實(shí)驗(yàn)室水平單克隆抗體制備方法及相應(yīng)純化策略的研究進(jìn)展

徐夢(mèng)蔚，宋武琦 綜述，付治美，張鳳民 審校

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室伍連德研究所黑龍江省免疫與感染重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黑龍江省普通高校病原生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱150081

抗體又稱免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig），產(chǎn)生抗體是體液免疫系統(tǒng)的主要功能之一，抗體分子直徑約為10 nm［1-2］。在胎盤哺乳動(dòng)物中，抗體亞型包括IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，5種亞型抗體在生物學(xué)特性、功能及在體內(nèi)分布位置（如IgE類抗體主要與肥大細(xì)胞和嗜堿細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)合）均有所不同［3］，目前對(duì)IgG類抗體研究較多。天然的抗原分子刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗體含有針對(duì)不同抗原表位的多種抗體，即多克隆抗體，其特異性較低。單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）是由單一B細(xì)胞產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，其克服了多克隆抗體特異性較低的缺點(diǎn)。mAb已廣泛應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫分析、免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)等醫(yī)學(xué)診斷技術(shù)；并可作為親和層析中重要的配體用于蛋白質(zhì)的提純；也可與化療藥物或放療物質(zhì)連接，利用mAb的導(dǎo)向作用，直接殺傷靶細(xì)胞，用于腫瘤導(dǎo)向治療。mAb的純度是其產(chǎn)品重要的質(zhì)量指標(biāo)之一，不同方法制備的mAb需根據(jù)其物理化學(xué)屬性（等電點(diǎn)、分子量、疏水性等）來選擇不同的純化步驟，去除不同的雜質(zhì)，以滿足實(shí)驗(yàn)需求。本文就實(shí)驗(yàn)室水平的mAb制備方法及去除制備過程中產(chǎn)生污染物相應(yīng)純化策略的研究進(jìn)展作一綜述。

1 實(shí)驗(yàn)室水平制備mAb的方法

廣義上講，mAb生產(chǎn)是指產(chǎn)生特異性抗體的整個(gè)過程，包括免疫原制備、免疫、雜交瘤生產(chǎn)、篩選和純化過程；狹義上講，mAb生產(chǎn)僅指mAb生產(chǎn)及純化的步驟，不包括復(fù)雜的免疫原制備、篩選等步驟。隨著mAb生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展，存在多種用于抗體生產(chǎn)的方法，本文僅對(duì)實(shí)驗(yàn)室水平的雜交瘤技術(shù)及基因工程技術(shù)2種mAb制備方法進(jìn)行簡(jiǎn)介。

1.1雜交瘤技術(shù) 1975年，英國(guó)科學(xué)家Cesar Milstein和法國(guó)科學(xué)家George Kohler將鼠源的B淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞［4］，雜交瘤細(xì)胞既具有B細(xì)胞的抗體生產(chǎn)及分泌功能，又具有腫瘤細(xì)胞的無限增殖功能。雜交瘤技術(shù)是通過采用特異性抗原免疫動(dòng)物，獲得能夠分泌特異性mAb的B細(xì)胞，隨后體外融合B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞，選擇性培養(yǎng)和克隆化篩選出能夠產(chǎn)生特異性mAb的雜交瘤細(xì)胞，并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集培養(yǎng)基上清進(jìn)行純化，從而獲得抗體；或在動(dòng)物體內(nèi)注射雜交瘤細(xì)胞、收集動(dòng)物體液（腹水、血清等）后進(jìn)行純化，從而獲得抗體［5］。雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的mAb特異性較高，且易于大量生產(chǎn)，已成為基礎(chǔ)生物學(xué)研究和臨床醫(yī)學(xué)必不可少的方法。盡管目前已有其他多種技術(shù)（如體外展示技術(shù)）用于mAb生產(chǎn)，但雜雜瘤技術(shù)仍是實(shí)驗(yàn)室水平制備mAb的首選方法，該方法也應(yīng)用于針對(duì)新型冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）相關(guān)抗體的研究［6］。有研究表明，組合展示庫可作為一種替代雜交瘤技術(shù)的mAb生產(chǎn)平臺(tái)，但目前許多mAb最初仍是在小鼠或人源化小鼠中采用雜交瘤技術(shù)發(fā)現(xiàn)的［7］。

