自噬在肺動脈高壓疾病中的作用及研究進展

張寧寧，陳永鋒，康品方，王洪巨

肺動脈高壓(pulmonary hypertension，PH)是指肺動脈壓力升高超過一定界值(海平面靜息狀態(tài)下，右心導(dǎo)管測量肺動脈平均壓力mPAP≥25 mmHg)的一種血流動力學(xué)和病理生理狀態(tài)，可導(dǎo)致右心衰竭甚至死亡，臨床病死率高、預(yù)后差。第六屆世界肺動高壓會議[1]更新了PH的定義，將毛細血管前肺動脈高壓定義為mPAP>20 mmHg，肺動脈楔壓(PAWP)<15 mmHg，肺血管重構(gòu)(PVR)>3WU，為臨床早期治療PH提供重要依據(jù)。與此同時，該會議在保留原有診斷分類的基礎(chǔ)上對疾病分類進行了簡化，依據(jù)不同病因?qū)H分為五大類：(1)動脈性肺動脈高壓(PAH)，包括遺傳性、特發(fā)性、藥物/毒物所致肺動脈高壓等；(2)左心疾病所致肺高血壓；(3)慢性肺部疾病/缺氧所致肺高血壓，包括慢性阻塞性/限制性肺疾病、缺氧所致肺動脈高壓等；(4)肺動脈阻塞所致肺高血壓，包括慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(CTEPH)、其他肺動脈阻塞性病變所致肺動脈高壓；(5)未知因素所致肺高血壓，包括溶血性/系統(tǒng)性疾病所致肺動脈高壓等。盡管肺動脈高壓分類不同，但是共有的特征性病變是肺血管重構(gòu)(PVR)，而肺血管內(nèi)皮細胞(PAEC)功能障礙和肺動脈平滑肌細胞(PASMC)異常增殖對PVR發(fā)揮重要作用[2]。

自噬是一種細胞內(nèi)分解代謝和再循環(huán)的過程，通過溶酶體降解錯誤折疊的蛋白質(zhì)、受損的細胞器和病原體，并重新回收這些胞內(nèi)容物，是一種促細胞生存機制?；A(chǔ)水平的自噬有助于維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，而過度激活自噬則導(dǎo)致自噬性細胞死亡引發(fā)疾病[3]。過去關(guān)于自噬在肺部疾病中的研究主要在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺氣腫、特發(fā)性肺纖維化、支氣管擴張癥，而對于肺動脈高壓的研究相對缺乏。近幾年，研究[4-5]發(fā)現(xiàn)自噬在PH疾病方面的作用突出，自噬通過調(diào)節(jié)PAEC和PASMC的增殖、凋亡、炎性因子分泌等途徑，影響PH的病理過程，自噬蛋白在這一過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。本文主要查閱最近5年文獻，對主要的自噬蛋白在PH中的作用作一綜述。

1 自噬蛋白

1.1 骨形成蛋白II型受體(BMPR2) BMPR2是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)受體超家族成員骨形成蛋白(BMP)的受體蛋白，對促進胚胎發(fā)生及發(fā)育、維持成人組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定至關(guān)重要。此外，BMPR2對于維持肺動脈內(nèi)皮細胞的屏障功能也起重要作用，BMPR2缺乏會增加內(nèi)皮炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肺血管重塑，促進肺動脈高壓發(fā)生[6]。由于BMPR2基因突變與PH之間存在強烈相關(guān)性，現(xiàn)已被確定是遺傳性肺動脈高壓的主要原因[7]，流行病學(xué)研究[8]表明超過70%的家族性肺動脈高壓患者和20%特發(fā)性肺動脈高壓患者中發(fā)生BMPR2基因突變，BMPR2蛋白表達減少促進PH發(fā)生。一項關(guān)于PH患者BMPR2突變與生存率的meta分析[9]顯示，BMPR2突變的患者可以發(fā)展為更嚴重的疾病，生存率下降。當(dāng)BMPR2基因發(fā)生突變，BMPR2蛋白在細胞中表達減少，使受體下游功能喪失、信號傳導(dǎo)減少，引起異常信號通路活動，導(dǎo)致內(nèi)皮細胞過度生長和增殖，而上調(diào)BMPR2蛋白表達則能夠改善PH，一項研究[10]對野生型和BMPR2雜合子缺失的小鼠進行骨髓移植，16周后以脂多糖刺激小鼠發(fā)生PH，野生型小鼠在接受BMPR2雜合子缺失小鼠的骨髓后，發(fā)生了肺動脈高壓，而BMPR2雜合子缺失小鼠接受野生型小鼠的骨髓后則未發(fā)生肺動脈高壓，表明骨髓移植能夠改變BMPR2突變小鼠對PH的易感性，造血干細胞移植BMPR2可能是遺傳性肺動脈高壓的潛在治療策略。Gomez-Puerto等研究[11]進一步發(fā)現(xiàn)BMPR2蛋白在PH患者中表達減少，使用自噬抑制劑后BMPR2表達升高，證明BMPR2通過自噬途徑降解并導(dǎo)致PH，突出了自噬在PH中的關(guān)鍵作用。

