tolC基因?qū)Υ竽c埃希菌膜完整性及中藥單體抗菌活性的影響

摘要：目的 探究大腸埃希菌tolC基因缺失對大腸埃希菌膜完整性及中藥單體抗菌活性的影響。方法 以大腸埃希菌MG1655和DH5α為研究對象，采用Red同源重組法構建tolC敲除菌株；利用N-苯基-1-萘胺（1-N-phenyl-naphtylamine，NPN）法測定大腸埃希菌細胞外膜通透性；通過流式細胞儀結(jié)合熒光染料碘化丙啶（propidium iodide，PI）和DiBAC4（3）考察tolC敲除對大腸埃希菌細胞質(zhì)膜完整性及細胞膜電位的影響；藥物敏感性采用96孔板微量稀釋法檢測。結(jié)果 成功構建大腸埃希菌MG1655和DH5α的tolC敲除及回補菌株；NPN檢測顯示tolC敲除顯著增強大腸埃希菌外膜通透性，表明其結(jié)構受到嚴重損傷；PI和DiBAC4（3）檢測結(jié)果表明tolC敲除不影響大腸埃希菌細胞質(zhì)膜的完整性，但卻降低大腸埃希菌細胞膜電位；藥物敏感性比較分析發(fā)現(xiàn)tolC敲除顯著升高大腸埃希菌對隱丹參酮、血根堿、鹽酸小檗堿、百里酚和香芹酚等中藥單體的敏感性；值得一提的是tolC敲除使大腸埃希菌對隱丹參酮的敏感性最高提升超過128倍，相反acrB敲除不顯著影響大腸埃希菌對隱丹參酮的敏感性，表明TolC缺陷降低大腸埃希菌對隱丹參酮的敏感性可能和外排無關，而和外膜通透性增強有關；和該推測相一致的是，破壞外膜結(jié)構的透化劑能顯著增強隱丹參酮對野生型大腸埃希菌的抗菌活性。結(jié)論 tolC基因缺失不僅影響AcrB等外排泵的外排功能，還增強大腸埃希菌外膜通透性并使膜電位去極化，從而顯著提高大腸埃希菌對隱丹參酮等多種中藥單體的敏感性。

關鍵詞：tolC基因；大腸埃希菌；外膜；固有耐藥性；隱丹參酮

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Influence of the tolC gene on Escherichia coli membrane integrity and antibacterial activity of traditional Chinese medicine monomers

Xue Zhengjie， Liu Shenqin， Shen Haojie， Chen Dongmin， Xu Peixiu， Zhong Siyi， Chen Nipi， and Qian Chaodong

（School of Life Sciences， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053）

Abstract Objective To investigate the effect of tolC gene deletion on Escherichia coli membrane integrity and antibacterial activity of traditional Chinese medicine monomers. Methods E. coli MG1655 and DH5α were used to construct tolC knockout strains by Red homologous recombination. The permeability of the outer membrane of the strain was determined using the NPN method. The effects of tolC knockout on the inner membrane integrity and membrane potential of E. coli were investigated by flow cytometry combined with fluorescent dyes， propidium iodide （PI） and DiBAC4（3）. The drug sensitivity was detected by microdilution method using 96-well plate. Results The tolC knockout strain and tolC complementary strain were successfully constructed. The NPN assay showed that tolC knockout significantly enhanced the outer membrane permeability of E. coli， indicating the structure of the outer membrane was severely damaged. PI and DiBAC4（3） assays indicated that tolC knockout did not affect the integrity of the E. coli cytoplasmic membrane， but dissipated the cell membrane potential. Drug susceptibility analysis revealed that tolC deletion significantly increased the susceptibility of E. coli to herbal monomers， such as cryptotanshinone， sanguinarine， berberine， thymol and carvacrol. It was noteworthy that tolC knockout increased the susceptibility of E. coli to cryptotanshinone up to more than 128-fold. In contrast， acrB knockout did not significantly affect the susceptibility of E. coli to cryptotanshinone. This suggested that TolC defection might reduce the susceptibility of E. coli to cryptotanshinone independently of the efflux effect， potentially through the enhancement of the permeability of the outer membrane. Consistent with this speculation， the outer membrane permeabiliser significantly enhanced the antibacterial activity of cryptotanshinone against wild-type E. coli. Conclusion" " The deletion of the tolC gene not only impacted the efflux function of efflux pumps， such as AcrB， but also enhanced the permeability of the outer membrane of E. coli and depolarized the membrane potential. This resulted in a significant increase in the susceptibility of E. coli to multiple herbal monomers， including cryptotanshinone.