1.2基因工程技術(shù) 基因工程技術(shù)主要通過將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞使其分泌相應(yīng)的mAb，該技術(shù)可在體外重組制備mAb，產(chǎn)生特異性極高的mAb，生產(chǎn)速度更快，使用該方法制備人源化mAb更便捷，可確保其臨床應(yīng)用的用量充足。目前，由于糖基化的需要，用于生產(chǎn)治療性IgG類mAb的主要宿主是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如中國(guó)倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO）、人胚胎腎細(xì)胞（HEK293）、骨髓瘤細(xì)胞（NS0）、人視網(wǎng)膜細(xì)胞（PERC6）［8］。有研究表明，基因工程技術(shù)通常在CHO及其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系產(chǎn)生的早期階段發(fā)揮作用，整合其他多種互補(bǔ)的方法有助于優(yōu)化和推進(jìn)單種方法無法實(shí)現(xiàn)的聚糖圖譜［9］。

抗體片段為IgG經(jīng)蛋白酶水解所形成的片段，是目前研究和臨床中使用的新型抗體樣分子，與mAb比較，其分子直徑更小，但具有相似的高親和力，更易穿透組織，發(fā)揮藥效。酵母和細(xì)菌細(xì)胞是生產(chǎn)各種抗體片段的良好宿主，在各種細(xì)菌宿主中，E.coli是生產(chǎn)抗體片段和抗原結(jié)合片段（antigenbinding fragment，F(xiàn)ab）的主要菌種［10］。與哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)比較，E.coli系統(tǒng)用于生產(chǎn)抗體片段更加快速，且生產(chǎn)過程中不存在外源性物質(zhì)（adventitious agents）污染的問題，避免了病毒去除及相應(yīng)的驗(yàn)證步驟［11］。

mAb或抗體片段通常是從天然（雜交瘤技術(shù)）或重組體系（基因工程技術(shù)）中提取的，不同方法制備的mAb會(huì)產(chǎn)生不同的雜質(zhì)，不同的分子純度要求將影響樣品處理和純化步驟的選擇，見表1。

表1 不同方法制備mAb或抗體片段的相關(guān)信息Tab.1 Data on mAb or antibody fragments prepared by various methods

2 實(shí)驗(yàn)室水平mAb的純化步驟

體內(nèi)研究通常需將mAb的純度控制在95%以上，一些高劑量研究中，純度需提高至99%，因此，mAb的純化對(duì)于后續(xù)相關(guān)研究尤為重要。雜交瘤細(xì)胞系培養(yǎng)上清液的污染物主要由培養(yǎng)基成分組成，如生長(zhǎng)因子、激素和轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TRF）；腹水樣品中可能含有宿主抗體、蛋白酶、核酸酶、核酸和病毒等污染物。上述兩種樣品均可能存在雜交瘤的其他分泌物（如細(xì)胞因子）和細(xì)菌污染，細(xì)菌還會(huì)分泌內(nèi)毒素。基因工程方法收集的上清污染物主要來源于宿主，需要依據(jù)不同制備方法和采用不同培養(yǎng)基及其相應(yīng)污染物來選擇合適的純化步驟。

