硫化鈉對大鼠經(jīng)口給藥的毒性和致畸性檢測

夏祺悅，岳茜嵐，豆捷雄，莊思琪，劉科亮*

(四川省疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041)

硫化鈉是一種吸濕性很強(qiáng)的物質(zhì)，通常我們觀察到的是水合物而不是脫水形式。以現(xiàn)代工藝純化制得的五水合硫化鈉結(jié)晶粉末為正交晶型，能在干燥器內(nèi)長期穩(wěn)定存在。

硫化鈉在工業(yè)領(lǐng)域常用作硫化染料、脫毛劑[1]、蒸煮劑，也是高能量密度的熱化學(xué)材料，能改善環(huán)境重金屬污染[2]。硫化鈉在醫(yī)藥領(lǐng)域也發(fā)揮著積極的作用[3]，它是一些口服藥制備工藝中的催化劑，可以制備肌肉松弛藥氯唑沙宗中間體2氨基4氯苯酚[4]，也用于制備抗感染藥物硝呋太爾[5]等。文獻(xiàn)報(bào)道口服硫化鈉腸溶片和腸溶膠囊可用于多項(xiàng)疾病的治療及輔助治療[6]。在傳統(tǒng)味精制作工藝中，一般采用硫化鈉作為除鐵劑。由于硫化鈉具有經(jīng)口暴露的可能性，我們應(yīng)對其經(jīng)口毒性引起重視。

目前已有關(guān)于硫化鈉及其水合物經(jīng)靜脈給藥和腹腔給藥的毒性研究，但僅限于急性毒性檢測，經(jīng)口毒性及系統(tǒng)的安全性評價(jià)尚未見報(bào)道。本文采用了經(jīng)口給藥急性毒性試驗(yàn)、重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)和致畸試驗(yàn)對硫化鈉的安全性進(jìn)行了初步評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

采用SPF級SD大鼠，雌雄各半，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(川)2018-19。

1.2 主要試劑與設(shè)備

1.2.1 受試藥物及處理 五水硫化鈉，由山西省某化工集團(tuán)股份有限公司提供，純度為96.5%~101.5%，批號為20191012，樣品為白色粉末，易溶于水。試驗(yàn)時(shí)用蒸餾水作溶劑配制成所需濃度。

1.2.2 主要設(shè)備 BS800全自動生化分析儀(邁瑞，中國)，XT-2000i型全自動血細(xì)胞分析儀(希森美康，日本)，ACL-TOP全自動血凝分析儀(沃芬，美國)，URIT-180尿液分析儀(優(yōu)利特，中國)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 急性毒性試驗(yàn) 采用霍恩法進(jìn)行試驗(yàn)[7]，將SD大鼠40只，體質(zhì)量180~220 g，隨機(jī)分為4組，每組10只，雌雄各半。設(shè)215、464、1 000、2 150 mg/kg組，按10 mL/kg一次經(jīng)口灌胃。染毒后觀察兩周內(nèi)動物的一般狀況、中毒表現(xiàn)及死亡情況。求出半數(shù)致死劑量(LD50)值及95%可信區(qū)間。

1.3.2 重復(fù)給藥毒性試驗(yàn) 采用灌胃法[8]，選用SD大鼠80只，體質(zhì)量70～94 g，隨機(jī)分成4組，根據(jù)大鼠LD50大約1/7劑量設(shè)置高劑量為120 mg/㎏，中、低劑量分別為60和30 mg/kg，另設(shè)蒸餾水對照組。每天按5 mL/kg經(jīng)口灌胃給藥，連續(xù)給藥90 d，每周記錄體質(zhì)量、攝食量和食物利用率。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，計(jì)算總增體質(zhì)量、總攝食量、總食物利用率，收集動物尿液，檢測尿常規(guī)，測定各項(xiàng)血液學(xué)血生化指標(biāo)，解剖動物觀察內(nèi)臟改變，稱肝臟、腎臟、脾臟、心臟、肺、腦、子宮、卵巢、睪丸、附睪、胸腺和腎上腺等臟器濕質(zhì)量，計(jì)算臟體比，取對照組及高劑量組大鼠多種器官組織作病理學(xué)檢查。

