細菌Ⅴ型分泌系統(tǒng)的研究進展

張洋，武成綜述，于源華審校

1.長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春130022；2.長春理工大學(xué)生物檢測工程實驗室，吉林 長春130022；3.釣魚臺醫(yī)藥集團吉林天強制藥股份有限公司，吉林柳河135300

根據(jù)革蘭染色法，細菌分為只含1層內(nèi)膜（inner membrane，IM）的革蘭陽性菌（Gram-positive，G+）和含有IM、外膜（outer membrane，OM）兩層膜的革蘭陰性菌（G-）。G+與G-菌細胞膜結(jié)構(gòu)的差別，導(dǎo)致它們的分泌系統(tǒng)存在較大差異。大多數(shù)G+菌通過一般分泌途徑（general secretory pathway，GSP）或稱Sec途徑（secretion）、雙精氨酸移位酶途徑（twin-arginine translocation，Tat）、信號識別顆粒途徑（signalrecognition particle，SRP）等即可完成蛋白的分泌與轉(zhuǎn)運。由于G+菌含有較厚的肽聚糖細胞壁，部分G+菌還演化出了其他特殊的分泌途徑：FEA（flagella export apparatus）、FPE（fimbrilin-protein exporter）、holin（hole forming）和Wss（WXG100 secretion system）途徑。其中Wss途徑（Esat-6分泌系統(tǒng)、ESX-1途徑、G+菌Ⅶ分泌系統(tǒng)）可在結(jié)核桿菌、金黃色蠟狀葡萄球菌、炭疽桿菌中轉(zhuǎn)運毒性蛋白［1］。

G-菌分泌的蛋白需跨越IM、周質(zhì)空間和OM，包括毒素、黏附素、酯酶、蛋白酶、核酸酶、DNA-蛋白復(fù)合物、溶血素等。目前，G-菌中至少存在9種分泌系統(tǒng)，依次命名為Ⅰ型分泌系統(tǒng)（typeⅠsecretion system，T1SS）～Ⅸ型分泌系統(tǒng)（typeⅨsecretion system，T9SS）［2］。根據(jù)蛋白的分泌是否需要同時跨越內(nèi)外雙層膜，可將G-菌分泌系統(tǒng)分為一步分泌和兩步分泌系統(tǒng)［3-4］。一步分泌系統(tǒng)可將蛋白一步釋放到細菌外或直接注入真核宿主體內(nèi)，包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ型4類分泌系統(tǒng)。該系統(tǒng)分泌的蛋白不含N-端信號肽，被稱為非經(jīng)典分泌蛋白（non-classically secreted proteins，NCSPs）。而含有信號肽的經(jīng)典分泌蛋白（classically secreted proteins，CSPs）在信號肽的引導(dǎo)下通過Sec途徑跨越內(nèi)膜，下一步通過不同的機制跨越外膜，該過程稱為兩步分泌。兩步分泌系統(tǒng)包括Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ［5］和Ⅸ型［6］5類分泌系統(tǒng)。