Key words tolC gene; Escherichia coli; Outer membrane; Intrinsic resistance; Cryptotanshinone

大腸埃希菌是臨床上重要的革蘭陰性機會性病原體，可導致多種嚴重的感染性疾病[1-2]。隨著耐藥性的不斷演變，多重耐藥（multidrug resistant，MDR）大腸埃希菌已成為人類和動物健康的一個重要威脅[2]。革蘭陰性菌的一個顯著特征是除細胞質(zhì)膜（內(nèi)膜）外，在細胞壁肽聚糖層外面還存在一個不對稱脂質(zhì)雙分子層，即外膜[3]。內(nèi)、外膜均充當細菌的滲透性屏障，但外膜滲透性低于典型的脂雙層細胞質(zhì)膜，從而賦予革蘭陰性菌對許多抗生素的固有耐藥性。外膜主要由以脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）為主成分的外小葉和類似內(nèi)膜的磷脂內(nèi)小葉兩部分組成。親水性的LPS外小葉可阻擋脂溶性化合物的滲透，而疏水的磷脂內(nèi)小葉則可降低親水性分子的透過效率。此外，蛋白質(zhì)約占外膜質(zhì)量的50%，其中很大一部分是允許小分子物質(zhì)和親水性分子透過的孔蛋白[3-4]；當這些孔蛋白發(fā)生突變，導致其含量下降或結(jié)構發(fā)生變化時，就會降低這些化合物的透過率，從而提高耐藥性[5-7]。

除外膜外，大腸埃希菌的多重耐藥性還歸因于其擁有廣泛特異性抗生素外排系統(tǒng)。由耐藥結(jié)節(jié)分裂（rresistance-nodulation-division，RND）家族外排泵介導的藥物外排是革蘭陰性菌賦予多重耐藥性的重要機制[8]。大多數(shù)RND外排泵由3部分組成，即內(nèi)膜RND轉(zhuǎn)運蛋白，周質(zhì)融合蛋白和外膜通道蛋白[8]。在大腸埃希菌中，已表征的RND外排泵已有7種，包括可排出多種結(jié)構上不相關化合物的AcrB、AcrF、MdtB （YegN）、MdtC （YegO）和YhiV （MdtF），以及具有相對較窄底物識別譜的CusA （YbdE）和AcrD，其中和臨床最相關的多重耐藥外排復合系統(tǒng)是由AcrB與周質(zhì)融合蛋白AcrA以及外膜通道蛋白TolC組成的AcrAB-TolC三組分系統(tǒng)[8-9]。AcrAB–TolC外排泵是大腸埃希菌唯一具有廣泛底物特異性且高水平組成性表達的外排系統(tǒng)[10]，缺失AcrAB-TolC復合物任一相應基因的大腸埃希菌突變體對許多抗生素的敏感性均顯著增加[11]。

和其他革蘭陰性細菌（如銅綠假單胞菌）含有多種外膜通道蛋白不同，大腸埃希菌通常只含有TolC一種外膜通道蛋白[12]。TolC的缺失增加了大腸埃希菌突變體（ΔtolC）對極廣譜抗菌劑的敏感性[11]。TolC的這一功能主要取決于其參與的外排泵活動，不過AcrB缺陷菌株（ΔacrB）和tolC敲除菌株的表型相似但又不完全相同，通常ΔtolC菌株對所測試抗菌劑更加敏感[11]。這種差異可歸因于TolC與其它外排泵的關聯(lián)；然而，除AcrAB外，沒有發(fā)現(xiàn)任何已證實或推定的多重耐藥外排泵與固有耐藥性有關[12]。因此，tolC缺陷菌株對抗生素的敏感性增加很可能還和TolC的其他功能有關。然而，目前相關信息非常有限，有必要加強研究。