1.3.3 致畸試驗(yàn) 采用常規(guī)致畸試驗(yàn)，操作參照文獻(xiàn)[9]。將雌、雄SD大鼠按2∶1同籠交配，以查見陰栓的當(dāng)天為妊娠第0天，將查見陰栓的雌鼠隨機(jī)分成4組，每組17只，劑量設(shè)置同1.3.2。在妊娠第6~15 d，每天按5 mL/kg經(jīng)口灌胃染毒。于妊娠第0、6、9、12、15天稱體質(zhì)量，調(diào)整灌胃量。于妊娠第20天稱體質(zhì)量后經(jīng)麻醉處死動物，記錄總著床數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)、吸收胎數(shù)和黃體數(shù)，稱取子宮連活胎總質(zhì)量、活胎質(zhì)量、卵巢質(zhì)量、胎盤質(zhì)量并量取胎鼠身長，逐個(gè)檢查胎鼠的外觀、將1/2胎鼠放入Bouin'S液中固定兩周檢查內(nèi)臟，其余胎鼠去內(nèi)臟后經(jīng)固定、染色、透明后檢查骨骼。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0 for Windows軟件。重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)，若方差齊，進(jìn)行方差分析，如P＜0.05則用Dunnett法進(jìn)行兩兩比較；若方差不齊，改用秩和檢驗(yàn)，如P＜0.05則用Dunnett'sT3法進(jìn)行兩兩比較。致畸試驗(yàn)中，計(jì)量資料用±s表示，采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

染毒后215、464 mg/kg組未出現(xiàn)中毒癥狀及死亡，而1 000和2 150 mg/kg組出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)和呼吸困難等癥狀，部分動物恢復(fù)，部分動物染毒5 min內(nèi)出現(xiàn)死亡，死亡前出現(xiàn)呼吸抑制，死亡后大體解剖發(fā)現(xiàn)胃腸脹氣，胃腸道病理鏡檢未見異常。存活動物繼續(xù)喂養(yǎng)14 d。觀察期內(nèi)未見動物死亡。硫化鈉對雌雄SD大鼠急性經(jīng)口LD50分別為794和926 mg/kg。見表1。

表1 硫化鈉染毒后SD大鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.2 重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)

受試物以30、60、120 mg/kg經(jīng)口給予雌雄SD大鼠90 d。試驗(yàn)期間動物健康狀況良好，體質(zhì)量持續(xù)增長，未見動物死亡。動物血常規(guī)和血凝、血生化和電解質(zhì)的結(jié)果如表2和表3。部分指標(biāo)的改變雖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但無劑量反應(yīng)關(guān)系或無生物學(xué)意義。

表2 硫化鈉對SD大鼠末期血液學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果(±s，n=10)

表2 硫化鈉對SD大鼠末期血液學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果(±s，n=10)

RBC：紅細(xì)胞計(jì)數(shù)；HGB：血紅蛋白；WBC：白細(xì)胞；NEUT：中性粒細(xì)胞；LY：淋巴細(xì)胞；MONO：單核細(xì)胞；EOS：嗜酸性細(xì)胞；BAS：嗜堿性細(xì)胞；PLT：血小板計(jì)數(shù)；HCT：紅細(xì)胞壓積；APTT：活化部分凝血活酶時(shí)間；PT：凝血酶原時(shí)間.與對照組比較，*P＜0.05.

