免疫原性細胞死亡及其在腫瘤治療應(yīng)用中的研究進展

楊穎綜述，馬雁冰審校

1.昆明醫(yī)科大學(xué) 研究生院，云南 昆明650500；

2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650000

近年，腫瘤免疫療法已成為腫瘤研究和臨床應(yīng)用的熱點，且發(fā)展迅速。免疫原性細胞死亡（immunogenic cell death，ICD）作為一種癌細胞特殊的死亡形式受到了較多關(guān)注，相關(guān)研究主要集中在探討如何將誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生ICD應(yīng)用于抗腫瘤治療中。ICD是細胞死亡的一種形式，通過釋放腫瘤相關(guān)抗原（tumor associated antigen，TAA）和腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen，TSA），暴露“危險信號”以刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答［1-2］，其特點是釋放和／或增加表達損傷相關(guān)的分子模式（danger associated molecular patterns，DAMPs）、前體抗原炎性細胞因子和炎性介質(zhì)［2］。主要的DAMPs包括三磷酸腺苷（adenosinetriphosphate，ATP）、鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group boxprotein B1，HMGB1）、熱休克蛋白（heatshockprotein，HSP）、Ⅰ型干擾素（typeⅠinterferon，IFNⅠ）和膜聯(lián)蛋白1（Annexin 1，ANXA1）等，繼而激活和募集抗原遞呈細胞（antigen-presenting cells，APCs）后活化T細胞，產(chǎn)生針對腫瘤抗原的適應(yīng)性免疫應(yīng)答［3-4］，DAMPs與模式識別受體（pattern recognition receptors，PRRs）結(jié)合引起一系列免疫事件。

目前腫瘤臨床免疫治療的挑戰(zhàn)主要是，腫瘤細胞的低免疫原性、腫瘤抑制性免疫微環(huán)境的存在和腫瘤形成的一系列免疫逃逸機制使機體的免疫系統(tǒng)無法發(fā)揮正常的抗腫瘤作用。ICD由于其可產(chǎn)生免疫原性、可在腫瘤內(nèi)免疫激活、可實現(xiàn)多重腫瘤抗原釋放等特點，有望為抗腫瘤免疫治療提供新的思路及策略。