1.2 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3β(LC3B) 微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)，是在雙膜自噬體上表達的自噬蛋白。包括LC3A、LC3B、LC3C三個亞型，參與形成自噬小體。通常情況下，LC3B以LC3B-I的形式存在于細胞質(zhì)中，可通過自身C-末端的蛋白水解酶裂解，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3B-II，組裝在自噬體膜上，促進自噬體成熟。因此，LC3B-II是自噬激活的標志[12]。Lee等[13]在前人研究基礎(chǔ)上首次證明在PH患者中發(fā)生自噬增強，LC3B是PH防御機制中的關(guān)鍵自噬蛋白，LC3B-II在PH重癥患者的肺組織中表達上調(diào)，其機制通過減弱PASMC的增殖，產(chǎn)生對缺氧的適應(yīng)，延緩了PH的疾病進展。實驗以LC3B特異性siRNA轉(zhuǎn)染PAEC和PASMC，使LC3B蛋白在這兩種細胞中表達減少，在缺氧條件下，轉(zhuǎn)染組的PAEC和PASMC增殖較非轉(zhuǎn)染組明顯。相反，過表達LC3B蛋白可減弱PAEC和PASMC增殖，表明LC3B在PH疾病進展過程中具有抗細胞增殖效應(yīng)，從而發(fā)揮保護作用。Ye等[14]也證實了LC3B對PH的關(guān)鍵作用，在缺氧性肺動脈高壓(HPH)大鼠的PASMC中加入胡椒堿后，LC3B-II/LC3B-I比值顯著增加，PASMC增殖減弱，而加入氯喹后抑制PASMC自噬，PASMC增殖明顯，LC3B-II/LC3B-I比值降低，他們認為胡椒堿能有效抑制PASMC增殖、降低肺動脈收縮壓、降低右室肥厚、改善血管重構(gòu)，是通過上調(diào)LC3B表達和增強自噬發(fā)揮治療作用，提示上調(diào)LC3B的表達或許是治療PH的一種可行方法。

1.3 選擇性自噬接頭蛋白1(SQSTM1/P62) 選擇性自噬接頭蛋白1(SQSTM1)也稱P62，其分子量為62kDa，是一種多功能泛素化結(jié)合的接頭蛋白，參與生物體內(nèi)兩種蛋白質(zhì)降解途徑，即自噬-溶酶體途徑和泛素-蛋白酶體途徑，二者相互作用，在正常情況下和應(yīng)激期間對細胞存活起著關(guān)鍵作用[15]。P62是一種典型的自噬受體和多功能蛋白，位于整個細胞內(nèi)，充當(dāng)橋梁連接兩種蛋白質(zhì)降解途徑，當(dāng)?shù)鞍酌阁w被抑制，產(chǎn)生蛋白毒性通過磷酸化P62激活自噬；當(dāng)自噬活性下降，P62不能將受損蛋白質(zhì)靶向至自噬溶酶體而積累，蛋白酶體底物向蛋白酶體傳遞延遲，損害泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，使細胞清除能力受損[16-17]，因此，P62蛋白的表達水平與自噬水平呈負相關(guān),P62蛋白表達下調(diào)表明自噬-溶酶體途徑暢通。Mao等[18]利用缺氧構(gòu)建大鼠PH模型，結(jié)果顯示低氧后在肺動脈中P62蛋白表達顯著下調(diào)，在PH大鼠肺組織中自噬水平增加而P62蛋白顯著降低。另有文獻[31]報道激活自噬使P62蛋白表達升高，因此，P62參與PH中的自噬有一定的研究價值，是可能的治療靶點。