T1SS以大腸埃希菌α-溶血素（Hly A）為代表，其轉(zhuǎn)運裝置由位于內(nèi)膜上提供能量的ABC轉(zhuǎn)位酶、跨過內(nèi)膜與外膜連接的膜融合蛋白（membrane fusion protein，MFP）和外膜蛋白（outer membrane protein，OMP）3個必要蛋白組成，主要分泌毒素、溶血素等；T2SS以Klebsiella oxytoca支鏈淀粉酶為代表，由外膜復(fù)合體、內(nèi)膜蛋白、提供能量的ATPase等多達15種蛋白組成復(fù)雜轉(zhuǎn)運體，主要分泌各種酶類，如蛋白酶、酯酶、磷酸酶等［7］；T3SS由多達20種蛋白質(zhì)組成類似于注射器的超分子復(fù)合物，其中含有9個保守的核心蛋白，可通過針頭結(jié)構(gòu)將效應(yīng)蛋白直接注入宿主細胞中，主要存在于耶爾森菌、志賀菌、腸炎沙門菌等［8］；T4SS由VirB同源蛋白和Tra同源蛋白等至少10種蛋白組成，主要參與細菌與周圍環(huán)境的DNA轉(zhuǎn)移，也可參與毒力因子的分泌［9］；T5SS也被稱為自主轉(zhuǎn)運分泌系統(tǒng)（autotransporter，AT），可具體劃分為6種亞型；T6SS以溶血素調(diào)節(jié)蛋白（Hcp）和纈氨酸-甘氨酸重復(fù)蛋白G（valine-glycine repeat protein G，VgrG）為代表，由包含15~25個基因的保守基因簇編碼而來，目前發(fā)現(xiàn)的Ⅵ型分泌蛋白數(shù)量較少，主要存在于銅綠假單胞菌、霍亂弧菌、沙雷菌等［10］；T7SS通常被稱為分子伴侶／分子引導(dǎo)分泌途徑（chaperone-usher pathway，CUpathway），區(qū)別于G+菌Ⅶ分泌系統(tǒng)，主要參與大腸埃希菌和沙門菌等至少30種G-菌纖毛、菌毛等黏附結(jié)構(gòu)的組裝［11］；T8SS通常被稱為胞外核聚-沉淀途徑（extracellular nucleation-precipitation pathway，ENP pathway），存在于沙門菌和大腸埃希菌中的Curli蛋白是已知唯一的由該系統(tǒng)分泌的黏附細胞器［12］；T9SS也被稱為Por分泌系統(tǒng)，以牙齦素（gingipains）為代表，可促使細菌發(fā)生滑行運動，也可作為毒力因子，主要存在于Bacteroidetes門的大多數(shù)分支中［6］。在G-菌9種分泌系統(tǒng)中，一部分分泌系統(tǒng)在所有細菌中相對保守，可分泌多種多樣的蛋白；另外一些分泌系統(tǒng)僅出現(xiàn)在小部分細菌種群中；甚至部分分泌系統(tǒng)只可分泌1種或少數(shù)幾種蛋白。

本文對T5SS的研究進展作一綜述，旨在為研究細菌的致病機制提供參考，以及新型抗生素的研發(fā)和T5SS的生物學(xué)應(yīng)用等提供新的思路。

1 T5SS的結(jié)構(gòu)和分類

T5SS結(jié)構(gòu)單一，通常只含有1條或兩條肽鏈，包含跨內(nèi)膜必須的信號肽、分泌到細菌表面發(fā)揮生理功能的乘客區(qū)域（passenger domain）和負責(zé)定位到外膜區(qū)的轉(zhuǎn)運區(qū)域（translocation domain）。由于之前的研究認為Ⅴ型分泌蛋白跨外膜的過程不需要能量和輔助蛋白，自身即可依賴Sec途徑跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運，并在外膜上形成β折疊桶（β-barrel）完成蛋白的外泌，因此也被稱為自主轉(zhuǎn)運分泌系統(tǒng)。近幾年，隨著Ⅴ型分泌蛋白研究的不斷深入，使得“自主轉(zhuǎn)運”這一命名受到挑戰(zhàn)。另外，由于蛋白跨外膜后乘客區(qū)域與轉(zhuǎn)運區(qū)域的分離，而晶體結(jié)構(gòu)只能獲取蛋白的最終狀態(tài)，使得全長蛋白的結(jié)構(gòu)解析十分困難，目前只有酯酶A（estrase A，EstA）的全長結(jié)構(gòu)被解析出來［13］。Ⅴ型分泌蛋白結(jié)構(gòu)的差異造成其分泌過程和最終構(gòu)象的不同，因此將T5SS進一步分為6種亞型：Ⅴa、Ⅴb、Ⅴc、Ⅴd、Ⅴe、Ⅴ-like。T5SS不同亞型的結(jié)構(gòu)見圖1［14］，不同亞型間的差異見表1。

