采用體外染色體畸變試驗(yàn)檢測銳鈦型納米二氧化鈦的遺傳毒性

杜秀明，洪麗玲，徐靈芝，周慶云，*

(1．上?；ぱ芯吭河邢薰荆虾?200062；2．上?；ぴ簷z測有限公司，上海 200062)

納米二氧化鈦亦稱鈦白粉，直徑通常在100 nm以下，主要有兩種結(jié)晶形態(tài)：銳鈦型(anatase)和金紅石型(rutile)。金紅石型二氧化鈦具有較高的硬度、密度、介電常數(shù)及折射率，其遮蓋力和著色力也較高。銳鈦型二氧化鈦在可見光短波部分的反射率較高，并且對(duì)紫外線的吸收能力比金紅石型低。在一定條件下，銳鈦型二氧化鈦可轉(zhuǎn)化為金紅石型二氧化鈦。因其具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)而被廣泛用于各種領(lǐng)域，包括油漆、化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品等，但其安全性一直是討論的焦點(diǎn)[1]。在Ames試驗(yàn)、彗星試驗(yàn)、微核試驗(yàn)、染色體畸變試驗(yàn)和基因突變試驗(yàn)等系列遺傳毒性試驗(yàn)中，它們的遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果各不相同[2-3]，體外和體內(nèi)試驗(yàn)均有陽性和陰性結(jié)果的報(bào)道[4-5]。

一項(xiàng)體內(nèi)研究表明，納米二氧化鈦在彗星試驗(yàn)和微核試驗(yàn)中可以誘導(dǎo)細(xì)胞微核的產(chǎn)生，并引起體細(xì)胞DNA缺失[6]；而另一項(xiàng)體內(nèi)研究卻給出了陰性結(jié)果，原因可能是后者采用吸入染毒方式，導(dǎo)致內(nèi)暴露濃度比前者低很多[7]。Shukla和Petkovic等[8-9]的體外研究表明，納米二氧化鈦可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的細(xì)胞微核率升高，并引起體外培養(yǎng)細(xì)胞的DNA損傷。Guichard等[10]的體外研究則表明納米二氧化鈦不能引起敘利亞金倉鼠胚胎細(xì)胞微核率的升高。Wang等[11]的研究表明，在體外彗星試驗(yàn)和Hprt基因突變試驗(yàn)中，納米二氧化鈦未引起體外培養(yǎng)細(xì)胞的DNA損傷。

根據(jù)《OECD化學(xué)品測試準(zhǔn)則473：體外哺乳動(dòng)物染色體畸變測試》，采用中國倉鼠肺(Chinese hamster lung，CHL)細(xì)胞進(jìn)行體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)是常用的生物測試體系之一，也是遺傳毒性組合策略試驗(yàn)之一[12]。該試驗(yàn)可以確定和評(píng)價(jià)化學(xué)品引起體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變的能力，從而判斷受試物是否屬于致突變物。染色體結(jié)構(gòu)畸變可分為兩種類型：一種是染色體類型畸變，表現(xiàn)為同一位點(diǎn)的兩條染色單體的斷裂或斷裂重組；另一種是染色單體類型畸變，表現(xiàn)為染色單體的斷裂或斷裂重組。

我們前期的研究表明，銳鈦型納米二氧化鈦未引起小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變頻率的升高，在基因突變試驗(yàn)中呈陰性結(jié)果[13]。此外，尚未見銳鈦型納米二氧化鈦(40 nm)能否引起中國倉鼠肺細(xì)胞染色體畸變的相關(guān)報(bào)道。為了進(jìn)一步驗(yàn)證銳鈦型納米二氧化鈦的安全性，本研究通過體外染色體畸變試驗(yàn)來檢測銳鈦型納米二氧化鈦誘發(fā)遺傳毒性的可能性，為納米二氧化鈦在化妝品及食品領(lǐng)域的安全使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

銳鈦型納米二氧化鈦購買于上海麥克林生物化學(xué)有限公司；ZEISS Merlin掃描電子顯微鏡用于表征納米二氧化鈦的顆粒；秋水仙堿、絲裂霉素C和環(huán)磷酰胺均購自Sigma公司；NADP-Na2和G-6-P-Na2購自北京陽光生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

