玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量的測定能力驗證

王蓓蓓 朱聯(lián)旭 李崇勇 劉欣

摘要 [目的]通過實驗室能力驗證活動分析了影響玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）檢測結(jié)果的主要因素。[方法]依據(jù)GB 5009.111—2016第二法：免疫親和層析凈化HPLC法檢驗并優(yōu)化前處理條件。[結(jié)果]采用5倍稀釋濃度提取1 h和3 mL/min的凈化速度，能力驗證樣品中DON含量為571 μg/kg，RSD為0.25%。[結(jié)論]通過了中國食品藥品檢定研究院組織實施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定》能力驗證，與中國食品藥品檢定研究院統(tǒng)計Z比分值為0.70，能力驗證結(jié)果為滿意，細(xì)化完善了國標(biāo)測定脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的操作，為廣大檢驗檢測人員提供參考。

關(guān)鍵詞 脫氧雪腐鐮刀菌烯醇;能力驗證;玉米粉;高效液相色譜法

中圖分類號 TS 201.6? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）01-0177-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.01.047

Proficiency Testing for Determination of Deoxynivalenol in Corn Flour

WANG Bei-bei1，2， ZHU Lian-xu3， LI Chong-yong1 et al

（1. Hanzhong Testing and Inspection Center for Food and Drug Control， Hanzhong， Shaanxi 723000;2. College of Biological Science and Engineering， Shaanxi University of Technology， Hanzhong， Shaanxi 723000;3. Zhenba County Market Supervision Administration， Zhenba， Shaanxi 723600）

Key words [Objective]Through a laboratory proficiency testing activity， the main factors affecting the detection results of deoxynivalenol in corn flour were analyzed. [Method]According to the second method of the national standard GB5009.111-2016 to check and optimize the pretreatment conditions.[Result]

Under the conditions of extraction at 5 times of dilution concentration for 1 h and 3 mL/L flow rate， the DON content in the ability verification sample was 571 μg/kg， RSD was 0.25%.

[Conclusion]Passed the NIFDC-PT-228 “Deoxynivalenol Determination of Deoxynivalenol in Corn Flour” proficiency test organized and implemented by the China Institute for Food and Drug Control， and the Z score with the organizer was 0.70. The proficiency test results were satisfactory， and the national standard determination of deoxynivalenol has been refined and perfected to provide a reference for the majority of inspection and testing personnel.

Key words Deoxynivalenol;Proficiency testing;Corn flour;High performance liquid chromatography

基金項目 漢中市地產(chǎn)食品質(zhì)量監(jiān)控與品質(zhì)提升創(chuàng)新團(tuán)隊基金項目（201902）。

作者簡介 王蓓蓓（1984—），女，陜西榆林人，碩士，從事食品檢驗檢測與質(zhì)量控制研究。

通信作者，高級工程師，從事食品藥品質(zhì)量安全控制、生產(chǎn)工藝與檢驗檢測研究。

收稿日期 2021-04-25

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）又稱嘔吐毒素，是一種主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族毒素，也是糧食中重要的食品安全指標(biāo)。人和動物食用了被 DON 污染的食物后，會產(chǎn)生厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒等急性中毒癥狀，嚴(yán)重會導(dǎo)致死亡[1]。DON化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定，玉米、小麥、大麥等谷物及其加工產(chǎn)中廣泛存在[2]。近年來，我國谷物受到DON污染日益嚴(yán)重，尤其是小麥粉及其制品、玉米等。從含量上看，小麥粉制品中，餅干中DON的污染狀況較重，而玉米由于生長期較長且正值雨季，更易被鐮刀菌污染，是目前污染最嚴(yán)重的谷物之一[3-4]。我國是玉米生產(chǎn)大國，玉米不僅是食品原料，也是飼料原料，飼料通過肉、蛋、奶等食物鏈最終影響人類營養(yǎng)和健康，因此其安全影響巨大[5]。在潮濕、溫?zé)岬葰夂驐l件下，更易產(chǎn)生DON毒素，并經(jīng)由谷物或飼料通過食物鏈傳遞富集至人體內(nèi)，給世界糧食產(chǎn)業(yè)形成龐大的經(jīng)濟(jì)損失[6]。據(jù)世界衛(wèi)生組織、歐洲食品安全局等機(jī)構(gòu)的廣泛調(diào)查評估，過去10年，原糧中的DON感染率達(dá)58%，將DON列為最危險的食品污染物之一，美國、日本、歐盟等地區(qū)和國家已經(jīng)就食品中的真菌毒素含量作出嚴(yán)格規(guī)定[7-8]。