性別雄雌劑量/(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 RBC/(×1012/L)8.50±0.38 8.57±0.44 8.18±0.31 8.63±0.42 7.92±0.34 8.09±0.85 8.01±0.57 8.22±0.37 HGB/(g/L)157.70±5.36 159.10±5.07 153.40±5.87 158.40±3.10 152.70±7.12 154.00±15.50 150.20±8.27 155.70±5.93 WBC/(×109/L)8.57±1.26 7.66±1.73 9.78±2.36 6.16±1.60*3.63±0.96 3.17±1.11 5.12±1.67 4.07±0.95 NEUT/%17.63±7.76 22.62±11.02 14.80±3.81 23.50±4.47 11.49±3.89 19.88±7.98*11.70±6.02 15.53±5.64 LY/%73.59±8.85 67.04±10.43 76.78±4.45 66.12±4.36 79.24±5.23 69.81±7.21*80.11±6.55 74.62±8.03 MONO/%6.46±2.05 7.14±1.70 6.21±1.56 6.15±1.46 5.60±1.43 7.13±2.35 5.16±1.73 6.21±1.26性別雄雌劑量/(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 EOS/%2.42±0.49 3.33±0.95 2.31±0.63 4.34±1.82*3.78±0.77 3.27±1.33 3.15±0.60 3.80±2.18 BAS/%0.10±0.07 0.07±0.05 0.10±0.05 0.09±0.08 0.09±0.11 0.11±0.16 0.08±0.10 0.04±0.00 PLT/(×109/L)1026.90±71.213 998.80±122.71 977.30±132.88 1073.80±142.05 960.20±58.74 1039.10±158.37 1024.00±99.46 967.70±114.10 HCT/(L/L)0.44±0.02 0.44±0.01 0.43±0.01 0.44±0.01 0.44±0.02 0.45±0.04 0.43±0.02 0.44±0.02 APTT/s 19.71±0.58 19.21±1.34 22.42±1.28*20.18±2.34 19.95±1.88 18.52±2.97 21.03±1.62 21.11±1.41 PT/s 11.99±0.91 11.77±0.58 12.94±1.29 12.39±1.03 9.76±0.56 9.89±0.47 9.45±0.59 9.41±0.29

表3 硫化鈉染毒后SD大鼠末期血生化及電解質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果(±s，n=10)

表3 硫化鈉染毒后SD大鼠末期血生化及電解質(zhì)檢驗(yàn)結(jié)果(±s，n=10)

TP：總蛋白；ALB：白蛋白；ALT：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；AST：谷草轉(zhuǎn)氨酶；ALP：堿性磷酸酶；GGT：谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；BUN：尿素氮；CREA：肌酐；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；GLU：血糖；K：血清鉀；Na：血清鈉；Cl：血清氯.與對照組比較，*表示P＜0.05.

性別雄雌劑量(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 TP/(g/L)54.03±1.43 53.51±1.75 52.99±1.88 53.86±1.90 59.80±3.61 58.87±4.72 57.32±2.28 59.62±4.11 ALB/(g/L)29.85±0.82 29.68±0.76 29.50±1.21 29.97±1.08 33.76±2.04 33.39±2.35 32.63±1.33 33.53±1.80 ALT/(U/L)57.12±27.46 64.24±52.13 49.57±11.78 60.54±20.69 23.40±4.14 27.58±6.19 23.34±4.30 25.03±8.89 AST/(U/L)175.46±61.17 198.72±81.03 161.25±33.39 223.13±59.93 117.51±26.15 141.54±50.48 108.52±21.96 133.29±81.66 ALP/(U/L)96.31±15.38 99.85±12.71 105.03±16.36 99.70±10.12 69.74±14.64 64.30±16.47 67.02±14.67 63.82±18.91 GGT/(U/L)0.40±0.16 0.38±0.19 0.42±0.23 0.34±0.13 0.33±0.24 0.41±0.34 0.39±0.24 0.43±0.25 BUN/(mmol/L)6.78±0.70 7.09±0.48 6.63±0.86 7.31±0.47 8.62±1.10 9.53±0.78 8.82±1.18 9.26±0.90性別雄雌劑量(mg/kg)0 30 60 120 0 30 60 120 CREA/(μmol/L)63.21±11.27 66.88±5.50 58.26±6.01 70.64±12.19 61.97±7.20 57.41±11.90 60.63±7.96 59.87±6.48 TC/(mmol/L)1.35±0.28 1.39±0.19 1.25±0.32 1.40±0.21 1.90±0.22 1.80±0.40 1.72±0.30 1.90±0.37 TG/(mmol/L)0.57±0.24 0.56±0.23 0.60±0.21 0.56±0.17 0.63±0.16 0.73±0.35 0.52±0.11 0.49±0.09 GLU/(mmol/L)8.13±0.95 8.03±0.41 9.33±1.73 9.03±1.51 8.84±0.91 7.85±1.22 9.71±1.34 8.93±0.90 K/(mmol/L)5.18±0.35 5.26±0.24 5.08±0.32 5.29±0.36 4.91±0.24 5.21±0.36 4.87±0.36 5.20±0.35 Na/(mmol/L)144.22±0.81 144.56±0.55 144.40±0.19 144.17±1.07 147.57±2.50 145.35±2.60 146.17±0.97 145.50±0.96 Cl/(mmol/L)104.49±1.24 105.82±0.99*105.29±1.04 106.01±1.47*107.73±2.45 107.12±1.75 106.91±0.83 107.27±1.01