鑒于外膜完整性對抗菌劑的滲透作用具有重要作用，而TolC又是一種外膜蛋白，推測TolC敲除可能會影響大腸埃希菌的屏障效應，從而對抗菌劑的抗菌活性施加影響。為此，本研究主要考察了tolC基因敲除對大腸埃希菌內(nèi)、外膜完整性的影響，并通過藥敏實驗測定了不同中藥單體對ΔtolC菌株的敏感性變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

本實驗所用的菌株和質(zhì)粒見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物詳細信息見表2。

1.1.2 主要試劑

SteadyPure質(zhì)粒DNA提取試劑盒，SteadyPure凝膠回收試劑盒，2.5×OK Clon Master Mix酶，購自艾科瑞生物科技有限公司；多黏菌素E硫酸鹽（colistin），購自上海易恩化學技術有限公司；氨芐西林，購自麥克林；卡那霉素，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；L-阿拉伯糖，購自上海皓鴻生物醫(yī)藥科技有限公司；N-苯基-1-萘胺（NPN），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；碘化丙啶（PI），購自北京蘭杰柯科技有限公司；DiBAC4（3）熒光染料，Phe-Arg β-naphthylamide （PAβN），購自上海MedChemExpress；多黏菌素B九肽（Polymyxin B nonapeptide，PMBN），購自上海宏葉生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 tolC基因敲除菌株構建

根據(jù)Red同源重組法敲除大腸埃希菌的tolC基因，原理如圖1所示。首先使用熱激法將pKD46質(zhì)粒導入到大腸埃希菌MG1655、DH5α感受態(tài)細胞中，獲得MG1655-pKD46、DH5α-pKD46菌株。將MG1655-pKD46和DH5α-pKD46菌株過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至新的含有100 μg/mL氨芐西林抗性的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600=0.2，加入終濃度為30 mmol/L的L-阿拉伯糖，繼續(xù)培養(yǎng)至A600=0.5。將菌液冰浴30 min，4 ℃，5000 r/min

條件下離心10 min。棄上清，菌體中加入5 mL預冷的10%甘油重懸，重復3次，最終用200 μL的10%甘油重懸菌體，分裝每管100 μL，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。設計含有tolC基因上下游同源臂序列的擴增引物FRT-F1/FRT-R1，以pKD4為模板，PCR擴增含有tolC基因同源臂的卡那霉素抗性基因的打靶片段。將10 μL約800 ng的打靶片段與MG1655-pKD46、DH5α-pKD46的感受態(tài)細胞混合后放入電轉(zhuǎn)杯中冰浴30 min，加入到預冷的電擊杯中，冰上靜置10 min后進行電擊轉(zhuǎn)化，電擊參數(shù)如下：電壓2.5 kV，電阻200 Ω，時間4.8 ms。電擊后，加入900 μL SOC培養(yǎng)基30 ℃復蘇1.5 h，5000 r/min離心5 min去部分上清，剩余部分重懸涂布到含有50 μg/mL卡那霉素抗性的LB固體平板上。30 ℃培養(yǎng)過夜后用菌落PCR鑒定被卡那霉素抗性基因替換了的tolC敲除突變菌株。挑取陽性克隆，在42 ℃條件下傳代培養(yǎng)以消除溫敏型質(zhì)粒pKD46。然后，用熱激法將pCP20質(zhì)粒導入pKD46消除的突變菌株中，30 ℃培養(yǎng)過夜后用菌落PCR和測序鑒定卡那霉素抗性基因被去除的tolC敲除菌株。最后將驗證成功的單菌落轉(zhuǎn)接于LB液體培養(yǎng)基42 ℃過夜培養(yǎng)以消除溫敏型質(zhì)粒pCP20，最終獲得無痕的tolC基因敲除菌株MG1655ΔtolC和DH5αΔtolC。

1.2.2 構建回補菌株

設計引物tolC-F/R，以大腸埃希菌基因組為模板，擴增tolC基因片段。設計引物pBR322-F3/R3，以質(zhì)粒pBR322為模板，擴增線性化質(zhì)粒pBR322載體片段（反應體系：加入2 μL模板PBR322質(zhì)粒、2 μL引物pBR322-F3、2 μL引物pBR322-R3、25 μL高保真PCR酶Mix、19 μL ddH2O，共50 μL；反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次，72 ℃終延伸10 min），使用2.5×OK Clon Master Mix酶將tolC基因片段、線性化質(zhì)粒pBR322連接，取5 μL連接產(chǎn)物熱激導入大腸埃希菌HST08感受態(tài)細胞，涂布到含有100 μg/mL氨芐西林抗性的LB固體平板上。37 ℃培養(yǎng)過夜后菌落PCR鑒定重組質(zhì)粒是否構建成功。在HST08細胞中擴大質(zhì)粒數(shù)量后，提取pBR322-tolC質(zhì)?；匮a到MG1655ΔtolC、DH5αΔtolC，獲得回補菌株MG1655ΔtolC：： tolC、DH5αΔtolC：： tolC。

