大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源微顆粒的提取及鑒定

馬瑞君，王苗苗，封啟龍

1.山西醫(yī)科大學生理學系細胞生理學教育部重點實驗室，山西太原030001；

2.山西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，山西太原030001

近年來，干細胞（stem cells，SCs）治療心血管疾病受到關注，SCs不僅具有自我更新能力，而且可分化成一種或多種類型的終末細胞。研究表明［1］，間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）進入體內(nèi)后可通過分化為心肌細胞治療心肌梗死，但近年來研究發(fā)現(xiàn)［2-3］，MSCs體積較大，易堵塞血管，進入體內(nèi)后在靶點的富集程度不高，分化為靶細胞的數(shù)量較少，而且有促進腫瘤生長與轉移的風險。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)，MSCs的旁分泌功能在疾病的治療過程中起重要作用［4-6］，MSCs可通過分泌內(nèi)皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）和堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等發(fā)揮對心血管的保護作用。研究發(fā)現(xiàn)［7］，細胞還可通過釋放胞外囊泡發(fā)揮細胞間的信息傳遞功能。胞外囊泡分為外泌體（exo，exosome）和微顆粒（microparticles，MPs）［8］，外泌體是通過細胞內(nèi)吞作用形成多胞體后，向細胞外釋放的直徑為10～100 nm的膜性囊泡，其形成過程較復雜；而MPs則是直接從細胞膜上脫落下的直徑為0.1～1μm的小囊泡，其中包含miRNA、mRNA以及蛋白質(zhì)等生物活性分子，MPs的表面帶有與其來源細胞類似的表面標記。MPs在最初被發(fā)現(xiàn)時，人們認為其為無功能的細胞“塵?！保?］，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，MPs參與了細胞通訊過程，MPs由一層脂質(zhì)雙分子層包裹而成，其中攜帶的生物活性分子可通過膜融合的方式作用于靶細胞，使其包裹的miRNA等生物活性分子進入細胞內(nèi)發(fā)揮作用。

本研究分離并純化大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bone mesenchymal stem cell，BMSCs），并在此基礎上成功分離骨髓間充質(zhì)干細胞來源的微顆粒（bone marrow mesenchymal stem cell-derived microparticles，BMSCMPs），旨在為下一步對MPs的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級SD大鼠，5周齡，體重（100±10）g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2015-0001。本實驗對SD大鼠的所有處理均以科研為目的進行養(yǎng)殖和使用，且按照山西醫(yī)科大學動物倫理相關規(guī)定進行［SCXK（晉）2015-0001］。

1.2主要試劑及儀器 DME／F-12培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；FBS購自賽澳美細胞技術（北京）有限公司；胰蛋白酶消化液和青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司；流式抗體FITCanti-rat CD29、FITC anti-rat CD90、PE anti-rat CD34、PE antirat CD45以及同型對照抗體FITC-IgG1和PE-IgG1均購自美國BioLegend公司；流式校準珠購自美國Spherotech公司；成骨成脂培養(yǎng)基購自賽業(yè)生物科技有限公司；其余試劑購自武漢博士德生物工程有限公司；細胞培養(yǎng)瓶等耗材購自無錫耐思生物科技有限公司。

1.3B M S C s的分離、培養(yǎng)和純化 采用全骨髓貼壁法分離BMSCs。取1只SD大鼠，雌雄不限，脊椎脫臼法處死，迅速置于75%酒精中浸泡15 min，取出后將大鼠置于無菌手術布上，并迅速剪開雙后肢皮膚，分離肌肉，盡量將脛骨和股骨附著的肌肉分離干凈，然后將股骨和脛骨置于預冷的無菌PBS溶液中，移入無菌操作臺，剪開骨骺端，用含10%FBS的DME／F-12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，收集沖洗液，179×g離心5 min，棄上清，向沉淀內(nèi)加入含10%FBS的DME／F-12培養(yǎng)基重懸后，接種至1個T25細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，48 h后首次換液，細胞融合率達90%左右時用胰酶消化傳代。顯微鏡下觀察BMSCs的形態(tài)。

1.4B M S C s生長曲線的繪制 取生長旺盛的第5代BMSCs，按8×103個／孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h后第1次計數(shù)，以后每隔24 h計數(shù)1次，共計數(shù)8 d。每次隨機選取3孔計數(shù)，取平均值，以時間為橫坐標，細胞數(shù)量為縱坐標繪制BMSCs的生長曲線。