表1 T5SS不同亞型的基本特征Tab.1 Basic characteristics of T5SS

A：Ⅴ型分泌蛋白結(jié)構(gòu)示意圖（紅色表示12條β-折疊構(gòu)成的折疊桶，綠色表示16條β-折疊構(gòu)成的折疊桶，粉紅色表示預(yù)測的8條β-折疊構(gòu)成的折疊桶，藍色表示由β-螺旋構(gòu)成的乘客域，紫色表示Ⅴc乘客蛋白，褐色表示Ⅴd和Ⅴe乘客蛋白，深紅色表示Ⅴ-like乘客蛋白）；B：已解析Ⅴ型分泌蛋白的晶體結(jié)構(gòu)（α-螺旋用紅色標(biāo)記，β-折疊用黃色標(biāo)記）。PDB編碼如下：乘客區(qū)域：Pertactin（1DAB）、HMW1（2ODL）、EibD（2XQH）、PlpD（5FYA）、Inv（1CWV）、SabA（4O5J），β-桶狀結(jié)構(gòu)域NalP（1UYO）、FhaC（4QKY）、Hia（2GR7）、Int（4E1S），Ⅴd和Ⅴ-like亞型的β-桶狀域結(jié)構(gòu)尚未解析。

1.1Ⅴa亞型 Ⅴa亞型分泌系統(tǒng)又被稱為經(jīng)典自主轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（classical autotransporter），最早用于描述淋病奈瑟菌IgA蛋白酶的分泌。該途徑主要分泌絲氨酸蛋白酶、毒力因子、黏附素以及參與免疫逃避和生物膜形成的蛋白。Ⅴa亞型分泌系統(tǒng)只含有1條肽鏈，由N-端信號肽、乘客區(qū)域、C-端轉(zhuǎn)運區(qū)域組成。N-端信號肽在完成跨內(nèi)膜Sec轉(zhuǎn)運后被切除。最早被解析的Ⅴa亞型乘客蛋白為百日咳桿菌粘附素（pertactin，PRN），呈長纖維狀結(jié)構(gòu)，由反向平行的β-片層（β-sheets）圍繞中心軸螺旋成β螺線管（βsolenoids）超二級結(jié)構(gòu)。相鄰的β-片層由環(huán)狀loops相連，而且β螺線管內(nèi)部緊密疏水以維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［15］。大多數(shù)Ⅴa亞型乘客蛋白，如血紅蛋白酶Hbp、抗原Ag43等具有相似結(jié)構(gòu)，但EstA乘客蛋白呈α-球狀結(jié)構(gòu)。最早被解析的Ⅴa亞型轉(zhuǎn)運蛋白為NalP，由含有12條連續(xù)β-折疊構(gòu)成的β-桶狀結(jié)構(gòu)和貫穿β-桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的呈α-螺旋（α-helical）的連接區(qū)組成［16］。盡管α-螺旋連接區(qū)的長度和方向存在差異，但幾乎所有Ⅴa亞型轉(zhuǎn)運蛋白，如Hbp、AIDA-I、EstA、EspP等均含有該結(jié)構(gòu)。另外，Ⅴa亞型分泌系統(tǒng)轉(zhuǎn)運蛋白不含有周質(zhì)空間殘留區(qū)域。

1.2Ⅴb亞型 Ⅴb亞型分泌系統(tǒng)又被稱為雙組分分泌系統(tǒng)（two-partner secretion systems，TPS），主要分泌細胞毒素、黏附素、蛋白酶、血紅素結(jié)合蛋白等，在細菌對宿主細胞的黏附、侵襲、傳播中發(fā)揮作用。區(qū)別于所有的T5SS，Ⅴb亞型由同一操縱子下的兩條獨立多肽鏈組成，分別編碼發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的乘客蛋白TpsA和負責(zé)插膜定位的轉(zhuǎn)運蛋白TpsB。TpsA和TpsB具有各自獨立的信號肽序列，通過Sec途徑介導(dǎo)蛋白的跨內(nèi)膜運輸。目前，研究最清楚的TPS系統(tǒng)為流感嗜血桿菌黏附素（H.influenzaeadhesion，HMW）和百日咳絲狀血凝素（B.pertussisadhesin filamentous haemagglutinin，F(xiàn)HA）?，F(xiàn)已解析的TpsA蛋白結(jié)構(gòu)包括FHA［17］、HMW1［18］和奇異變形桿菌溶血素A（Proteusmirabilishemolysin A，HpmA）［19］，由β-片層和β-螺旋組成β螺線管，該結(jié)構(gòu)與Ⅴa亞型轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域相似。目前唯一解析的TpsB蛋白為FHA的轉(zhuǎn)運蛋白FhaC，由16條β-折疊構(gòu)成的β-桶狀結(jié)構(gòu)和N-端存在于周質(zhì)空間的兩個POTRA域（polypeptide transport associated domains）組成。FhaC的β-桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)存在1段由周質(zhì)空間插入的α-螺旋（H1）和1個貫穿其中的胞外loop（L6），上述兩個結(jié)構(gòu)共同堵塞β-桶，在FHA分泌過程中起重要作用［20］。