2.1常規(guī)純化 親和層析法是利用偶聯(lián)親和配基的親和吸附介質(zhì)為固定相親和吸附目標(biāo)產(chǎn)物，使目標(biāo)產(chǎn)物得到分離純化的液相層析法，已廣泛應(yīng)用于mAb的分離和純化，通常使用的層析介質(zhì)均為天然蛋白［14］，主要包括天然蛋白A（Protein A）、天然蛋白G（Protein G）和天然蛋白L（Protein L）3種細(xì)菌蛋白，其抗體結(jié)合特性明確，如Protein L可與抗體輕鏈結(jié)合，常用來純化一些抗體片段。CHEN等［15］對(duì)Protein L純化方法進(jìn)行了優(yōu)化，提高了純化效率，該方法在實(shí)驗(yàn)室水平上是可用的。Protein A和Protein G主要通過與Ig的Fc區(qū)相互作用，結(jié)合大多數(shù)哺乳動(dòng)物的IgG，可用于多種抗體的分離純化［16］。Protein A和Protein G與不同物種及不同Ig亞類的結(jié)合特性不同，Protein G的親和力更廣泛，是從大多數(shù)哺乳動(dòng)物中分離Ig的首選方法［17］，如采用Protein G對(duì)人源IgG3的純化效果更好。MENG等［18］通過Protein A一步純化獲取了抗Sema3FC-末端結(jié)構(gòu)域的單克隆抗體（monoclonal antibody against the C-terminal domain of Sema3F，Sema3Fc mAb），該抗體純度較高。目前，也有研究表明，Protein A和Protein G一步純化法可用于雙特異性抗體的研發(fā)［19］。

另外，Protein A／G也具有許多缺點(diǎn)［20］，如對(duì)宿主細(xì)胞蛋白、DNA和其他細(xì)胞來源雜質(zhì)的非特異性結(jié)合；洗脫抗體需較低的pH（2.5~4.0），可能改變mAb的生物活性，導(dǎo)致mAb聚集及Protein A／G從色譜柱中漏出混入洗脫樣品；費(fèi)用高、載量低、線性流速有限等。目前，已有研究探尋新的mAb純化方法，如ISHIHARA等［21］使用活性炭（activated carbon）代替Protein A親和層析純化mAb，單獨(dú)使用活性炭純化mAb的回收率低于Protein A，經(jīng)進(jìn)一步工藝優(yōu)化后，mAb回收率有所提高；另有研究將短肽仿生親和色譜作為一種新型抗體分離色譜，有望成為Protein A色譜的潛在替代品，經(jīng)短肽仿生親和色譜純化獲得mAb的純度高達(dá)93%，回收率達(dá)84.7%［22］。但也有學(xué)者仍認(rèn)為，Protein A具有較大的應(yīng)用潛力，嘗試通過改進(jìn)柱體再生策略來延長(zhǎng)Protein A樹脂的壽命，提高其使用效率［23］。

Protein A／G一步純化后抗體純度可達(dá)85%以上，若有更高的純度要求，需選擇性添加預(yù)處理、精純等步驟，純化步驟的選擇及操作順序均將影響抗體的產(chǎn)量及純度。NI等［24］采用Protein A親和色譜一步純化抗Plaa1 mAb，經(jīng)SDS-PAGE分析表明，其抗體純度完全能夠滿足實(shí)驗(yàn)室水平需求。KATEJA等［20］采用非Protein A純化平臺(tái)，即陽離子交換色譜（cation exchange chromatography，CEX）-多峰色譜（multimodal chromatography）-陰離子交換色譜（anionexchange chromatography，AEX）純化了3種mAb，工藝收率達(dá)70%~80%，宿主蛋白殘留<100 ppm，DNA殘留<10 ppb，總聚集物含量<1%。

2.2預(yù)處理 雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)基樣品及基因工程轉(zhuǎn)染后收集的細(xì)胞上清中均含有細(xì)胞、細(xì)胞碎片、脂質(zhì)和凝結(jié)物質(zhì)等大顆粒，會(huì)在隨后的純化中引起膜結(jié)垢（membrane fouling）現(xiàn)象，因此在常規(guī)純化前采用離心法結(jié)合0.45μm過濾，獲得適合層析的澄清液體，即收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液（harvested cell culture fluid，HCCF）。由于HCCF濃度可能不足，特別是采用低分泌細(xì)胞系生產(chǎn)mAb時(shí)，可通過超濾或透析法對(duì)樣品進(jìn)行濃縮。對(duì)預(yù)處理樣品中大量白蛋白、TRF和其他大量可溶雜質(zhì)，可使用硫酸銨沉淀法進(jìn)行去除，隨著硫酸銨濃度的增加，不同抗體在不同濃度時(shí)析出，從而去除可溶雜質(zhì)。