1.2.3 NPN法測定外膜通透性

NPN法測定外膜通透性參考文獻[13]。將過夜培養(yǎng)的大腸埃希菌按1：50接種量轉(zhuǎn)接到新鮮MH培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)至A600=0.5。5000 r/min離心5 min收集菌體。用PBS緩沖液洗滌菌體兩次后，用同樣緩沖液重懸至A600=1.0，分裝于1.5 mL離心管中，每管1 mL，每個樣品分兩管。在一管菌液中加入終濃度為40 μmol/L的NPN染料，另取一管菌液加入終濃度為40 μmol/L的NPN染料和終濃度為100 μg/mL的colistin，以作為外膜被100%破壞的陽性對照；迅速混勻后加入黑色96孔板中孵育不同時間，然后用熒光分光光度計測量熒光強度，激發(fā)和發(fā)射波長分別為350和420 nm。

1.2.4 PI法測定細胞質(zhì)膜通透性

從平板上挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)過夜；取5%的菌液轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期；用新鮮LB調(diào)節(jié)菌液濃度至A600=0.2，分裝于1.5 mL離心管中，每管1 mL，8000 r/min離心5 min，菌體用無菌生理鹽水洗滌、重懸；加入終濃度為30 μmol/L的PI室溫避光孵育15 min。使用流式細胞儀進行檢測，激發(fā)波長492 nm，發(fā)射波長635 nm。以50 μg/mL的colistin處理菌體30 min的樣品為大腸埃希菌內(nèi)膜被破壞的陽性對照。

1.2.5 DiBAC4（3）法測定膜電位

從平板上挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基37 ℃過夜培養(yǎng)；取5%的菌液轉(zhuǎn)接于新鮮LB培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期；用新鮮LB調(diào)節(jié)菌液濃度至A600=0.2，分裝于1.5 離心管中，每管1 mL，8000 r/min離心5 min，菌體用無菌生理鹽水洗滌、重懸，加入終濃度為10 μmol/L的DiBAC4（3）室溫避光孵育30 min。使用流式細胞儀進行檢測，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長520 nm。以10 μg/mL的Colistin處理菌體30 min的樣品為大腸埃希菌膜電位被破壞的陽性對照。

1.2.6 最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration， MIC）測定

采用96孔板微量稀釋法測定MIC。將待測樣品用無菌MH培養(yǎng)基稀釋成一定濃度，取200 μL加入96孔板第一孔中，后面各孔中先加入100 μL MH培養(yǎng)基；從第一孔中取出100 μL加入下一孔，混勻后再取出100 μL加入下一孔，以此類推，至第7孔為止，取出100 μL棄去；然后在各孔中加入經(jīng)適當稀釋培養(yǎng)過夜菌液100 μL （接種量約為5×105），混勻，置于37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，測A600值，同時采用肉眼觀察，以完全抑制待測菌生長的最低濃度為該化合物的MIC。每個藥物稀釋度做3孔平行，并以無菌MH液體培養(yǎng)液為空白對照。

1.2.7 生長曲線測定

將培養(yǎng)過夜的待測菌株按1：100的比率接種到新鮮LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長中期（A600約為0.5左右）后稀釋A600約為0.2左右；取該菌液用新鮮LB液體培養(yǎng)基稀釋100倍，加到96孔板中，每孔200 μL，每個菌3個重復；隨后將96孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，期間每隔一定時間測定其吸光值（A600）。以A600值為縱軸，時間（h）為橫軸，繪制生長曲線。

1.2.8 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)的輸入工作是通過Excel軟件實現(xiàn)的。隨后，利用GraphPad Prism 8.0.2軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。為了評估不同組別間的差異是否具有統(tǒng)計學意義，采用了單因素方差分析（ANOVA）方法。若P值小于0.05，則認為兩組或多組間的差異具有統(tǒng)計學上的顯著性。