1.5B M S C s表面標記的鑒定 采用流式細胞術。取第5代融合率達90%左右的BMSCs，加入不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化2 min，再加入等體積培養(yǎng)基稀釋胰酶，將細胞懸液179×g離心5 min，收集細胞，用預冷的PBS洗滌2次后，紗布過濾細胞懸液，試驗組在室溫下分別加入FITCanti-rat CD29、FITCanti-rat CD90、PEanti-ratCD34和PEanti-rat CD45，同型對照組分別加入同型對照流式抗體FITC-IgG1和PE-IgG1，各組避光孵育30 min后，用PBS洗去未結合抗體，使用流式細胞儀上機檢測。

1.6B M S C s成脂和成骨誘導分化 取第5代BMSCs，按2×105個／孔接種于6孔板內(nèi)，待細胞融合率達90%時開始誘導分化。在無菌條件下嚴格按照SD大鼠BMSCs成骨誘導分化培養(yǎng)基和成脂誘導分化培養(yǎng)基說明書要求混合各培養(yǎng)基，每隔48 h更換新鮮培養(yǎng)基；自分化對照組使用含10%FBS的DME／F-12培養(yǎng)基，培養(yǎng)基內(nèi)不添加誘導分化因子。各組連續(xù)培養(yǎng)21 d后進行染色，染色前使用多聚甲醛固定細胞30 min，成骨誘導分化組及其自分化組使用茜素紅染色，成脂誘導分化組及其自分化組使用油紅O染色，染色30 min后用PBS洗去染色液，顯微鏡下觀察。

1.7B M S C-M Ps的提取 取第5代BMSCs，待細胞生長至80%～90%時，棄去舊培養(yǎng)基，加入不含血清的DME／F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，血清饑餓48 h后收集上清液，采用梯度離心法獲取BMSC-MPs：300×g離心10 min，取上清液，棄沉淀，去除殘余細胞；2 500×g離心20 min，取上清液，棄沉淀，去除凋亡小體和細胞碎片；18 000×g離心1 h，棄上清，加入經(jīng)0.1μm無菌濾器過濾過的PBS，重懸沉淀，此時獲得較純的MSC-MPs，封口膜封口后置于超低溫冰箱備用。

1.8B M S C-M Ps的流式計數(shù) 按照流式細胞儀校準珠說明書進行，使用1.35、0.88、0.45、0.22μm校準珠設定流式細胞儀檢測的門。取新鮮提取的BMSC-MPs，在流式管內(nèi)加入390μL Buffer液（NaCl 140.0mmol／L，HEPES10.0mmol／L，CaCl23.0mmol／L，用1.0 mmol／L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.40），Buffer液先使用0.1μm無菌濾器過濾，再加入10μL BMSCMPs，充分混勻后用流式細胞儀低速上機檢測1 min，得到落在門內(nèi)MPs的數(shù)量。根據(jù)剩余液體體積等數(shù)據(jù)計算MPs數(shù)量，計算時需減去空白對照組中的顆粒數(shù)。BCA法檢測BMSC-MPs蛋白濃度。

1.9B M S C-M Ps的表面抗原鑒定 與BMSCs的表面抗原鑒定類似，試驗組取BMSC-MPs，室溫下分別加入FITC anti-rat CD29、FITC anti-rat CD90、PE antirat CD34、PE anti-rat CD45，同型對照組分別加入同型對照流式抗體FITC-IgG1和PE-IgG1，各組避光孵育30 min后，用PBS洗去未結合抗體，使用流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1B M S C s的形態(tài) 從大鼠股骨和脛骨內(nèi)提取的第0代BMSCs大小和形態(tài)各異；但第0代細胞經(jīng)10 d左右換液后，較小的紅細胞和其他雜細胞的數(shù)量逐漸減少，BMSCs呈現(xiàn)出典型的“紡錘樣”和“魚群狀”排列；BMSCs在傳代后生長速度顯著增快，6～7 d融合率即可達90%左右，隨著BMSCs的換液與傳代，BMSCs的純度逐漸升高。見圖1。

圖1 大鼠BMSCs的形態(tài)學特征Fig.1 Morphological characteristics of rat BMSCs

2.2B M S C s的生長曲線BMSCs在接種后的24 h內(nèi)生長速度緩慢；第2～7天生長速度顯著增快，表現(xiàn)為生長曲線呈“S”型，細胞呈指數(shù)速度生長；第7天細胞數(shù)量接近飽和，生長速度顯著降低，達平臺期。見圖2。

