動(dòng)物源性大腸埃希菌超廣譜β—內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)及耐藥性研究

周敬綱

[摘要] 目的 了解動(dòng)物源性大腸埃希菌超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的檢出率和耐藥特點(diǎn)，為其耐藥性的安全評(píng)價(jià)提供依據(jù)。 方法 采用NCCLS推薦的表型檢測(cè)法和確認(rèn)試驗(yàn)測(cè)定大腸埃希菌ESBLs，紙片擴(kuò)散法測(cè)定大腸埃希菌的耐藥性。 結(jié)果 222株大腸埃希菌對(duì)環(huán)丙沙星（83.78%）、諾氟沙星（92.79%）、利福平（81.08%）的耐藥率很高；對(duì)阿米卡星、亞胺培南高度敏感。ESBLs檢出率為12.16%（27/222），產(chǎn)ESBLs菌株除對(duì)亞胺培南外其余13種抗生素的耐藥率均高于非產(chǎn)ESBLs菌株。 結(jié)論 動(dòng)物源性大腸埃希菌對(duì)很多抗生素具有一定的耐藥性，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食品中動(dòng)物源性大腸埃希菌耐藥性的監(jiān)測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 大腸埃希菌；動(dòng)物源食品；耐藥性

[中圖分類號(hào)] R378.2+1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）12（b）-0008-04

食品安全是全世界普遍關(guān)注的問題，其關(guān)系到人民群眾的身體健康和生命安全。近年來(lái)，由于抗生素的濫用，出現(xiàn)越來(lái)越多的耐藥菌株，且耐藥譜越來(lái)越廣[1]，對(duì)感染性疾病的臨床治療構(gòu)成威脅。大腸埃希菌是食品污染監(jiān)測(cè)的主要指標(biāo)菌，是人類和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，具有致病性，條件致病性和非條件致病性等多樣性特點(diǎn)，臨床上，大腸埃希菌引起感染的現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，耐藥菌株不斷增多，其中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（extended spectrum beta-lactamases，ESBLs）大腸埃希菌是對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的主要病原菌。在動(dòng)物源性食品的加工過程中，很容易受到大腸埃希菌的污染，并傳遞給人類，因此對(duì)動(dòng)物源性大腸埃希菌耐藥性和ESBLs檢測(cè)具有重要意義。本文通過對(duì)食品污染風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)中由動(dòng)物源性食品中分離到的大腸埃希菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，了解本地動(dòng)物源性食品中大腸埃希菌的耐藥性和ESBLs的產(chǎn)生情況，為臨床抗生素應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2011年6月～2013年9月食品污染風(fēng)險(xiǎn)檢測(cè)中源自雞源、豬源、牛源食品中的大腸埃希菌222株，其中雞肉源72株，雞蛋源53株、豬肉源82株、牛肉源10株、生牛奶源5株。

1.2 菌株的分離程序

1.2.1 樣品的稀釋 取動(dòng)物源食品25 g放入盛有225 ml磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min制成1∶10的樣品勻液。調(diào)pH值至6.5～7.5。用1 ml無(wú)菌吸管吸取1∶10樣品勻液1 ml，沿管壁緩緩注入9 ml磷酸鹽的緩沖液，混勻，制成1∶100的樣品勻液。根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成10倍遞增系列稀釋樣品勻液。

1.2.2 初發(fā)酵試驗(yàn) 選擇3個(gè)適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液，每個(gè)稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1 ml，（36±1） ℃培養(yǎng)（24±2） h，產(chǎn)氣管進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)。

1.2.3 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中取培養(yǎng)物1環(huán)，移種于已提前預(yù)溫至45℃的EC肉湯管中，放入帶蓋的（44.5±0.2） ℃水浴箱內(nèi)，水浴的水面應(yīng)高于肉湯培養(yǎng)基液面，培養(yǎng)（24±2） h，產(chǎn)氣管，進(jìn)行EMB平板分離培養(yǎng)。

1.2.4 EMB平板分離 用接種環(huán)取培養(yǎng)物劃線接種于EMB平板，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h，挑取具黑色中心有金屬光澤或無(wú)金屬光澤的典型菌落進(jìn)行鑒定。

1.2.5 鑒定 IMViC實(shí)驗(yàn)，選取結(jié)果為﹢﹢﹣﹣、﹣﹢﹣﹣、﹢﹢﹣﹢、﹣﹢﹣﹢的目標(biāo)菌落進(jìn)行ESBLs檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)。