1 ICD相關(guān)分子

1.1AT P ATP是細胞直接能源物質(zhì)，但在ICD過程中，瀕死的腫瘤細胞會釋放ATP至細胞外，起到內(nèi)源性危險信號的作用。有研究認為，自噬與ICD細胞釋放高水平的ATP有關(guān)，但自噬促進ATP分泌的確切分子機制尚未明確［5］。ATP的釋放涉及到細胞死亡前激活自噬、細胞凋亡、溶酶體胞吐作用等一系列復(fù)雜過程［6］。腫瘤細胞釋放的胞外ATP作為一個“發(fā)現(xiàn)我”的信號，具有招募、激活A(yù)PCs和炎性體通路的雙重作用。釋放至胞外的ATP與APCs（尤其是dendritic cells，DCs）上的P2X7與P2Y2嘌呤能受體結(jié)合，刺激其表型成熟和介導(dǎo)強大的趨化性［7］。胞外的ATP還會激活caspase-1依賴性NLRP3復(fù)合物炎癥小體，引發(fā)白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）的分泌［7］，產(chǎn)生的IL-1β可促使γδT細胞產(chǎn)生IL-17，作用于細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic Tlymphocytes，CTLs），從而產(chǎn)生IFNγ介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)［8］。另外，胞外ATP也會刺激DCs和巨噬細胞釋放促炎細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumour necrosisfactor-α，TNF-α）、IL-1β和IL-18，產(chǎn)生殺傷腫瘤細胞的活動［9］。1.2CRT CRT是一種高度保守的多功能鈣結(jié)合蛋白，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）內(nèi)，主要功能是蛋白質(zhì)分子伴侶和維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。CRT在細胞膜表面發(fā)生凋亡前暴露，即在發(fā)生ICD的過程中CRT會從ER腔內(nèi)向細胞膜表面轉(zhuǎn)位，CRT暴露是ICD驅(qū)動抗癌免疫的關(guān)鍵因素之一［5，10］，細胞膜表面暴露的CRT（ecto-CRT）作為一個強有力的“吃掉我”信號，可增強APCs對死亡癌細胞的免疫原性識別和吞噬［11］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是誘導(dǎo)ICD相關(guān)的CRT轉(zhuǎn)位至細胞膜表面所必需的［5］，但兩者相關(guān)的具體分子機制尚未明確。ERS涉及到蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase R-like ER kinase，PERK）可磷酸化真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2α，eIF2α）［12］，從而導(dǎo)致隨后的信號傳導(dǎo)事件，包括ER蛋白BAP31的caspase-8依賴性蛋白水解、促凋亡蛋白BAX活化、CRT從ER轉(zhuǎn)運至高爾基體及含CRT囊泡的胞吐作用，最終導(dǎo)致SNARE介導(dǎo)的CRT在細胞表面的重新定位［12-13］。CRT與二硫鍵異構(gòu)酶（ERp57）形成穩(wěn)定的復(fù)合物，共轉(zhuǎn)位至細胞膜，ERp57的喪失可導(dǎo)致表面CRT喪失而減少巨噬細胞的吞噬作用［14］。ecto-CRT可與APCs上的多個受體結(jié)合，包括CD91、血小板反應(yīng)蛋白、補體成分1、q亞成分（C1q）受體和甘露糖結(jié)合凝集素［15］，其中，ecto-CRT主要被表達CD91的細胞識別、吞噬并結(jié)合，可觸發(fā)一系列的免疫事件，以促進抗原呈遞細胞（如DCs）的招募、抗原呈遞、促炎細胞因子（如TNF-α和IL-6）的釋放及17型輔助T細胞（Th17）的激活［16］。雖然ecto-CRT能引起一系列免疫反應(yīng)，但其作用也會被體內(nèi)的一些分子拮抗或抑制，如小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）介導(dǎo)的PERK下調(diào)，會抑制eIF2a的磷酸化及ER應(yīng)激，從而阻止蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的CRT暴露。另外，抗吞噬的CD47作為一種“不要吃我信號”也會拮抗ecto-CRT的作用。當(dāng)腫瘤細胞表面存在高水平的CRT時，CD47的表達量也會相應(yīng)增加。因此，增加CRT的質(zhì)膜暴露的同時阻斷或拮抗CD47是一種誘導(dǎo)ICD，從而增強抗腫瘤治療的策略。

1.3HM G B1 HMGB1是一種高度保守且廣泛分布于哺乳動物細胞的核蛋白，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、穩(wěn)定核小體和DNA修復(fù)等方面發(fā)揮作用。另外，HMGB1在炎性細胞分化、遷移和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中作為細胞外信號分子而發(fā)揮作用［17］；HMGB1還有促進DCs成熟、遷移、向T細胞呈遞TAA及產(chǎn)生促炎細胞因子的功能［18］。腫瘤細胞在死亡后期分泌的HMGB1與多種PRRs結(jié)合，包括Toll樣受體4（Toll-likereceptor 4，TLR4）及晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（the receptor of advanced glycation end product，RAGE），從而激活DCs中的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK、p38和ERK1／2）和核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）［18］，促進免疫細胞釋放IL-6和IL-10等細胞因子，進而參與炎性反應(yīng)［19］；HMGB1可激活髓樣分化主要反應(yīng)基因88（major response genes of myeloid differentiation，MyD88）依賴性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制吞噬體和溶酶體之間的融合，從而促進腫瘤抗原的加工遞呈［20-21］；HMGB1還可抑制免疫抑制細胞Treg細胞的活性［20］。有研究證明，在慢性HBV感染中，HMGB1可通過RAGE-ERK和哺乳動物雷帕霉素靶標(biāo)（mammalian target of rapamycin，mTOR）途徑誘導(dǎo)外周Treg細胞的自噬［22］。HMGB1在腫瘤微環(huán)境（tumor microenvironment，TME）中顯著上調(diào)，與患者的生存呈正相關(guān)。缺乏HMGB1的腫瘤細胞表現(xiàn)出誘導(dǎo)ICD和抗腫瘤免疫反應(yīng)能力的受損。