1.3Ⅴc亞型 Ⅴc亞型分泌系統(tǒng)又被稱為三聚體自身轉(zhuǎn)運黏附素（trimeric autotransporter adhesins，TAAs），作為細菌表面黏附素介導(dǎo)細菌對宿主細胞或細胞外基質(zhì)蛋白的黏附。Ⅴc亞型蛋白在細菌表面展示為三聚體寡聚“棒棒糖”結(jié)構(gòu)，比其他T5SS結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由長度變化大且結(jié)構(gòu)多樣的乘客蛋白和類似于經(jīng)典轉(zhuǎn)運蛋白但更為短小的C-端β-桶狀轉(zhuǎn)運蛋白組成。Ⅴc亞型乘客蛋白結(jié)構(gòu)多樣，通常包含N-端信號肽、頭結(jié)構(gòu)域（head regions）、頸結(jié)構(gòu)域（neck domain）、莖結(jié)構(gòu)域（stalk）等。目前已解析的Ⅴc亞型乘客蛋白有大腸埃希菌IgG結(jié)合蛋白EibD［21］、鼠疫耶爾森菌黏附素A（YadA）［22］、流感嗜血桿菌Hia［23］等。其球狀頭結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，典型代表為左手β-roll結(jié)構(gòu)。頸結(jié)構(gòu)域?qū)⑶驙铑^結(jié)構(gòu)與細長型莖結(jié)構(gòu)相連，主要為無規(guī)則卷曲，并可將3個亞基連接在一起，從而穩(wěn)定三聚體結(jié)構(gòu)。莖結(jié)構(gòu)域由3個α-螺旋相互纏繞組成超級螺旋結(jié)構(gòu)，由一個右手超級螺旋開始，繼而轉(zhuǎn)換為標(biāo)準(zhǔn)的左手超級螺旋，并通過連接區(qū)與轉(zhuǎn)運區(qū)域相連。已解析的Hia［24］和YadA［25］轉(zhuǎn)運區(qū)域結(jié)構(gòu)類似，由乘客蛋白C-端形成的4條β-折疊三聚成含12條β-折疊的β-桶狀結(jié)構(gòu)，桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部的連接區(qū)為標(biāo)準(zhǔn)左手線圈螺旋結(jié)構(gòu)。

1.4Ⅴd亞型Ⅴd亞型分泌系統(tǒng)目前僅用來描述銅綠假單胞菌馬鈴薯糖蛋白樣蛋白PlpD。與經(jīng)典轉(zhuǎn)運途徑類似，含有N-端乘客區(qū)域和C-端轉(zhuǎn)運區(qū)域。其轉(zhuǎn)運區(qū)域的氨基酸序列不同于經(jīng)典轉(zhuǎn)運蛋白，而與TpsB具有同源性。生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示，PlpD含有16個β-折疊構(gòu)成的β-桶狀結(jié)構(gòu)和1個POTRA域，但PlpD轉(zhuǎn)運區(qū)域的具體結(jié)構(gòu)尚未被解析。目前，PlpD乘客區(qū)域結(jié)構(gòu)已被解析，作為經(jīng)典的脂肪酶α／β水解酶，包含，1個催化位點和1個位于疏水性通道內(nèi)的脂質(zhì)分子。PlpD具有磷脂酶A1活性，可廣泛識別磷脂酰肌醇并破壞膜結(jié)構(gòu)［26］。