中國倉鼠肺細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫。采用RPMI-1640培養(yǎng)液，細(xì)胞培養(yǎng)于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中。

1.3 受試物濃度的選擇

銳鈦型納米二氧化鈦不溶于去離子水、二甲亞砜或其他溶劑，因此選擇RPMI-1640(不含胎牛血清)作為制備混懸液的溶劑。將5個(gè)濃度(0.007 8、0.031 2、0.125、0.5和2 mg/mL)的銳鈦型納米二氧化鈦混懸液超聲處理10 min，然后用于測試細(xì)胞毒性。染毒24 h后根據(jù)各組細(xì)胞濃度計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率(relative increase in cell counts，RICC)，確定體外染色體畸變試驗(yàn)的染毒濃度。

細(xì)胞相對(duì)增殖率=(處理組收獲時(shí)的細(xì)胞總數(shù)-接種時(shí)細(xì)胞總數(shù))/(溶劑對(duì)照組收獲時(shí)的細(xì)胞總數(shù)-接種時(shí)細(xì)胞總數(shù))×100%

細(xì)胞抑制率=1-細(xì)胞相對(duì)增殖率

1.4 染毒處理

將細(xì)胞懸液分別加入新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，每瓶CHL細(xì)胞數(shù)約為10×105個(gè)，再分別加入不同濃度(0.007 8、0.031 2、0.125、0.5和2 mg/mL)的銳鈦型納米二氧化鈦混懸液或陽性參照物(絲裂霉素C或環(huán)磷酰胺)及0.5 mL的S9混合液(不加S9時(shí)，用培養(yǎng)基補(bǔ)足)，補(bǔ)加完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的培養(yǎng)液)至10 mL。

試驗(yàn)分為有代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組(+S9，4 h)、無代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組(-S9，4 h)和無代謝活化系統(tǒng)連續(xù)處理組(-S9，24 h)3種處理方式，每種處理方式均設(shè)溶劑對(duì)照組和陽性對(duì)照組，溶劑對(duì)照組加同體積的樣品溶劑(RPMI-1640)，陽性對(duì)照組加同體積的陽性物，所有組別均設(shè)2個(gè)平行。

1.5 染色體制備和鏡檢

收獲細(xì)胞前，加入適量秋水仙素，培養(yǎng)大約3 h。然后棄上清液，用少量滅菌生理鹽水洗滌2次，再用胰酶消化，離心，棄上清。細(xì)胞經(jīng)低滲、預(yù)固定、固定后，每組制片2張。玻片經(jīng)染色、封片后，進(jìn)行鏡檢。每個(gè)濃度組觀察300個(gè)背景清晰、分散良好、染色體收縮適中的中期分裂相細(xì)胞，鏡檢結(jié)束后進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總并統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用卡方檢驗(yàn)對(duì)各組染色體畸變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示組間比較的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納米二氧化鈦的粒徑和細(xì)胞毒性

ZEISS Merlin掃描電子顯微鏡下銳鈦型納米二氧化鈦的粒徑約40 nm，如圖1所示。

圖1 銳鈦型納米二氧化鈦粒徑由ZEISS Merlin掃描電子顯微鏡表征

預(yù)試驗(yàn)確定銳鈦型納米二氧化鈦在濃度為2 mg/mL時(shí)對(duì)CHL細(xì)胞的細(xì)胞毒性小于50%。依據(jù)OECD指導(dǎo)原則473，選擇2 mg/mL作為最高測試濃度[14]。

細(xì)胞相對(duì)增殖率用于評(píng)估銳鈦型納米二氧化鈦的細(xì)胞毒性，CHL細(xì)胞相對(duì)增殖率隨銳鈦型納米二氧化鈦濃度的升高而降低。銳鈦型納米二氧化鈦在最高濃度為2 mg/mL時(shí)，(-S9，4 h)、(+S9，4 h)和(-S9，24 h)3種處理方式下的細(xì)胞相對(duì)增殖率分別為70.32%、72.33%和64.80%，具體見表1。所有染毒濃度組的細(xì)胞相對(duì)增殖率均超過50%，表明各組細(xì)胞抑制率低于50%。依據(jù)OECD指導(dǎo)原則473，試驗(yàn)選用的濃度適用于本研究。