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希菌ΔtolC敲除菌株的構建

采用菌落PCR篩選被卡那霉素抗性基因替換了tolC基因的陽性克隆。由圖2可知，菌落①～③分別用引物對tolC-F0/R0和tolC-F2/R2擴增的條帶與理論長度561和395 bp相符，表明這些菌落中的tolC已被卡那霉素抗性基因替換掉。進一步導入pCP20質(zhì)粒以消除插入的卡那霉素抗性基因，然后用菌落PCR進行陽性克隆篩選。由圖3可知，菌落⑤～⑦用引物對tolC-F0/R2擴增出與理論長度相符的662 bp長度的條帶，表明插入這些菌株基因組中的卡那霉素抗性基因已被去除；測序結(jié)果進一步證明大腸埃希菌基因組中原先tolC基因序列已被敲除后殘存的FRT序列替換（圖4），從而獲得卡那抗性基因去除的大腸埃希菌MG1655ΔtolC菌株。采用同樣的方法獲得了大腸埃希菌DH5αΔtolC菌株。

2.2 回補菌株ΔtolC：： tolC的構建

采用分別對應tolC基因和pBR322質(zhì)粒交界兩側(cè)的兩對引物（圖5），進行陽性克隆篩選。由圖6可知，3和4兩個菌落分別用引物對322C-F4/R4和322C-F5/R5擴增出的條帶與理論長度905和1030 bp相符，表明成功構建大腸埃希菌MG1655ΔtolC：： tolC和大腸埃希菌DH5αΔtolC：： tolC菌株，并被命名為MG1655CΔtolC和DH5αCΔtolC。

2.3 tolC敲除對大腸埃希菌生長的影響

由圖7可知，在所測試條件下，tolC基因的敲除對大腸埃希菌MG1655的生長無明顯影響；出人意料的是，tolC基因缺失對DH5α的生長非但無害，反而有利于該菌生長。將96孔板換成搖瓶進行的生長曲線測定獲得類似的結(jié)果，表明tolC基因的缺失在所測試條件下對大腸埃希菌的生長無不良影響。

2.4 tolC敲除對大腸埃希菌外膜通透性的影響

革蘭陰性菌對許多抗生素具有內(nèi)在的耐藥性，這在很大程度上是由于這些微生物存在外膜所造成的低滲透屏障作用?？紤]到TolC是一種重要的外膜通道蛋白，據(jù)此推測tolC基因的敲除很可能影響大腸埃希菌的外膜通透性。NPN是一種常用于檢測細菌外膜完整性的熒光探針，當大腸埃希菌細胞外膜的結(jié)構受到損傷、通透性增強的時候，NPN的攝取就會升高，相應的熒光信號則會增強。由圖8可知，兩株tolC敲除大腸埃希菌的NPN熒光值均顯著高于親緣菌株，且呈時間依賴性，表明TolC蛋白缺失嚴重破壞大腸埃希菌外膜結(jié)構的完整性，從而使其通透性增強。tolC基因回補后NPN熒光值隨之降低到和親緣菌株相同或相近，進一步證明ΔtolC菌株外膜通透性的增強是由TolC蛋白缺失造成的。

2.5 tolC敲除對大腸埃希菌細胞質(zhì)膜完整性的影響

除外膜外，細胞質(zhì)膜也賦予細菌細胞穩(wěn)定性并充當滲透屏障?？紤]到tolC敲除嚴重破壞大腸埃希菌外膜結(jié)構完整性，有必要考察TolC缺失是否同樣會對細胞質(zhì)膜造成影響。為此，又測定了tolC敲除對大腸埃希菌膜電位和細胞質(zhì)膜完整性的影響。DiBAC4（3）是一種檢測細胞膜電位的親脂性陰離子熒光染料，本身無熒光。當膜電位發(fā)生去極化時，DiBAC4（3）就會進入細菌胞內(nèi)，并與胞漿內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，從而使熒光顯著增強。如圖9A所示，和親緣菌株相比，兩株tolC敲除大腸埃希菌的DiBAC4（3）熒光顯著增強，而將tolC回補后，其熒光強度又顯著下降，表明tolC敲除使大腸埃希菌的膜電位發(fā)生了去極化。tolC敲除對大腸埃希菌細胞質(zhì)膜完整性的影響結(jié)果如圖9B所示，和親緣菌株MG1655和DH5α相比，tolC敲除和回補菌株的PI熒光強度均無明顯變化，表明tolC敲除對大腸埃希菌細胞質(zhì)膜的結(jié)構不會造成嚴重損傷。作為陽性對照，經(jīng)膜結(jié)構破壞劑colistin處理后的野生型大腸埃希菌無論是DiBAC4（3）還是PI的熒光強度均顯著增強，表明上述實驗結(jié)果是可信的。