1.5Ⅴe亞型 Ⅴe亞型分泌系統(tǒng)又被稱為反向自轉(zhuǎn)運途徑（inverse autotransporters），主要代表為致病性大腸埃希菌內(nèi)膜素（intimin）和耶爾森菌入侵素（invasin），也被稱為intimin／invasin途徑。與經(jīng)典自轉(zhuǎn)運途徑不同，其C-端乘客區(qū)域為多個免疫球樣蛋白（Ig-like）重復(fù)銜接組成，且頂部被c型凝集素樣結(jié)構(gòu)域覆蓋［27］。N-端為12條β-折疊構(gòu)成的β-桶狀轉(zhuǎn)運區(qū)域，β-桶狀結(jié)構(gòu)與經(jīng)典自裝運和三聚體自轉(zhuǎn)運蛋白類似。但β-桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部連接區(qū)不是α-螺旋結(jié)構(gòu)，而是一條伸展鏈。在β-桶狀結(jié)構(gòu)與連接區(qū)之間存在一段α-螺旋周質(zhì)空間域，該區(qū)域一般小于50個氨基酸殘基，預(yù)測僅含有兩個α-螺旋［28］。

1.6Ⅴ-li k e亞型Ⅴ-like亞型分泌系統(tǒng)被用于描述幽門螺旋桿菌外膜蛋白家族Hops，如BabA、SabA等黏附素的分泌，該蛋白家族的C-端含有一段保守的類似于自轉(zhuǎn)運蛋白的跨膜域。預(yù)測該蛋白含有1個不連續(xù)的跨膜域，由C-端7條β-折疊和N-端1條β-折疊組成含8條β-折疊的OmpA-likeβ-桶狀結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)和小角X-射線散射實驗表明，SabA胞外結(jié)構(gòu)為保守的α-卷曲螺旋，插在第1與第2個β-折疊之間［29］。該系統(tǒng)雖然被命名為Ⅴ-like亞型，但其蛋白結(jié)構(gòu)十分特殊，且與其他自轉(zhuǎn)運蛋白在系統(tǒng)發(fā)育上無明確關(guān)聯(lián)。

2 T5SS的分泌過程

G-菌T5SS屬于兩步分泌，其分泌過程包括：跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運、周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運、跨外膜轉(zhuǎn)運、蛋白釋放等［30］。

2.1跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運 Ⅴ型分泌蛋白含有依賴Sec系統(tǒng)的信號肽序列，蛋白在細胞內(nèi)合成后，以未折疊的狀態(tài)通過Sec系統(tǒng)跨過細菌內(nèi)膜。90%以上的Ⅴ型分泌蛋白具有一段長度約為25個氨基酸且結(jié)構(gòu)保守的信號肽，該信號肽由帶電荷的N-端、中心疏水的H域和含信號肽酶1（SPase1）切割位點的C-端構(gòu)成。某些蛋白的信號肽長度超過50個氨基酸殘基，具有雙重結(jié)構(gòu)域，包括約25個氨基酸的N-端延伸部分和類似于經(jīng)典Sec信號肽的C-端［31］。Sec轉(zhuǎn)運過程中涉及到多種Sec蛋白，如SecA、SecB、SecYEG、信號識別顆粒（signal recognition particle，SRP）、YidC等。SecA為100 kD的分子驅(qū)動蛋白，SecYEG為內(nèi)膜上運送外泌蛋白的通道，SecB為17 kD的四聚體伴侶蛋白，YidC插入酶可將蛋白插到內(nèi)膜上。多數(shù)Ⅴ型分泌蛋白的跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運過程可概括為：SecB與前體蛋白結(jié)合，維持前體蛋白的未折疊穩(wěn)態(tài)；SecB與SecA相互作用，前體蛋白與SecB解離；信號肽與SecA結(jié)合；前體蛋白被高效轉(zhuǎn)移到SecYEG通道；信號肽被切割后釋放到周質(zhì)空間。另外，某些Ⅴ型分泌蛋白，如FHA、Hbp、EmaA等通過依賴于SRP的Sec途徑實現(xiàn)跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運，信號識別依賴于SRP，依賴YidC插入內(nèi)膜，并通過SecYEG跨越內(nèi)膜［32］。長信號肽的N-端延伸區(qū)域在內(nèi)膜靶向和轉(zhuǎn)位中不必要，但可減緩分泌蛋白通過SecYEG的速度，延長跨內(nèi)膜時間，從而保證蛋白的正確折疊［33］。