1.3 ESBLs檢測(cè)

ESBLs表型檢測(cè)方法，采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）推薦的標(biāo)準(zhǔn)紙片瓊脂擴(kuò)散法，確認(rèn)試驗(yàn)采用雙紙片法，抗生素為頭孢他定30 μg，頭孢他定/克拉維酸30 μg/10 μg，頭孢噻肟30 μg，頭孢噻肟/克拉維酸30 μg/10 μg。培養(yǎng)基為M-H瓊脂。結(jié)果判讀：任何一種藥物在加入克拉維酸后，抑菌圈直徑與不加入克拉維酸的抑菌圈相比增大值≥5 mm，判斷為產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌。

1.4 藥敏試驗(yàn)

采用VITEK32細(xì)菌鑒定儀對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，紙片擴(kuò)散法（K-B法）進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏試驗(yàn)質(zhì)控菌株為大腸埃希菌（ATCC25922）?？股剡x擇如下。青霉素類：氨芐西林（AMP）；頭孢菌素類：頭孢噻吩（CFT）、頭孢曲松（CTX）；氨基糖苷類：慶大霉素（GEN）、阿米卡星（AMK）；四環(huán)素類：四環(huán)素（TET）、強(qiáng)力霉素（DOTC）；氯霉素類：氯霉素（CHL）；磺胺類：甲氧芐啶（TRI）；甲氧芐啶/磺胺甲唑（SXT）；喹諾酮類：環(huán)丙沙星（CIP）、諾氟沙星（NOR）；碳青霉烯類：亞胺培南（IPM），其他：利福平（RIF）。試驗(yàn)結(jié)果按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

222株大腸埃希菌對(duì)CIP（83.78%）、NOR（92.79%）、RIF（81.08%）的耐藥率很高；對(duì)GEN（32.43%）、SXT（12.16%）耐藥率較高；對(duì)AMP（9.01%）、CFT（6.31%）、CTX（4.95%）、TET（7.21%）、DOTC（4.50%）、CHL（5.41%）、TRI（3.60%）的耐藥率介于3.60%～9.01%；對(duì)AMK（0.90%）、IPM（0.00%）高度敏感。豬肉源和牛肉源大腸埃希菌對(duì)GEN的耐藥率相對(duì)較高，達(dá)到60.98%、100.00%（表1）。

表1 動(dòng)物性食品源大腸埃希菌對(duì)14種抗生素的耐藥率[株（%）]

2.2 動(dòng)物性食品源大腸埃希菌ESBLs檢測(cè)結(jié)果

222株大腸埃希菌中ESBLs檢出率為12.16%（27/222）。樣品ESBLs分布：雞肉源12.5%（9/72），雞蛋源11.3%（6/53）、豬肉源12.2%（10/82）、牛肉源10.0%（1/10）、生牛奶源20.0%（1/5）。

2.3 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率的比較

除IPM外，產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)其他13種抗菌藥物的耐藥率均明顯高于非產(chǎn)ESBLs菌株（P<0.05）（表2）。

表2 產(chǎn)與非產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌耐藥率的比較 [株（%）]

3 討論

大腸埃希菌為革蘭氏陰性短桿菌，是人和動(dòng)物腸道中的正常棲居菌，分為致病性大腸埃希菌和非致病性大腸埃希菌，后者又稱為普通大腸埃希菌，是人和動(dòng)物腸道中兼性厭氧正常菌群的優(yōu)勢(shì)菌種，通常對(duì)機(jī)體無(wú)害。當(dāng)在外界環(huán)境發(fā)生變化、機(jī)體免疫力下降或其他病原菌感染等條件下，可引起繼發(fā)感染。隨著對(duì)其所致疾病研究的增多，發(fā)現(xiàn)其所致感染性疾病居各種常見細(xì)菌性感染疾病的首位[2]，由于抗生素濫用，近年來(lái)動(dòng)物和人類大腸埃希菌的耐藥性逐漸增高[3]，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)過程中，無(wú)論抗菌藥物是作為治療用還是作為促生長(zhǎng)劑用，在抗菌藥物的選擇性壓力下，腸道細(xì)菌很易產(chǎn)生耐藥性變化[4-6]。

