(biāo)峰出峰時(shí)間較遲，會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)速度過慢。比例為92:8時(shí)雜峰較多，與溶劑峰分離度不好，回收率為82.5%~86.2%。流動(dòng)性比例90:10時(shí)保留時(shí)間為17.3 min左右，保留時(shí)間合適，且回收率較好，分離度好，峰型左右對(duì)稱，為最佳比例。