1.4 自噬關(guān)鍵分子酵母Atg6同系物(Beclin-1) Beclin-1基因，是酵母自噬相關(guān)基因Atg6的同源基因，其蛋白分子量約60kDa，含有BH3蛋白結(jié)構(gòu)域，BH3蛋白屬于抗凋亡因子Bcl2家族，可以介導(dǎo)Beclin-1與抗凋亡蛋白Bcl2/Bclxl相互作用，形成抑制自噬過程的復(fù)合體。只要Beclin1和Bcl2/Bclxl相互結(jié)合，就不能啟動自噬過程。在饑餓、BH3結(jié)構(gòu)域突變等條件下，Beclin 1-Bcl2/Bclxl復(fù)合體被解離，在解離后，Beclin 1參與形成自噬小體，招募各種自噬蛋白進入自噬前小體[19-20]。Teng等[21]使用3-甲基腺嘌呤和氯喹分別處理胎羊持續(xù)性PH的PAEC，結(jié)果表明抑制自噬后，PAEC凋亡減少、增殖明顯，血管生成增加，而Beclin-1敲低則改善PAEC血管生成，提示Beclin-1通過增強自噬促進PH發(fā)生。而在另一個野百合堿(MCT)誘導(dǎo)的PH模型中，F(xiàn)eng等[22]觀察到MCT組Beclin-1表達增加，LC3BII/LC3BI比值增加，右室收縮壓升高和肺動脈管壁增厚，而MCT+紫杉醇干預(yù)組Beclin-1表達減少，LC3BII/LC3BI比值降低，右室收縮壓降低和肺動脈管壁厚度降低，表明抑制Beclin-1表達，抑制自噬可以有效改善肺血管重塑。Ibrahim等[23]的報道也得出一致結(jié)論，關(guān)于抗腫瘤藥物多西他賽能逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)、改善右心室纖維化，其機制是通過促進Beclin-1降解、抑制自噬起治療PH作用。

1.5 一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK) 一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一種在哺乳動物中廣泛表達的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復(fù)合物，對調(diào)節(jié)生物代謝和維持能量平衡起重要作用，自噬作為細胞的一種自我保護機制，也受到AMPK調(diào)控。AMPK分別通過正向調(diào)節(jié)自噬復(fù)合物(ULK1)、負向調(diào)控雷帕霉素靶蛋白(mTOR)誘導(dǎo)自噬過程[24]。AMPK激活自噬與自身亞基類型相關(guān)，它是由一個催化亞基(α1、α2)兩個調(diào)節(jié)亞基β、γ組成，在PH中的作用主要與α1、α2亞型有關(guān)，AMPKα2缺失可加劇形成PH。Wang等[25]發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，AMPKα2基因敲除組小鼠右室收縮壓升高、右心室肥厚明顯，肺血管壁厚度增加、右心室/左心室+室間隔比值增加。此外，AMPKα2在抑制PASMC增殖中也發(fā)揮關(guān)鍵作用，AMPKα2特異性SiRNA轉(zhuǎn)染PASMC后，轉(zhuǎn)染組磷酸化mTOR表達增加、PASMC增殖明顯，加入雷帕霉素后抑制mTOR表達，PASMC增殖減弱，證明敲除AMPKα2后喪失了對自噬的直接激活作用，并且間接解除對mTOR的抑制，導(dǎo)致自噬作用減弱、PASMC增殖不受控制。杜阿胖等[26]探索了二甲雙胍治療MCT誘導(dǎo)PH的機制，結(jié)果顯示MCT-PH組大鼠肺動脈管腔狹窄和管壁增厚、自噬標志物L(fēng)C3II/LC3I比值增加和Beclin1蛋白表達增加、肺組織P-AMPK/AMPK比值增加，經(jīng)二甲雙胍治療后PASMC增生明顯減少、肺動脈管壁變薄、管腔大小接近正常、上述自噬標志物表達明顯增加，證實二甲雙胍活化AMPK抑制MCT-PH的機制是促進PASMC自噬、抑制PAMSC增殖，改善肺血管重塑。這些結(jié)果提示增強AMPK表達、提高自噬活性可能是預(yù)防和治療PH的新策略，也有相關(guān)文獻[27]報道抑制AMPK活性能保護PH，AMPK在PH的作用存在一定爭議。