1.4I F NⅠ IFNⅠ作為一組廣譜抗病毒的細胞因子，具有抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)作用。IFNⅠ是在免疫應(yīng)答啟動階段激活效應(yīng)T淋巴細胞、NK細胞的關(guān)鍵細胞因子，可影響先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的進展，對微生物防御反應(yīng)至關(guān)重要［7，23-24］。IFNⅠ可通過與Ⅰ型干擾素受體（typeⅠinterferon receptor，IFNAR）結(jié)合后的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡和抗血管生成，也可對免疫系統(tǒng)的細胞產(chǎn)生直接影響［25］。IFNⅠ直接抑制腫瘤和病毒感染細胞的增殖，并增加MHC-Ⅰ類表達，從而增強抗原識別，還可影響DCs的分化、成熟和遷移［26］。腫瘤細胞內(nèi)固有IFNⅠ反應(yīng)的激活已成為ICD的標(biāo)志之一，產(chǎn)生IFNⅠ通過與腫瘤細胞上的IFNα和IFNβ受體結(jié)合，觸發(fā)腫瘤細胞的自分泌和旁分泌回路，導(dǎo)致CXC-趨化因子配體10（cxc-chemokine ligand 10，CXCL10）的釋放，發(fā)揮免疫刺激作用［27-28］。IFNⅠ的釋放涉及多種機制，在化療期間，由于細胞在死亡過程中RNA的釋放，腫瘤細胞會發(fā)生內(nèi)源性IFNⅠ反應(yīng)［29］。DNA損傷劑也會在細胞質(zhì)中通過dsDNA誘導(dǎo)IFNⅠ的產(chǎn)生［29］。YANG等［30］研究發(fā)現(xiàn)，IFNβ和順鉑的順序組合比起單獨給藥治療可更有效誘導(dǎo)eIF2α的磷酸化，參與對于CRT轉(zhuǎn)位至關(guān)重要的ERS；其次，干擾素調(diào)節(jié)因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）的上調(diào)有助于IFNβ和IFNβ-順鉑對eIF2α的磷酸化。另外，輻射誘導(dǎo)的IFNⅠ增強了DCs的交叉遞呈［31］。

1.5H S P HSP家族作為熱應(yīng)激蛋白質(zhì)，主要功能是協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊。HSP70和HSP90具有刺激腫瘤抗原攝取、DCs成熟等功能。HSP高表達是腫瘤細胞發(fā)生ICD的重要信號，CTLs在病毒感染和腫瘤形成過程中可對HSP-抗原肽進行識別，HSP70和HSP90可與抗原肽結(jié)合，并通過受體介導(dǎo)的HSP內(nèi)吞作用將這些肽穿梭至APCs的抗原處理途徑中，從而表達在Ⅰ類分子上［32］。HSP70和HSP90在ICD早期就攜帶腫瘤抗原肽暴露于細胞表面，晚期還會被動釋放至腫瘤微環(huán)境中，通過結(jié)合DCs上的TLR和NK細胞上的NKG2A來介導(dǎo)癌細胞-免疫細胞的相互作用［15］。HSP-抗原肽遞呈給CTLs可導(dǎo)致CTLs的激活，遞呈給NK細胞則會導(dǎo)致抑制作用的喪失，CTLs與NK細胞的激活均發(fā)揮關(guān)鍵的腫瘤殺傷作用［32］。

2 誘導(dǎo)ICD在腫瘤治療中的應(yīng)用

2.1骨肉瘤 金濤等［33］采用可誘導(dǎo)人骨肉瘤細胞凋亡的辣椒素處理MG-63細胞，結(jié)果顯示，CRT由ER轉(zhuǎn)移至細胞膜表面、胞外ATP及HMGB1的釋放增加。病毒為更好地復(fù)制繁殖，在感染復(fù)制等過程中的一系列機制也會誘導(dǎo)感染細胞發(fā)生ICD。MA等［34］在研究野生型腺病毒（adenovirus，Ad）血清型5、塞姆利基森林病毒（Semliki Forest virus，SFV）株SFV4和牛痘病毒（vaccinia virus，VV）Western Reserve株感染人骨肉瘤細胞株HOS的死亡途徑和免疫激活時，發(fā)現(xiàn)3種病毒株均可誘導(dǎo)細胞外ATP的釋放和HMGB1的增加。