脫鹽是預(yù)處理步驟之一，不僅用于去除低分子量污染物（如鹽），還用于不同色譜步驟前后緩沖液的交換及快速去除試劑以終止反應(yīng)?？刹捎秒x子交換層析（ionexchange chromatography，IEX）或疏水層析（hydrophobic interaction chromatography，HIC）進(jìn)行鹽析［25］。每增加一個(gè)步驟均會(huì)使mAb產(chǎn)量降低，且脫鹽會(huì)稀釋樣品，因此僅在必要時(shí)進(jìn)行脫鹽步驟。對(duì)于親和層析和離子交換層析，改變pH及離子強(qiáng)度較重要，必要時(shí)可進(jìn)行脫鹽，以降低溶液的離子強(qiáng)度。苯酚紅（phenol red）是一種在實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)中的pH指示劑，在純化過程中可能結(jié)合至某些純化介質(zhì)上，應(yīng)盡可能除去，可通過AEX去除。

2.3病毒的清除 病毒清除率通常以對(duì)數(shù)下降值（log reduction value，LRV）表示。在mAb純化過程中可通過pH處理和熱處理進(jìn)行病毒滅活或清除，如辛酸能使包膜病毒完全失活［26］。另外，一些常見的層析步驟也有助于提高病毒清除率［27-28］，如陰離子交換色譜和多模式陰離子交換色譜介質(zhì)的流穿步驟，病毒清除量可達(dá)4~5個(gè)LRV，疏水層析通?？色@得相同數(shù)值的清除率；親和層析和陽離子交換色譜也有助于去除病毒，清除量一般可達(dá)2~3個(gè)LRV［28-29］。

2.4多聚體的去除 mAb的聚集體會(huì)影響其生物活性、免疫原性及藥代動(dòng)力學(xué)，因此，單體純度是mAb質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)之一，也是在臨床前體內(nèi)研究中作為候選藥物的關(guān)鍵參數(shù)。當(dāng)?shù)鞍诐舛容^高或存在于低pH及高鹽濃度條件下時(shí)，單體易聚集成雙體或多聚體，這些聚集體能夠顯著降低mAb的生物活性［30-31］。分子排阻色譜（size exclusion chromatography，SEC）也稱為凝膠過濾（gel filtration，GF），是在實(shí)驗(yàn)室水平上除去聚集體常用的手段，通常作為抗體純化的最后一個(gè)步驟［32］。ZHANG等［33］比較了不同色譜類型樹脂的多聚體去除能力，其中Capto MMCImpRes和Capto adhere可有效去除多聚體。

2.5核酸及內(nèi)毒素的去除 內(nèi)毒素是一類由脂質(zhì)和多糖組成的大分子，來源于革蘭陰性菌的外膜，可引起強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，因此，限制mAb產(chǎn)品中內(nèi)毒素的水平極為重要。核酸和內(nèi)毒素常以聚體存在，經(jīng)Protein A／G親和純化后，內(nèi)毒素水平通常較高，較難以單一方法一次性去除，可根據(jù)其與抗體性質(zhì)的多方面的差別，充分利用預(yù)處理、多聚體去除等步驟逐步去除，盡量避免額外加入專門用于去除核酸及內(nèi)毒素的步驟。膜過濾／超濾是常用的去除核酸及內(nèi)毒素的方法，速度快，通用性強(qiáng)，但只能去除與抗體分子量差異較大的核酸、內(nèi)毒素分子。AIEX速度快、載量高，但某些電荷不外露的高聚體核酸及內(nèi)毒素，無法結(jié)合陰離子交換柱，因此不能去除［34］。許多mAb屬于堿性蛋白質(zhì)，可在合適的pH下結(jié)合陽離子交換柱，使核酸和內(nèi)毒素流穿，從而去除。內(nèi)毒素、核酸在HIC的高鹽條件下會(huì)凝集，上樣時(shí)直接穿透，從而去除［35］。另外，目前市面上有部分內(nèi)毒素親和介質(zhì)，其缺乏普適性，具有樣品失活的風(fēng)險(xiǎn)，且價(jià)格昂貴，親和介質(zhì)的配體會(huì)脫落，需增添額外的步驟去除，影響mAb的產(chǎn)量，需慎重使用［36］。目前，mAb生產(chǎn)工藝一般在最后一步采用GF去除多聚體的同時(shí)，除去殘留的核酸及內(nèi)毒素。