國家農(nóng)業(yè)、糧食、市場監(jiān)管等部門為了更加準(zhǔn)確地把握谷物糧食中的 DON污染狀況，每年都在全國開展各類糧食產(chǎn)品中DON的監(jiān)督抽查和風(fēng)險監(jiān)測，且在GB 2761—2017中對食品中DON采取了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)：玉米、玉米面的DON 含量≤1 000 μg/kg;大麥、小麥、麥片、小麥粉的DON含量≤1 000 μg/kg[9]。目前，對于DON的檢測有高效液相色譜法、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法和生物芯片技術(shù)，通過持續(xù)開展檢測評價，逐步提升實驗室毒素檢驗檢測能力，對于評估我國糧食毒素污染程度，保障糧食安全有著至關(guān)重要的意義[5，10]。因此，準(zhǔn)確評價谷物制品中DON含量是現(xiàn)階段食品和糧食安全的必然要求。

為了切實提升實驗室的檢驗?zāi)芰腿藛T的技術(shù)水平，2019年參加了中國食品藥品檢定研究院組織實施的NIFDC-PT-228《玉米粉中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測定》能力驗證，樣品編號TF228-0054，筆者在查閱相關(guān)文獻(xiàn)[11-17]和結(jié)合自身實驗室條件下，按照GB 5009.111—2016第二法免疫親和層析凈化高效液相色譜法[18]，剖析了各環(huán)節(jié)中可能影響玉米粉中DON含量測定結(jié)果的要點，并對前處理的條件進(jìn)行了優(yōu)化，為今后相關(guān)檢測檢驗提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

玉米粉（編號：TF228-0148），中國食品藥品檢定研究院提供。DON標(biāo)準(zhǔn)溶液：100.10 μg/mL（Rome labs Lot# L18492D）。玉米粉中DON質(zhì)控樣：（569±60） μg/kg（Rome labs Lot# M15361D）。

分析天平（日本島津d=0.01 g）;氮吹儀（?？瓶萍加邢薰荆?水浴恒溫振蕩器（常州億能實驗儀器廠）;高效液相色譜儀（日本島津LC-20AD）;C18色譜柱（月旭科技有限公司4.6 mm×250 mm，5 μm）;DON免疫親和柱3 mL（Rome labs）;Milli-Q純水機(jī)（美國密理博公司）。

甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技中國公司）;氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀（分析純，成都科龍化學(xué)用品有限公司）;試驗用水：符合GB/T 6682—2016《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》一級水的要求。

1.2 方法

參考GB5009.111—2016第二法免疫親和層析凈化HPLC法進(jìn)行試驗[19]。統(tǒng)計方法用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計分析，差異性檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.1 樣品的制備。

該試驗?zāi)芰︱炞C樣品為玉米粉，樣品用鋁塑袋真空包裝，每瓶裝量約30 g，常溫避光保存[10]。能力驗證作業(yè)指導(dǎo)書要求一次取樣量不少于5 g，樣品稱量前穩(wěn)定至室溫（20～25 ℃）。

1.2.2 樣品的提取。

提取溶劑主要為超純水，提取方式為超聲波或者搖床振搖，該環(huán)節(jié)主要研究樣品稀釋倍數(shù)、提取時間對結(jié)果的影響。該試驗分別對質(zhì)控樣品稀釋3、5、8倍，搖床振搖時間分別為0.5、1.0、2.0 h。

1.2.3 樣品的富集凈化。

研究凈化液過免疫親和柱時流速對結(jié)果的影響，分別對質(zhì)控樣凈化液采取1、3、6 mL/min的速度進(jìn)行凈化分析。

1.2.4 液相色譜條件。

流動相：甲醇-超純水（20∶80，V/V）;進(jìn)樣量：50 μL;檢測波長：218 nm;流速：1 mL/min;柱溫：35 ℃;色譜柱：月旭C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選用Rome labs的有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，趙晶晶等[19]通過用超高效液相色譜法測定了玉米中DON含量，剖析了不確定度各因素的影響后得出，質(zhì)量濃度、測量重復(fù)性、體積量取是影響測定結(jié)果不確定度的主要因素。經(jīng)過預(yù)試驗以及加標(biāo)濃度的考慮，選取100～1 000 ng/mL線性范圍，使得待測樣品濃度盡量在線性中間區(qū)域，在該線性范圍內(nèi)曲線方程為：y=59.56x+159.60，R2=0.999（圖1、2）。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液、標(biāo)準(zhǔn)點的稀釋溶液應(yīng)與流動相一致以降低溶劑效應(yīng)，配置標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液與標(biāo)準(zhǔn)曲線選取應(yīng)選用校準(zhǔn)的移液管（移液槍）和容量瓶，盡量減少轉(zhuǎn)移次數(shù)，將標(biāo)曲配制及稀釋過程帶來的不確定度降至最低。

2.2 樣品提取

分別對質(zhì)控樣品用水稀釋3、5、8倍，搖床振搖0.5、1.0、2.0 h后，提取過濾凈化，以3 mL/min的速度凈化測定質(zhì)控樣品，結(jié)果見表1。由表1可知，振搖0.5 h稀釋5倍和8倍結(jié)果差異不顯著（P>0.05），稀釋3倍和5倍結(jié)果差異顯著（P<0.05）;振搖1.0 h和振搖2.0 h差異不顯著（P>0.05），振搖1.0 h和振搖0.5 h差異顯著（P<0.05）。結(jié)合試驗提取效果和時間成本，避免由于稀釋液不足及振搖時間短造成的提取不充分，以5倍稀釋振搖1.0 h為最佳選擇。