圖2 第5代BMSCs的生長曲線Fig.2 Growth curve of BMSCs of passage 5

2.3B M S C s的表面標記 流式細胞術檢測結果顯示，第5代BMSCs表面標志物CD29和CD90陽性率分別為（99.90±0.66）%和（99.81±0.94）%，CD45和CD34陽性率分別為（0.89±0.31）%和（1.79±0.33）%，表明隨著換液和傳代，BMSCs內(nèi)混有的雜細胞數(shù)量逐漸減少，第5代BMSCs純度較高。見圖3。

圖3 流式細胞術檢測第5代BMSCs的表面標記物表達情況Fig.3 Flow cytometry of surface markers of BMSCs of passage 5

2.4B M S C s的成骨成脂誘導分化 顯微鏡下觀察可見，成骨誘導分化第21 d，細胞分泌生成的骨結節(jié)可被茜素紅染成紅色；成脂誘導分化第21天，細胞內(nèi)的脂滴可被油紅O染成紅色。見圖4。

圖4 BMSCs誘導分化后染色觀察Fig.4 Staining of BMSCs after induced differentiation

2.5B M S C s的流式細胞術計數(shù) 流式細胞儀檢測結果顯示，BMSC-MPs的平均數(shù)目為（2.55±0.86）×107個／mL，見圖5。BMSC-MPs的蛋白濃度為（289.36±12.58）μg／mL。2.6B M S C-M Ps的表面標記鑒定 流式細胞儀檢測結果表明，BMSC-MPs表面標記CD90和CD29陽性率分別為（97.46±1.85）%和（94±2.03）%，CD45和CD34陽性率分別為（4.89±1.05）%和（1.81±0.33）%，呈現(xiàn)出與BMSCs相似的表面標記特征。見圖6。

圖5 BMSC-MPs的流式細胞儀計數(shù)Fig.5 Counting of BMSC-MPs by flow cytometer

圖6 流式細胞術分析BMSC-MPs表面抗原的表達Fig.6 Flow cytometry of expression of surface markers of BMSC-MPs

3 討論

BMSCs是一類具有自我更新能力的細胞，F(xiàn)RIDENSHTEíN等［10］在1968年首次發(fā)現(xiàn)BMSCs，其來源于胚胎時期的中胚層，是一類增殖力較強的細胞。BMSCs具有易于獲取，生物活性穩(wěn)定等優(yōu)點，并可分化為骨、脂肪、軟骨和心肌等多種類型的細胞。本研究采用全骨髓貼壁法法獲取BMSCs，通過流式細胞術檢測表明，BMSCs高表達CD29和CD90，低表達CD45和CD34，且具有分化為成骨成脂細胞的能力，符合國際細胞治療協(xié)會（International Society for Cellular Therapy，ISCT）對MSCs的鑒定標準［11］。

目前的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs除可通過釋放一些細胞因子發(fā)揮作用外，還可釋放胞外囊泡發(fā)揮細胞間的通訊作用［12］。BMSCs釋放的胞外囊泡分為外泌體和MPs，外泌體的釋放過程較為復雜，是細胞通過內(nèi)吞作用在細胞內(nèi)依次形成早期核內(nèi)體、晚期核內(nèi)體以及多泡體，再與細胞膜融合后釋放［13］；而MPs則是直接從細胞膜上“出芽”形成的小囊泡，有研究表明，細胞MPs的釋放與細胞內(nèi)Ca2+水平和細胞膜表面磷酯酰絲氨酸的外翻有關［14-15］。

MPs的提取目前尚無標準方案，常用的方法是梯度離心法，使用不同的離心力逐步將細胞碎片、凋亡小體去除，最后高速離心即可分離出MPs［16］。由于MPs是由細胞上出芽生成的膜性囊泡，因此，MPs囊泡膜上往往攜帶來源于細胞的表面標志。本研究采用流式細胞術結合熒光染色鑒定了BMSCs的表面標志蛋白分子，證實所獲取的MPs絕大多數(shù)（94%以上）來自BMSCs的釋放。通過采用流式細胞術檢測MPs數(shù)量及BCA法檢測MPs內(nèi)蛋白含量間接對BMSC-MPs進行了定量。

本研究在成功分離純化了BMSCs的基礎上，通過梯度離心法獲得了BMSC-MPs，并利用其表面標志進行了鑒定，為后續(xù)研究BMSC-MPs的功能奠定了基礎。