1.6 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) mTOR作為多種信號通路的下游信號蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可正性調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、存活，在營養(yǎng)充足條件下，磷酸化的mTOR與ULK1在ser757位點結(jié)合，抑制ULK1-AMPK的相互作用，導(dǎo)致ULK1失活，最終抑制自噬[28]。研究[29]表明mTOR參與PASMC和PAEC的增殖、遷移、表型轉(zhuǎn)換，引起肺血管重塑和持續(xù)性血管收縮，最終導(dǎo)致PH的發(fā)生，抑制mTOR對PH發(fā)揮保護作用。在另一HPH大鼠模型中，條件性誘導(dǎo)和敲除mTOR，結(jié)果顯示mTOR表達水平顯著降低，右室收縮壓下降、右室肥厚程度降低，肺動脈壁管腔狹窄程度減小，肺血管重塑得到改善[30]。在另一項研究[31]以MCT誘導(dǎo)大鼠肺動脈高壓，結(jié)果顯示MCT干預(yù)2周組和4周組的右室肥厚程度增加，右室中磷酸化的mTOR蛋白表達水平顯著下調(diào)，自噬標記物L(fēng)C3-II/LC3-I比值顯著增加，表明抑制mTOR蛋白表達、激活自噬可能是預(yù)防右室心肌肥大和功能障礙的重要靶點。

1.7 自噬相關(guān)蛋白(ATG7) ATG7在自噬中負責(zé)調(diào)節(jié)自噬小體組裝，介導(dǎo)LC3酯化磷脂酰乙醇胺并與自噬相關(guān)蛋白ATG5/12結(jié)合，是自噬小泡延伸的關(guān)鍵蛋白,研究[32]表明ATG7促進自噬，對PH起防御和保護作用。Yang等[33]以HPH小鼠為模型，實驗組敲除ATG7基因，小鼠超聲顯示敲除組小鼠較非敲除組更易發(fā)生PH和心功能不全，表明ATG7通過改善血管重構(gòu)阻止PH，以ATG7特異性SiRNA轉(zhuǎn)染PASMC后通過PP2A/4EBP-1/ELF-4E信號通路提高細胞內(nèi)鈣離子濃度，誘導(dǎo)PASMC從收縮表型向分泌型轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致PASMC增殖，過表達ATG7蛋白則減弱PASMC的增殖，表明ATG7蛋白表達減少造成的自噬活性下降促進血管重構(gòu)并導(dǎo)致PH，ATG7具有保護和防御PH的作用。

此外，有文獻[34]報道自噬蛋白ATG5可用來評估宮頸癌病情，其他文獻[35]報道ATG9介導(dǎo)心肌細胞自噬從而改善心肌缺血，但在肺動脈高壓方面尚缺乏研究，未來或能在更多的自噬蛋白相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)其對肺動脈高壓的作用，本綜述不作一一敘述。

2 展望

當(dāng)前研究自噬相關(guān)蛋白在PH中的作用主要有兩種方法：一，通過基因敲除辦法或干擾RNA技術(shù)，觀察目的蛋白表達下調(diào)后是否調(diào)節(jié)了自噬從而改善或促進PH的發(fā)展；二，使用目的蛋白調(diào)節(jié)劑激活或抑制其表達水平，通過增強或減弱自噬來研究其對PH的作用。自噬蛋白的表達對PH的研究帶來便利，然而因蛋白種類眾多，本文不能對每一種自噬相關(guān)蛋白進行概述，是不足之處。此外，雖然動物模型在一定程度上促進了自噬在PH中的研究，但是不能完全代表人體PH的組織學(xué)變化，由動物研究到臨床應(yīng)用仍是一個漫長、充滿挑戰(zhàn)的過程。