表1 銳鈦型納米二氧化鈦的細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果

2.2 納米二氧化鈦的遺傳毒性

各濃度組染色體畸變頻率見表2。

表2 銳鈦型納米二氧化鈦的染色體畸變試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)樣品在0.007 8、0.031 2、0.125、0.5和2 mg/mL濃度下，無代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組(-S9，4 h)不含裂隙的染色體畸變率分別為1.67%、1.33%、2.00%、1.00%和2.33%，有代謝活化系統(tǒng)短時(shí)處理組(+S9，4 h)不含裂隙的染色體畸變率分別為1.33%、1.33%、2.00%、1.67%和2.00%，無代謝活化系統(tǒng)連續(xù)處理組(-S9，24 h)不含裂隙的染色體畸變率分別為1.33%、1.67%、2.00%、1.67%和2.33%，與溶劑對(duì)照組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。陽性對(duì)照組(-S9，4 h)、(+S9，4 h)和(-S9，24 h)3種處理方式下觀察到不含裂隙的染色體畸變率分別為25.33%、26.67%及29.33%，與溶劑對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。油鏡下觀察的中期分裂相染色體形態(tài)如圖2。

圖2 油鏡下觀察的中期分裂相染色體形態(tài)

3 討論

在有和無代謝活化系統(tǒng)處理?xiàng)l件下，各染毒濃度組銳鈦型納米二氧化鈦在體外染色體畸變試驗(yàn)中均為陰性結(jié)果，表明銳鈦型納米二氧化鈦在本測試濃度范圍內(nèi)，對(duì)CHL細(xì)胞染色體無致畸作用。

本研究結(jié)果與我們先前基因突變試驗(yàn)的研究結(jié)果一致[13]。Woodruff等[15]的研究也表明銳鈦型納米二氧化鈦不會(huì)引起TK雜合子細(xì)胞DNA斷裂或氧化性DNA損傷，也不會(huì)引起沙門氏菌菌株TA102、TA100、TA1537、TA98和TA1535明顯的細(xì)菌回復(fù)突變。Warheit等[16]的研究也表明納米二氧化鈦在細(xì)菌回復(fù)突變試驗(yàn)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞的體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變試驗(yàn)中呈陰性結(jié)果。一項(xiàng)長期致突變試驗(yàn)表明，即使納米二氧化鈦顆粒(80%銳鈦型和20%金紅石型的混合物)在肝臟中停留很長時(shí)間，對(duì)肝臟細(xì)胞仍無致突變作用[17]。Theogaraj等[18]的研究也表明銳鈦型納米二氧化鈦和金紅石型納米二氧化鈦對(duì)中國倉鼠卵巢細(xì)胞均無光遺傳毒性，在接收紫外照射下也沒有引起細(xì)胞染色體畸變頻率的增加。馬茂才等[19]的研究也表明銳鈦型納米二氧化鈦不會(huì)引起沙門氏菌菌株TA97、TA198、TA100和TA102明顯的細(xì)菌回復(fù)突變。然而，一些其他研究表明納米二氧化鈦具有遺傳毒性，包括Di Virgilio等[20]發(fā)現(xiàn)中國倉鼠卵巢K1細(xì)胞中微核頻率呈濃度依賴性增加。Lu等[21]也發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦可以引發(fā)同一細(xì)胞系中微核頻率的增加。另一項(xiàng)研究表明，銳鈦型納米二氧化鈦對(duì)大鼠有血液毒性，能夠誘發(fā)體細(xì)胞遺傳毒性并引起免疫毒性改變[22]。造成上述結(jié)果差異的原因可能有研究用生物測試體系不同、納米二氧化鈦晶體類型不同、納米二氧化鈦粒徑大小不同以及染毒方式不同等。

綜上所述，結(jié)合我們之前的研究，從基因和染色體水平分析，銳鈦型納米二氧化鈦(40 nm)不能誘發(fā)體外培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變和基因突變，不屬于致突變物。此外，因判斷物質(zhì)是否屬于致突變物的復(fù)雜性以及體外測試系統(tǒng)的局限性，還需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)遺傳毒性測試以確定銳鈦型納米二氧化鈦是否具有遺傳毒性。