2.6 tolC敲除對不同中藥單體藥物敏感性的影響

雖然較多文獻已報道tolC敲除會顯著影響大腸埃希菌對許多抗生素的敏感性，但是很少有人測定tolC敲除對植物源抗菌劑活性的影響。為此，考察了tolC敲除菌株對多種常用抗菌中藥單體的藥物敏感性。由表3～4可知，和親緣菌株MG1655和DH5α相比，兩株tolC敲除菌株對隱丹參酮、血根堿、鹽酸小檗堿、百里酚、香芹酚和紅霉素的敏感性均顯著升高（MIC變化≥4倍），tolC基因回補后則又恢復大腸埃希菌對這些化合物的耐藥性；相反，tolC敲除或回補都不顯著影響大腸埃希菌對松蘿酸、EGCG、檜木醇和卡那霉素的敏感性（MIC變化≤2倍）。考慮到TolC是大腸埃希菌中最重要的外排泵AcrAB-TolC的重要組成部分，測定了這些抗菌劑對acrB敲除菌株的敏感性。由表3～4可知，和野生型親緣菌株相比，acrB敲除顯著提高大腸埃希菌對血根堿、鹽酸小檗堿和紅霉素的敏感性（≥4倍），但對其他化合物則無明顯影響。這些結(jié)果表明，隱丹參酮對tolC敲除大腸埃希菌敏感性的提升最高超過128倍，遠高于其它中藥單體，且其抗菌活性不受acrB敲除的影響，值得進一步研究。

2.7 外膜透化劑對隱丹參酮抗菌活性的影響

由表3～4可知，tolC敲除顯著增強野生型大腸埃希菌對隱丹參酮的敏感性，但acrB敲除則無此影響；結(jié)合tolC敲除顯著破壞大腸埃希菌的外膜通透性，推測野生型大腸埃希菌之所以對隱丹參酮表現(xiàn)出極高的固有耐藥性很可能和其具有完整的外膜結(jié)構有關，如果用物理或化學手段破壞大腸埃希菌的外膜結(jié)構，應該能增強隱丹參酮對野生型大腸埃希菌的抗菌活性。為此，測定了多黏菌素B九肽（PMBN），一種公認的革蘭陰性桿菌外膜結(jié)構破壞劑[14-15]，對隱丹參酮抗菌活性的影響。由表5結(jié)果可知，隱丹參酮單獨使用時，對大腸埃希菌MG1655和DH5α兩株野生型菌株的MIC均大于128 μg/mL；當與PMBN聯(lián)用時，隱丹參酮對這兩株大腸埃希菌的MIC分別下降到8和1 μg/mL；相反，經(jīng)典的AcrB外排泵抑制劑PAβN[16]不能顯著增強隱丹參酮對大腸埃希菌的敏感性。作為對照，紅霉素對大腸埃希菌的活性同時受到PMBN和PAβN的顯著影響（表5），這與文獻報道的紅霉素是外排泵AcrB良好底物的結(jié)論[17-18]相一致。