重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中，解剖大體觀察發(fā)現(xiàn)硫化鈉120 mg/kg劑量組大鼠腸道出現(xiàn)點(diǎn)狀出血灶。病理鏡檢結(jié)果顯示，120 mg/kg劑量組大鼠消化道觀察到主要以小腸黏膜壞死脫落和大腸腸壁各層炎細(xì)胞浸潤為主要特征的異常改變(見圖1)。其他器官組織僅見動物自發(fā)病變。在本試驗(yàn)條件下，該受試物對SD大鼠的未觀察到有害作用劑量(no-observed adverse effect level，NOAEL)為60 mg/kg。

2.3 致畸試驗(yàn)

2.3.1 硫化鈉對SD孕鼠體質(zhì)量的影響 試驗(yàn)期間，孕鼠未出現(xiàn)母體毒性及死亡。由表4可見，硫化鈉3個(gè)劑量組對孕鼠各時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量的影響與對照組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3.2 硫化鈉對SD大鼠胎仔的影響 與對照組比較，硫化鈉120 mg/㎏劑量組17只受孕大鼠中，3只孕鼠共發(fā)現(xiàn)4只死胎，死胎百分率顯著增加(P＜0.05)；有1只受孕大鼠所產(chǎn)17只仔鼠中，7只出現(xiàn)短肢，外觀畸形窩發(fā)生率顯著增加(P＜0.05)。未見受試物對胎仔骨骼及內(nèi)臟發(fā)育產(chǎn)生不良影響。見表5。

圖1 120 mg/kg硫化鈉對消化道的病理學(xué)損傷(×100倍)

表4 硫化鈉對SD孕鼠體質(zhì)量的影響(±s，n=17)

表4 硫化鈉對SD孕鼠體質(zhì)量的影響(±s，n=17)

劑量/(mg/kg)對照組硫化鈉30 60 120妊娠天數(shù)第0天297.4±17.0 293.2±17.8 283.6±19.7 286.4±18.5第6天337.7±20.6 329.2±17.2 325.9±22.5 326.3±20.6第9天357.1±25.1 345.2±18.9 341.9±22.1 339.1±19.1第12天375.6±31.0 361.0±23.5 360.1±26.1 358.8±19.7第15天397.5±33.6 388.6±30.9 379.3±28.4 382.6±20.3第20天494.0±43.5 469.4±47.1 461.5±43.0 463.9±36.5

表5 硫化鈉對SD孕鼠胎仔的影響(±s)

表5 硫化鈉對SD孕鼠胎仔的影響(±s)

與對照組比較，*P＜0.05.