研究表明動(dòng)物源性大腸埃希菌的耐藥率與養(yǎng)殖場(chǎng)抗菌藥的使用劑量、頻率存在很強(qiáng)的相關(guān)性[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)物源性食品大腸埃希菌對(duì)動(dòng)物常用抗生素CIP、NOR、RIF的耐藥率很高，達(dá)到81.08%～92.79%；對(duì)AMP、CFT、CTX、TET、DOTC、CHL、TRI的耐藥率介于3.60%～9.01%；對(duì)AMK和IPM高度敏感。與人類臨床大腸埃希菌耐藥性不盡相同[8-10]，耐藥性CIP、RIF高于臨床，敏感性IPM、AMK與臨床相似，其余抗生素臨床分離大腸埃希菌菌株的耐藥性要高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果。研究表明動(dòng)物源性食品分離的大腸埃希菌已對(duì)多種抗生素具有一定的耐藥性，提示動(dòng)物臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，有針對(duì)性地使用，同時(shí)要首選不容易誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的藥物，而且必須經(jīng)常更換抗生素種類，以免產(chǎn)生新的耐藥菌株。

ESBLs是一類能水解廣譜青霉素，第三代頭孢菌素及單環(huán)β-內(nèi)酰胺酶類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，使產(chǎn)酶菌在有β-內(nèi)酰胺酶抗生素存在條件下能繼續(xù)生存，但對(duì)碳青霉烯類及酶類抑制劑敏感。另外，產(chǎn)ESBLs菌不僅對(duì)第三代頭孢菌素和氨曲南耐藥，而且對(duì)氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類抗菌藥物也可交叉耐藥，所以產(chǎn)ESBLs細(xì)菌的治療已成為臨床上一大難題，其耐藥基因可以通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等形式在同種屬，甚至不同種屬間傳遞，造成耐藥性在細(xì)菌間傳播[11]，給臨床感染的控制帶來(lái)困難。雖然本試驗(yàn)ESBLs檢測(cè)結(jié)果（12.16%）低于臨床菌株（41.42%～69.2%）[8-10，12]，但說(shuō)明在動(dòng)物源性食品中大腸埃希菌具有一定的ESBLs菌株，應(yīng)引起重視。產(chǎn)ESBLs菌株對(duì)除IPM外其余13種抗生素的耐藥率高于非產(chǎn)ESBLs菌株（P<0.05），與臨床相似[8]，表現(xiàn)為ESBLs陽(yáng)性菌較ESBLs陰性菌具有較高耐藥性[13]。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，動(dòng)物源性大腸埃希菌對(duì)很多抗生素已具有一定的耐藥性。盡管目前尚無(wú)有力證據(jù)證明動(dòng)物源性食品耐藥大腸埃希菌菌株可以通過食物鏈誘發(fā)人體疾病，但是攝入人體的動(dòng)物性食品源耐藥大腸埃希菌菌株把人體腸道作為臨時(shí)寄居地，很可能把耐藥基因轉(zhuǎn)移至人體腸道正常菌群中，這種耐藥基因在細(xì)菌間傳播，是多重耐藥病原菌不斷產(chǎn)生的重要原因[11，14]，腸道菌群，尤其是大腸埃希菌在溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)密度大，被認(rèn)為是食源性腸道病原菌多重耐藥基因的主要儲(chǔ)存庫(kù)[15]，攜帶耐藥基因的大腸埃希菌與共生的沙門菌、致病性大腸埃希菌及其他腸道病原菌通過可移動(dòng)基因元件的轉(zhuǎn)移進(jìn)行基因物質(zhì)的交換[16-18]，使各種藥物敏感菌產(chǎn)生耐藥性，甚至引起“超級(jí)細(xì)菌”的產(chǎn)生，有報(bào)道顯示，自鏈霉素作為助長(zhǎng)劑應(yīng)用于畜牧生產(chǎn)時(shí)，大腸埃希菌中出現(xiàn)控制耐藥性可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，這種質(zhì)粒曾在豬、飼養(yǎng)員及其家人分離的大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)，也在人群腸道分離的大腸埃希菌中被發(fā)現(xiàn)[19]，但這些人群從未與養(yǎng)豬場(chǎng)接觸，只是住同一地區(qū)[20]，這提示耐藥菌質(zhì)?？梢詮膭?dòng)物性食品以食物鏈的方式傳入人體。

總之，作為大腸埃希菌耐藥性菌株產(chǎn)生的主要來(lái)源之一，應(yīng)加強(qiáng)動(dòng)物源性食品大腸埃希菌的耐藥性檢測(cè)，為相關(guān)從業(yè)者和部門提供參考依據(jù)，減少動(dòng)物源性食品作為耐藥病原菌的潛在“蓄水池”。

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（收稿日期：2014-10-09 本文編輯：李亞聰）