2.2結(jié)直腸腫瘤 LIN等［35］研究發(fā)現(xiàn)，非熱性的等離子體（nonthermal plasma，NTP）可誘導(dǎo)CT26小鼠結(jié)直腸腫瘤細胞表面CRT的暴露和ATP的分泌；在體外用NTP處理過的細胞作為疫苗免疫BALB／c小鼠，結(jié)果表明，可保護小鼠免受腫瘤的侵襲。TANAKA等［10］研究發(fā)現(xiàn)，在體外用光動力治療（photodynamic therapy，PDT）與糖結(jié)合二氫卟酚（G-chlorin）聯(lián)合處理后的CT26細胞，可誘導(dǎo)CRT轉(zhuǎn)位和HMGB1釋放，隨后，在CT26活細胞的試驗中也得到了顯著保護。植物多糖也有調(diào)節(jié)免疫和抑制腫瘤生長的功能，其中香菇多糖在處理人結(jié)直腸癌上皮細胞SW837后可誘導(dǎo)增加CRT、HSP70和HSP90的表達量［36］。另外，多種ICD誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用也是目前增強免疫原性的途徑，JESSUP等［37］采用Ad和奧沙利鉑（Oxaliplatin，OXA）混合注射CT-26腫瘤細胞后，可抑制腫瘤的生長；PHUNG等［38］采用納米載體靶向小鼠結(jié)腸癌細胞MC-38共傳遞低劑量的阿霉素（Dox）和miRNA200c，通過CRT轉(zhuǎn)位及HMGB1釋放，增強了ICD，成功經(jīng)miRNA200c誘導(dǎo)了小鼠體內(nèi)PD-L1的有效下調(diào)，引發(fā)了明顯的抗腫瘤效應(yīng)。

2.3黑色素瘤 RODRíGUEZ-SALAZAR等［39］采用新型免疫調(diào)節(jié)劑IMMUNEPOTENT CRP（ICRP）和OXA處理B16F10細胞后，衍生腫瘤來源的富含DAMP細胞裂解液免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)ICRP+OXA治療可防止黑色素瘤生長。邵曉雁等［40］在對惡性黑色素瘤維羅非尼耐藥細胞株WM3248／vemurafenib的研究中證明，新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）毒株FMW（NDV／FMW）可誘導(dǎo)WM 3248／vemurafenib細胞膜DAMPs增加，包括CRT、ATP、HMGB1和HSP90。BEK等［41］研究顯示，在體外靶向黑色素瘤細胞的RNA受體視黃酸誘導(dǎo)基因-Ⅰ（RNAreceptor retinoic acid induciblegene-Ⅰ，RIG-Ⅰ）可導(dǎo)致黑色素瘤細胞發(fā)生ICD。鉑類化療藥物可誘導(dǎo)ICD，但口服的化療藥物經(jīng)消化代謝等過程后會降低療效，OXA屬于鉑類，也存在該問題。CHOI等［42］將OXA與Nα-脫氧膽?；?L-賴氨酰甲酯（Nα-deoxycholyl-L-llysyl methyl ester，DCK）絡(luò)合為納米乳液（OXA／DCK-NE）制備了一種口服制劑，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)外實驗中，OXA／DCK-NE均可有效誘導(dǎo)B16F10.OVA細胞中CRT和HMGB1的表達。因此，設(shè)計可引起ICD的化療藥物的復(fù)合配方和改進化療藥物的遞送方式，有望增強誘導(dǎo)腫瘤細胞的ICD，達到更強的殺傷腫瘤作用。

2.4乳腺癌 HAN等［43］研究發(fā)現(xiàn)，缺氧以依賴ERS的方式不僅可增加人類和小鼠乳腺癌細胞系4TO7表面的CRT暴露，還可誘導(dǎo)其總表達水平上升，從而增強腫瘤細胞的ICD?；诮鸾z桃素的PDT可有效誘導(dǎo)小鼠乳腺癌4T1細胞發(fā)生ICD，引起CRT的暴露［44］。但PDT過程需要消耗大量的氧，腫瘤內(nèi)部微環(huán)境持續(xù)缺氧引發(fā)了腫瘤免疫抑制，從而抑制PDT的療效或使腫瘤免疫治療失敗。MAI等［45］以血小板膜（platelet membrane，PM）作為納米載體，協(xié)同封裝二甲雙胍（Met）和IR780，制備了PM-IR780-Met NPs，并證明其可通過抑制線粒體呼吸而加強PDT的療效，誘導(dǎo)了4T1細胞高水平的CRT和HMGB1表達。