3 結(jié)論

革蘭陰性菌對許多抗生素具有固有耐藥性，這在很大程度上是由于外膜的滲透性屏障以及三組分外排泵的存在。外膜限制藥物進入細胞，外排泵則主動清除進入胞內(nèi)的藥物，這兩種機制之間存在自然的協(xié)同作用[19-20]。TolC既是大腸埃希菌最重要的三組分外排系統(tǒng)AcrAB-TolC的組成部分，也是一種外膜蛋白。先前的研究大多側(cè)重于TolC在外排中所起的作用，較少關注其對外膜功能的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，tolC敲除不僅影響AcrB的外排功能，還極大破壞大腸埃希菌外膜的結(jié)構完整性及滲透屏障功能。此外，還發(fā)現(xiàn)tolC敲除雖然不影響大腸埃希菌細胞質(zhì)膜的通透性，但是卻導致大腸埃希菌細胞膜的去極化，這可能和tolC敲除會抑制大腸埃希菌NADH脫氫酶活性[21]有關。值得一提的是，細胞膜電位下降意味能量合成不足，進而干擾外排泵對藥物的外排，因為包括AcrB在內(nèi)的許多外排泵都是能量依賴性的[22]。和AcrB主要參與外排作用不同，TolC從多個方面影響大腸埃希菌的耐藥性，這也許就是大腸埃希菌ΔtolC菌株比ΔacrB菌株對許多抗菌劑更加敏感的原因。

由表3～4可知，tolC敲除顯著增強隱丹參酮、血根堿、鹽酸小檗堿和紅霉素等抗菌劑對大腸埃希菌的抗菌作用。不過，和血根堿、鹽酸小檗堿和紅霉素等AcrB良好底物不同，隱丹參酮對大腸埃希菌的抗菌活性幾乎不受acrB敲除的影響，表明tolC缺失顯著提高大腸埃希菌對隱丹參酮的藥物敏感性可能和外排無關，而主要和外膜通透性增強有關。和該推測相一致的是，外膜結(jié)構破壞劑PMBN使隱丹參酮對兩株野生型大腸埃希菌MG1655和DH5α的MIC從大于128 μg/mL分別下降到8和1 μg/mL（表5）；而AcrB外排泵抑制劑PAβN對隱丹參酮的抗菌活性幾乎無任何影響（表5）。這些結(jié)果表明，外膜低滲透性屏障是造成野生型大腸埃希菌對隱丹參酮固有耐藥性的一個重要原因。

多重耐藥菌株的日益流行，迫切需要對與醫(yī)院感染相關的革蘭陰性菌具有活性的新型抗菌藥物。然而，自50年前喹諾酮類藥物問世以來，臨床上再沒有出現(xiàn)過一種對革蘭陰性菌有特效的新型抗生素[23]。革蘭陰性菌固有的強大的外膜和外排屏障是開發(fā)針對這些物種新藥的主要障礙。一個有效策略是增強數(shù)量眾多的抗革蘭陽性菌藥物在這些物種中的累積。具體方法可以對現(xiàn)有抗菌劑進行結(jié)構改造，以使其能夠穿透革蘭陰性菌外膜屏障并避免被泵出[24]；也可以與PMBN之類的外膜透化劑聯(lián)用以達到增效作用。許多中藥單體如隱丹參酮對革蘭陽性菌具有較強作用，但通常對革蘭陰性菌作用較弱。本研究發(fā)現(xiàn)破壞外膜屏障功能顯著增強多種中藥單體對大腸埃希菌的抗菌效果，值得后續(xù)進一步研究。

總之，本研究結(jié)果表明，tolC基因缺失顯著增強大腸埃希菌外膜通透性，并使膜電位去極化，這是TolC除參與外排泵功能外的和大腸埃希菌固有耐藥性有關的另一生理功能。本研究深化了TolC對大腸埃希菌生理作用，同時也加深了部分中藥單體對大腸埃希菌抗菌活性的理解。

參 考 文 獻

Walker M M， Roberts J A， Rogers B A， et al. Current and emerging treatment options for multidrug resistant E. coli urosepsis： A review[J]. Antibiotics （Basel）， 2022， 11（12）： 1821.

Murray C J L， Ikuta K S， Sharara F， et al. Global burden of bacterial antimicrobial resistance in 2019： A systematic analysis[J]. Lancet， 2022， 399（10325）： 629-655.

Maher C， Hassan K A. The Gram-negative permeability barrier： Tipping the balance of the in and the out[J]. mBio， 2023， 14（6）： e0120523.

Jaros?awski S， Duquesne K， Sturgis J N， et al. High-resolution architecture of the outer membrane of the Gram-negative bacteria Roseobacter denitrificans[J]. Mol Microbiol， 2009， 74（5）： 1211-1222.