2.3 樣品凈化

由于玉米粉基質(zhì)比較復(fù)雜，含有天然的色素、脂類、蛋白質(zhì)等有機(jī)物質(zhì)，對樣品的檢測干擾較大，為了降低基質(zhì)的影響，用免疫親和柱對提取液進(jìn)行凈化處理[10]。試驗前需驗證免疫親和柱的柱容量，柱回收率是否滿足要求。柱容量驗證、柱回收率驗證方法按照GB5009.111-2016附錄A。5 mL超純水中加入6 000 ng DON 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，混合均勻，分別取同一批次免疫親和柱各3 根，每根免疫柱的上樣量為1 mL，經(jīng)過洗脫富集后用氮氣吹干，流動相定容至1 mL，HPLC分離測定DON含量[9]。6支親和柱的測定結(jié)果分別為1 120、1 135、1 080、1 050、1 103、1 060 ng，柱容量≥1 000 ng，柱回收率≥80%，為可使用商品。

使用前，將免疫親和柱從冰箱中取出放至室溫。樣液上柱量、洗脫方法依據(jù)不同廠家的產(chǎn)品說明嚴(yán)格規(guī)范操作，質(zhì)控樣采用不同流速凈化，1、3 mL/min結(jié)果差異不顯著（P>0.05），3、6 mL/min結(jié)果差異顯著（P<0.05）（表2），考慮到整個試驗的效率和結(jié)果，確定3 mL/min為最佳凈化流速。

2.4 質(zhì)控樣及加標(biāo)回收

由于樣品量受限，對質(zhì)控樣品以5倍稀釋和3 mL/min流速凈化后進(jìn)行測定，并進(jìn)行低、中、高3個濃度的加標(biāo)回收試驗，結(jié)果表明回收率在76.8%～89.4%，RSD在1.69%～5.05%（表3）。質(zhì)控樣色譜圖見圖3、4。

2.5 能力驗證結(jié)果

通過用質(zhì)控樣對前處理進(jìn)行優(yōu)化后，能力驗證樣品最終采用5倍稀釋的超純水振搖1 h后，以3 mL/min的流速，按照GB 5009.111—2016的方法檢測，結(jié)果表明DON含量為571 μg/kg，RSD為0.25%，檢測結(jié)果與能力驗證結(jié)果Z比分值為0.70，能力驗證結(jié)果為滿意。

3 討論

能力驗證是衡量實驗室檢測結(jié)果可靠性和可比性的最常用方法之一，毒素的能力驗證不僅是糧油真菌毒素實驗室檢測質(zhì)量控制的重要手段，還是提高實驗室糧油真菌毒素檢測結(jié)果可信度的重要保證[20]。能力驗證包括國內(nèi)實驗室（間）比對和國際實驗室（間）比對，參加國內(nèi)實驗室（間）能力驗證，有助于監(jiān)督實驗室的檢驗檢測能力及其能力維持狀況。參加國際實驗室間檢測能力驗證，有助于實驗室及時領(lǐng)會貫通國際相關(guān)領(lǐng)域檢測能力驗證的政策和要求，促進(jìn)該領(lǐng)域檢測能力的提高和交流合作[21]。

胡桂英[1]用高效液相色譜法測定了小麥粉中DON含量，且評估了不確定度評定的影響因素，指出前處理過程和計量器具校準(zhǔn)引入的不確定度為測量不確定度的主要來源。因此在試驗過程中，檢驗人員主要把握樣品前處理環(huán)節(jié)，嚴(yán)格按照國標(biāo)和儀器說明書操作，降低誤差，以提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。該研究在試驗前經(jīng)過資料查詢和模擬預(yù)試驗，選取最佳前處理方案，并在檢測過程中進(jìn)行質(zhì)量控制，順利通過能力驗證。

DON對人和動物都有一定的毒性，且性質(zhì)穩(wěn)定，耐酸耐堿耐高壓，普通的食品加工方法難以使其降解，120 ℃高溫、強(qiáng)堿或高壓才能破壞部分毒素[11]。因此，試驗過程中操作人員在處理陽性樣品和配制標(biāo)準(zhǔn)溶液時需做好個人防護(hù)，試驗結(jié)束后用5%次氯酸鈉溶液浸泡所有容器和廢棄物，擦拭桌面，避免造成二次污染。

該研究結(jié)果表明，DON含量為571 μg/kg，與中國食品藥品檢定研究院統(tǒng)計Z比分值為0.70，能力驗證的結(jié)果為滿意。能力驗證的通過證明了該研究具備DON項目的檢驗?zāi)芰Γ瑢z驗人員而言也是積累經(jīng)驗及能力提升的過程。通過參加能力驗證，可以有效提高實驗室質(zhì)量管理水平和檢驗檢測能力，對實驗室的能力建設(shè)和服務(wù)地方經(jīng)濟(jì)水平具有積極作用。

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