2.2周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運 Ⅴ型分泌系統(tǒng)的蛋白跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運到周質(zhì)空間后，可與周質(zhì)空間中的分子伴侶，如SurA、Skp、DegP、PpiD、FkpA等結(jié)合，從而完成蛋白的跨周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運。由于蛋白的折疊傾向和氨基酸序列（是否含Sur分子伴侶的特定結(jié)合域）存在差異，Ⅴ型分泌蛋白需要的分子伴侶不同。已有研究表明，Ⅴ型分泌蛋白可在跨內(nèi)膜轉(zhuǎn)運早期募集水母狀三聚體Skp，從而防止蛋白的過早折疊和不當(dāng)相互作用［34］。SurA可在Hbp蛋白分泌中發(fā)揮作用，研究表明，SurA的突變明顯影響Hbp的表達，而Skp和DegP的突變對其表達無影響［35］。而在EspP的分泌過程中，DegP的突變比SurA和Skp的突變更影響EspP的表達。通常認為，DegP可降解定位不正常的自轉(zhuǎn)運蛋白，從而使細菌免受中間體毒性的影響。體外實驗表明，Ag43等蛋白在無分子伴侶的條件下，能夠正常轉(zhuǎn)運進入蛋白脂質(zhì)體中［34-35］。因此，分子伴侶在Ⅴ型分泌蛋白的跨周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運過程所起的作用，還有待進一步研究。

2.3跨外膜轉(zhuǎn)運 之前的假說認為，T5SS可完全自主轉(zhuǎn)運，但晶體結(jié)構(gòu)研究表明，經(jīng)典自主轉(zhuǎn)運蛋白的β-桶狀結(jié)構(gòu)直徑僅10?，只能容納1個α-螺旋或1個發(fā)夾結(jié)構(gòu)通過，使得該觀點受到質(zhì)疑。目前認為，Ⅴ型分泌蛋白的跨外膜轉(zhuǎn)運需包括周質(zhì)空間分子伴侶、BAM復(fù)合體（barrel assembly machinery complex）、Tam等多種蛋白分子的參與，從而構(gòu)成復(fù)雜的轉(zhuǎn)運網(wǎng)絡(luò)。BAM復(fù)合體以BamA為中心蛋白，加之BamB、BamC、BamD、BamE共同構(gòu)成，其中BamA含有的5個POTRA域（polypeptide transport-associated domains）在形成BAM復(fù)合體和轉(zhuǎn)運外來蛋白的過程中發(fā)揮重要作用［36］。Ⅴ型分泌蛋白在周質(zhì)空間中與分子伴侶相互作用形成部分折疊態(tài)，其轉(zhuǎn)運區(qū)域形成的β-桶狀結(jié)構(gòu)插入外膜中，進一步引導(dǎo)乘客區(qū)域的跨外膜轉(zhuǎn)運。

經(jīng)典自轉(zhuǎn)運Ⅴa系統(tǒng)研究較清楚，以EspP為例描述Ⅴa轉(zhuǎn)運過程［14］（圖2）。首先，轉(zhuǎn)運域β-桶狀結(jié)構(gòu)在周質(zhì)空間中部分折疊，并將EspP的連接區(qū)保護在β-桶狀結(jié)構(gòu)中，從而防止蛋白酶切和化學(xué)修飾。定點交聯(lián)技術(shù)表明，在該過程中，分子伴侶Skp結(jié)合在β-桶狀結(jié)構(gòu)上。然后，β-桶狀結(jié)構(gòu)與外膜上的BamA、BamD以及分子伴侶SurA相互作用，使β-桶狀結(jié)構(gòu)折疊為圓筒狀結(jié)構(gòu)插入外膜。之后，乘客區(qū)域以發(fā)夾結(jié)構(gòu)通過BamA和β-桶狀組成的混合型開放通道，并在胞外正確折疊。完成乘客蛋白的轉(zhuǎn)運后，β-桶狀結(jié)構(gòu)閉合成穩(wěn)定狀態(tài)。乘客蛋白進一步加工剪切釋放［37］。另有研究表明，在Ag43和EhaA的轉(zhuǎn)運過程中，外膜蛋白TamA和TamB形成的復(fù)合體發(fā)揮了類似于BAM復(fù)合體的功能［38］。Ⅴc跨外膜轉(zhuǎn)運過程與Ⅴa類似，以YadA為例，其轉(zhuǎn)運需要BAM復(fù)合體的參與，蛋白的三聚化在周質(zhì)空間中完成［39］。目前猜測，反向自轉(zhuǎn)運系統(tǒng)跨外膜轉(zhuǎn)運過程與Ⅴa類似，但尚未被驗證。