劑量/(mg/kg)對照組硫化鈉30 60 120交配鼠數(shù)/只20 19 20 20活胎數(shù)/只254 223 222 222窩平均活胎數(shù)/只14.9±2.5 13.1±4.1 13.1±4.1 13.1±4.0吸收胎數(shù)/只3433死胎數(shù)/只0014死胎百分率/%0.00 0.00 0.44 1.75*短肢發(fā)生數(shù)/個(gè)0007短肢發(fā)生率/%000 3.15外觀畸形窩發(fā)生數(shù)/個(gè)0001外觀畸形窩發(fā)生率/%000 5.88*子宮連胎總質(zhì)量/g 103.0±16.4 89.0±26.0 91.6±29.3 93.2±28.5胎仔平均體質(zhì)量/g 4.50±0.54 4.49±0.15 4.47±0.22 4.81±0.52胎仔平均身長/cm 4.10±0.14 4.09±0.12 4.09±0.05 4.14±0.19

3 討論

本研究急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)中，大鼠染毒后出現(xiàn)共濟(jì)失調(diào)和呼吸困難等癥狀，并于染毒后幾分鐘內(nèi)死亡，死亡前有呼吸抑制，死亡后大體解剖發(fā)現(xiàn)腸道有脹氣，胃腸道病理鏡下檢查未見異常。由于大鼠出現(xiàn)了呼吸困難，呼吸抑制等作用，可能因?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)或呼吸系統(tǒng)出現(xiàn)了急性損傷造成了死亡，應(yīng)在今后的研究中注意對腦和肺部急性損傷進(jìn)行大體觀察和病理鏡檢。

根據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道，我們推測口服硫化鈉后在腸道經(jīng)硫酸鹽還原菌發(fā)酵生成大量硫化氫，過高濃度的硫化氫無法在腸道內(nèi)通過酶途徑等解毒過程清除，能引起硫化氫中毒，對皮膚黏膜有腐蝕作用，這可能是硫化鈉對腸道黏膜造成損傷的原因。同時(shí)它會參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)，引起慢性腸道炎癥性疾病、結(jié)直腸癌等相關(guān)疾病。本研究中重復(fù)給予硫化鈉90 d后，120 mg/kg劑量組能引起明顯腸道炎性反應(yīng)，結(jié)腸的炎性反應(yīng)可能與過量硫化氫在結(jié)腸產(chǎn)生的多種效應(yīng)有關(guān)，除了抑制細(xì)胞的呼吸功能，促凋亡作用，硫化氫還可降低結(jié)腸上皮細(xì)胞對丁酸鹽的氧化作用，導(dǎo)致黏膜通透性增加，腸道屏障功能受損[11]。

硫化鈉是常見的硫化氫供體[12]，其致畸試驗(yàn)鮮見報(bào)道，經(jīng)口研究更少。有文獻(xiàn)報(bào)道硫化氫對斑馬魚胚胎和仔魚均有劑量依賴性的發(fā)育毒性和畸形性[13]。另有研究[14]發(fā)現(xiàn)，硫化氫在較低的濃度短時(shí)間釋放，對人精子具有毒性，會降低人精子活力。在本研究的致畸試驗(yàn)中我們經(jīng)口給予硫化氫供體硫化鈉，發(fā)現(xiàn)120 mg/kg劑量組中死胎百分率顯著增加，外觀畸形窩發(fā)生率顯著增加，提示硫化鈉可能有胚胎毒性和外觀致畸毒性。我們觀察到120 mg/kg硫化鈉對孕鼠進(jìn)食量影響有降低作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且對大鼠腸道黏膜造成了損傷，可能影響動物營養(yǎng)物質(zhì)吸收，從而影響仔鼠發(fā)育。致畸試驗(yàn)的結(jié)果雖然有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是17只孕鼠中僅1只孕鼠的胎仔存在外觀畸形，不足以判定受試物的致畸性。試驗(yàn)結(jié)果未出現(xiàn)明顯毒性，這可能與高劑量組(120 mg/kg)設(shè)計(jì)劑量較低有關(guān)，今后尚需提高劑量重復(fù)試驗(yàn)確定結(jié)果。高劑量應(yīng)保證重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)大鼠出現(xiàn)明顯中毒反應(yīng)及少量死亡；致畸試驗(yàn)大鼠出現(xiàn)明顯胚胎毒性或輕微的母體毒性反應(yīng)。

所以，關(guān)于硫化鈉的安全性研究，以及它的生理和病理作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究明確。