Bajaj H， Scorciapino M A， Moynié L， et al. Molecular basis of filtering carbapenems by porins from β-lactam-resistant clinical strains of E. coli[J]. J Biol Chem， 2016， 291（6）： 2837-2847.

Yang F C， Yan J J， Hung K H， et al. Characterization of ertapenem-resistant Enterobacter cloacae in a Taiwanese university hospital， China[J]. J Clin Microbiol， 2012， 50（2）： 223-226.

Oteo J， Delgado-iribarren A， Vega D， et al. Emergence of imipenem resistance in clinical E. coli during therapy[J]. Int J Antimicrob Agents， 2008， 32（6）： 534-537.

Li X Z， Plésiat P， Nikaido H. The challenge of efflux-mediated antibiotic resistance in Gram-negative bacteria[J]. Clin Microbiol Rev， 2015， 28（2）： 337-418.

Anes J， Mccusker M P， Fanning S， et al. The ins and outs of RND efflux pumps in E. coli[J]. Front Microbiol， 2015， 6： 587.

Ciusa M L， Marshall R L， Ricci V， et al. Absence， loss-of-function， or inhibition of E. coli AcrB does not increase expression of other efflux pump genes supporting the discovery of AcrB inhibitors as antibiotic adjuvants[J]. J Antimicrob Chemother， 2022， 77（3）： 633-640.

Sulavik M C， Houseweart C， Cramer C， et al. Antibiotic susceptibility profiles of E. coli strains lacking multidrug efflux pump genes[J]. Antimicrob Agents Chemother， 2001， 45（4）： 1126-1136.

Zgurskaya H I， Krishnamoorthy G， Ntreh A， et al. Mechanism and function of the outer membrane channel TolC in multidrug resistance and physiology of Enterobacteria[J]. Front Microbiol， 2011， 2： 189.

MacNair C R， Stokes J M， Carfrae L A， et al. Overcoming mcr-1 mediated colistin resistance with colistin in combination with other antibiotics[J]. Nat Commun， 2018， 9（1）： 458.

Vaara M. Polymyxin derivatives that sensitize Gram-negative bacteria to other antibiotics[J]. Molecules， 2019， 24（2）： 249.

Wesseling C M J， Martin N I. Synergy by perturbing the gram-negative outer membrane： Opening the door for Gram-positive specific antibiotics[J]. ACS Infect Dis， 2022， 8（9）： 1731-1757.

Alenazy R. Drug efflux pump inhibitors： A promising approach to counter multidrug resistance in Gram-negative pathogens by targeting AcrB protein from AcrAB-TolC multidrug efflux pump from Escherichia coli[J]. Biology （Basel）， 2022， 11（9）： 1328.

Dai J S， Xu J， Shen H J， et al. The induced and intrinsic resistance of Escherichia coli to sanguinarine is mediated by AcrB efflux pump[J]. Microbiol Spectr， 2024， 12（1）： e0323723.

Ciusa M L， Marshall R L， Ricci V， et al. Absence， loss-of-function， or inhibition of Escherichia coli AcrB does not increase expression of other efflux pump genes supporting the discovery of AcrB inhibitors as antibiotic adjuvants[J]. J Antimicrob Chemother， 2022， 77（3）： 633-640.

Nikaido H. Prevention of drug access to bacterial targets： Permeability barriers and active efflux[J]. Science， 1994， 264（5157）： 382-388.

Krishnamoorthy G， Leus I V， Weeks J W， et al. Synergy between active efflux and outer membrane diffusion defines rules of antibiotic permeation into Gram-negative bacteria[J]. mBio， 2017， 8（5）： e01172-17.

Dhamdhere G， Zgurskaya H I. Metabolic shutdown in E. coli cells lacking the outer membrane channel TolC[J]. Mol Microbiol， 2010， 77（3）： 743-754.

Webber M A， Piddock L J. The importance of efflux pumps in bacterial antibiotic resistance[J]. J Antimicrob Chemother， 2003， 51（1）： 9-11.

Hoffman P S. Antibacterial discovery： 21st century challenges[J]. Antibiotics （Basel）， 2020， 9（5）： 213.

Mu?oz K A， Hergenrother P J. Facilitating compound entry as a means to discover antibiotics for Gram-negative bacteria[J]. Acc Chem Res， 2021， 54（6）： 1322-1333.