2.6精純 Protein A／G親和層析一步純化可獲得純度達(dá)85%~95%以上的mAb，但部分對(duì)純度要求較高的mAb需進(jìn)行進(jìn)一步精純。根據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2020版）［37］的要求，人用mAb除了需確保純度外，還需驗(yàn)證使用的純化方法有效去除污染物的同時(shí)保留目標(biāo)產(chǎn)物，并能有效去除或滅活病毒。

對(duì)于更高程度的純化或一步親和純化無合適配基的情況，必須使用包括捕獲、中度純化和精制（capture，intermediate purification，polishing，CIPP）在內(nèi)的純化策略，研發(fā)有效地多步精純步驟（如離子交換色譜，疏水色譜和尺寸排阻色譜）去除抗體聚集體和片段，可提高單體純度。對(duì)在緩沖液中易形成新聚集體的抗體，在精制過程中會(huì)形成新聚集體，這種情況需更換防止新聚集體形成的配方緩沖液。精純步驟常用的方法包括AEX、CEX、HIC、羥基磷灰石層析（hydroxylapatite，HAP）和GF［17，38］，其中AEX和HIC采用流穿模式，CEX和HAP采用結(jié)合-洗脫模式，這些方法主要用于去除聚集體、宿主蛋白、宿主核酸及脫落的Protein A／G［11］。精純一般采用兩步層析以保持足夠的純化冗余，經(jīng)典mAb精純步驟采用流穿的AEX和結(jié)合-洗脫的CEX兩步［39］，對(duì)具有基本等電點(diǎn)（isoelectric point，PI）的mAb，CEX甚至可作為初始捕獲步驟［20］。但越來越多的公司開始采用一步精純的工藝來提高收率和純化速度，降低成本。如SINGH等［40］在Protein A層析后，使用了合成吸附雜交過濾器（synthetic adsorptive hybrid filter，AHF），改進(jìn)了精純過程相關(guān)的雜質(zhì)去除和病毒清除步驟，實(shí)現(xiàn)了一步精純。

3 小結(jié)與展望

多數(shù)實(shí)驗(yàn)室利用Protein A／G來捕獲抗體，并利用至少1個(gè)IEX作為精純步驟，僅少數(shù)工藝使用了HIC、HAP和GF等步驟，對(duì)于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)來說，通過Protein A／G制得的mAb可滿足基本實(shí)驗(yàn)需求。若需要進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，則需合理選擇添加預(yù)處理、精純等步驟，最終純化策略的選擇取決于特定的實(shí)驗(yàn)需求，根據(jù)純化技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn)和每個(gè)步驟開始或結(jié)束時(shí)樣品的條件，選擇純化技術(shù)的合理組合。但每增加一個(gè)純化步驟，抗體的收率就會(huì)隨之降低，當(dāng)抗體純度達(dá)到較高水平時(shí)，伴隨的是極低的回收率，此時(shí)可能需擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)室規(guī)?；蜻M(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，以獲得所需量的mAb。

目前，大量關(guān)于mAb的研究仍采用Protein A／G進(jìn)行純化，該方法是實(shí)驗(yàn)室水平純化的金標(biāo)準(zhǔn)，但也有許多研究在Protein A／G純化的基礎(chǔ)上進(jìn)行了優(yōu)化，隨著各種技術(shù)的發(fā)展，人們也在不斷探索Protein A／G的替代方法，包括色譜及非色譜純化，未來隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，mAb純化步驟將會(huì)更簡(jiǎn)化，成本也會(huì)隨之降低。