圖2 Ⅴa亞型分泌系統(tǒng)跨外膜轉(zhuǎn)運示意圖Fig.2 Model for transmembrane transport of secretion system of subtypeⅤa

雙組分分泌系統(tǒng)的TpsB含有16個β-折疊構(gòu)成的桶狀結(jié)構(gòu)，可作為TpsA轉(zhuǎn)運的通道。以FHA和FhaC為例，F(xiàn)haC插膜后可在周質(zhì)空間形成兩個POTRA域，F(xiàn)HA的N-端TPS域可識別POTRA域，然后完成跨外膜轉(zhuǎn)運。在該過程中，F(xiàn)haC的L6結(jié)構(gòu)通過調(diào)節(jié)桶狀結(jié)構(gòu)的閉合發(fā)揮作用［40］。Ⅴd的C-端結(jié)構(gòu)域與TpsB類似，可將Ⅴd分泌蛋白看作TpsA與TpsB直接相連的融合蛋白，PlpD蛋白的轉(zhuǎn)運過程類似于雙組分分泌系統(tǒng)，不需要BAM復(fù)合體參與。

2.4蛋白釋放 乘客蛋白跨外膜轉(zhuǎn)運后，一部分蛋白不需要酶切釋放，如EstA等共價鍵結(jié)合在β-桶狀蛋白上發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。三聚體自身轉(zhuǎn)運蛋白作為細菌表面黏附素，也不進行切割釋放。而大多數(shù)乘客蛋白被自身或外在酶切割并釋放到細菌外。其中一些切割分離后的蛋白，如AIDA-I和百日咳黏附素Pertactin等，可通過非共價鍵結(jié)合的方式重新定位在細菌表面發(fā)揮作用。根據(jù)切割所需酶的來源，將蛋白的切割釋放分為以下4種方式：①自身桶內(nèi)酶切：腸桿菌科分泌的絲氨酸蛋白酶自轉(zhuǎn)運蛋白（SPATEs），如SigA、Pic等的催化位點位于β-桶狀內(nèi)部連接區(qū)相鄰的兩個天冬酰胺殘基［41］；②自身分子間酶切：分泌到細菌表面的流感嗜血桿菌Hap具有絲氨酸蛋白酶活性，可將相鄰的Hap蛋白切除釋放［42］；③異源蛋白酶切：NalP不僅可催化自身酶切，還可催化App、IgA蛋白酶、AusⅠ的切除釋放［43］；④異源β-桶狀蛋白酶切：IcsA的切除釋放依賴于外膜蛋白酶SopA［44］。

3 基于T5SS的表面展示技術(shù)

G-菌如大腸埃希菌常被用來表達重組蛋白，而重組蛋白在胞內(nèi)大量聚集，不僅不利于蛋白的正確折疊，還會對工程菌造成傷害?；赥5SS的細菌表面展示技術(shù)是利用Ⅴ型分泌蛋白的轉(zhuǎn)運區(qū)域?qū)⑼庠吹鞍走\載到細菌膜表面，從而使重組蛋白有效展示。利用細菌表面展示技術(shù)表達的重組蛋白具有蛋白純化簡便、蛋白折疊完全、活性和可溶性增加、穩(wěn)定性增強的優(yōu)點。最常被用于表面展示的是Ⅴa亞型分泌系統(tǒng)，Ⅴe亞型（intimins）也有部分報道［45］，但未見Ⅴb～d亞型的應(yīng)用。將外源序列插入自轉(zhuǎn)運蛋白序列的方式有兩種，最常用的方式是將外源蛋白替換自轉(zhuǎn)運蛋白的乘客區(qū)域直接融合到β-桶狀蛋白上，另一種是將外源蛋白融合在乘客蛋白全長上或部分外露環(huán)狀區(qū)域上。細菌宿主除了常用的大腸埃希菌外，還可利用沙門菌、鼠傷寒桿菌、發(fā)酵桿菌Z.mobilis和Z.palmae、假單胞桿菌等［46］。T5SS的細菌表面展示技術(shù)應(yīng)用廣泛，可被用于疫苗［47］、全細胞催化劑、生物吸附劑、生物傳感器、重組文庫篩選、生物燃料［48］等多種生物技術(shù)的研發(fā)中［49］。

4 T5SS常用的研究方法

T5SS常用研究方法與其他蛋白類似。通過氨基酸序列的缺失、移位、點突變等研究Ⅴ型分泌蛋白自身組分的性質(zhì)和功能；利用定點光交聯(lián)技術(shù)、體外蛋白脂質(zhì)體等方法研究Ⅴ型分泌蛋白跨膜轉(zhuǎn)運所涉及的輔助蛋白；利用生物信息學(xué)分析可預(yù)測細菌蛋白的分泌機制。其中定點光交聯(lián)技術(shù)作為蛋白相互作用研究的常用技術(shù)，在T5SS中可被用來研究分泌蛋白轉(zhuǎn)運過程中與周圍蛋白的相互關(guān)系。IEVA等［50］利用定點光交聯(lián)的方法發(fā)現(xiàn)在EspP乘客蛋白跨膜移位停止后，檢測到EspP與BamA的蛋白短暫結(jié)合，證明BAM復(fù)合體在β-桶狀蛋白插膜過程和乘客蛋白轉(zhuǎn)運過程中均發(fā)揮作用。該研究還證明了轉(zhuǎn)運過程中EspP的N-端殘基與周質(zhì)空間分子伴侶SurA和Skp的相互作用。另外，NORELL等［51］建立了一種體外實驗方法，用于研究Ⅴ型分泌蛋白的插膜與轉(zhuǎn)運。該方法聯(lián)合使用了蛋白脂質(zhì)體和原生質(zhì)球，在體外實現(xiàn)了Ⅴb亞型FHA和Ⅴa亞型Ag43的有效轉(zhuǎn)運及β-桶狀外膜蛋白的功能性插膜。ABBY等［52］開發(fā)的MacSyFinder可實現(xiàn)細菌蛋白分泌系統(tǒng)在基因?qū)W上的分類預(yù)測。利用信號肽的保守性以及長信號肽的序列特異性，也可預(yù)測未知蛋白的分泌類型。

5 小結(jié)與展望

現(xiàn)有研究初步探討了T5SS的分類、轉(zhuǎn)運過程等，但T5SS十分復(fù)雜多樣。雖然目前已揭示了Ⅴ型分泌過程需要BAM復(fù)合體和分子伴侶的參與，但BAM復(fù)合體具體的組裝過程及在轉(zhuǎn)運中發(fā)揮的具體作用，以及不同分泌蛋白所需分子伴侶的差異，還有待進一步研究。另外，現(xiàn)有研究表明，T5SS轉(zhuǎn)運過程中無需外源提供的ATP和電化學(xué)梯度參與，其轉(zhuǎn)運過程的能量供應(yīng)還需探究。此外，部分Ⅴ型分泌蛋白的結(jié)構(gòu)，尤其是Ⅴd轉(zhuǎn)運區(qū)域的結(jié)構(gòu)尚有待解析。本文主要對T5SS進行了論述，通過對T5SS的深入研究，不僅有助于探討細菌的致病機制，還可為新型抗生素的研發(fā)和T5SS的生物學(xué)應(yīng)用等提供新的思路。