2.5宮頸癌 劉劍英等［46］實驗采用不同電場強度的高壓納秒脈沖電場（nanosecond pulse electric fields，nsPEFs）作用于HeLa細胞和U14細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在場強達到一定閾值及作用時間延長到一定時間后，CRT、HSP和HMGB1的表達均有所升高，從而誘導(dǎo)其發(fā)生ICD。

3 小結(jié)與展望

手術(shù)、放療、化療等的聯(lián)合使用在一定程度上延長了惡性腫瘤患者的生存期，但腫瘤治療目前在醫(yī)學(xué)上仍是一大難題。探究如何利用腫瘤細胞死亡和宿主自身的免疫系統(tǒng)相結(jié)合清除腫瘤細胞是一條可行且有效的治療策略。ICD作為一種可引起免疫反應(yīng)的細胞死亡，有望打破免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，啟動T細胞介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答，動員全身的免疫反應(yīng)，從而實現(xiàn)長期抑制腫瘤的作用。作為抗腫瘤免疫治療的重要組成部分，進一步研究并闡明ICD發(fā)生的相關(guān)機制對腫瘤治療，甚至腫瘤疫苗的研制尤為重要。

治療性腫瘤疫苗通過機體的免疫系統(tǒng)識別腫瘤抗原來特異性的殺傷腫瘤細胞，在理論上是具有廣泛前景的免疫治療策略。但由于腫瘤復(fù)雜多變的免疫抑制環(huán)境、遺傳機制及一系列免疫逃逸機制使腫瘤疫苗在實際臨床應(yīng)用中缺乏顯著療效。腫瘤細胞發(fā)生ICD時釋放的DAMPs能刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并提供豐富的腫瘤抗原，這為腫瘤疫苗研究指引了新方向。將誘導(dǎo)了ICD的死亡及瀕臨死亡的癌細胞或ICD來源的腫瘤細胞裂解物（tumor cell lysate，TCL）作為腫瘤抗原刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應(yīng)答，在惡性腫瘤治療方面應(yīng)用前景廣闊。ICD能夠?qū)⑺劳龅陌┘毎D(zhuǎn)化為一種“疫苗”，在不添加任何佐劑的情況下能夠誘導(dǎo)抗癌免疫［20］。另外，物理細胞死亡模式，如PDT或熱療法（heat treatment，HT）等能夠引起ICD，從而產(chǎn)生原位疫苗效應(yīng)，誘導(dǎo)抗腫瘤免疫［47］。綜上所述，經(jīng)ICD誘導(dǎo)劑（化療藥物、放射、PDT和傳染性病原體等）誘導(dǎo)的腫瘤細胞具有成為新型腫瘤疫苗的巨大潛力。

目前，放化療是臨床重要的治療手段，單一的化療藥物與放療即使誘導(dǎo)了ICD，也難以達到更理想的殺腫瘤效應(yīng)，要充分誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生ICD，在臨床上需高劑量的化療藥物，由于嚴重毒副作用難以實現(xiàn)。多種ICD誘導(dǎo)方式或藥物的結(jié)合可能在提高ICD的誘導(dǎo)效率及其免疫效應(yīng)，激活不同信號通路、減少產(chǎn)生耐藥性的同時還可改善安全性。另外，化療藥物可能無法到達腫瘤組織發(fā)揮作用，機體免疫能力低下可能造成ICD誘導(dǎo)不足，從而使臨床療效一般，因此，亟需探索更高效精準(zhǔn)的ICD誘導(dǎo)藥物、遞送載體或系統(tǒng)及可輔助增強ICD作用的藥物，如RT53和腫瘤治療電場（TTField）［48-49］。另外，在動物研究中探索的最佳條件不一定適合臨床，如不同的ICD誘導(dǎo)方式、劑量可能會對不同腫瘤細胞產(chǎn)生不同的效應(yīng)，且單一誘導(dǎo)ICD，還不足以解決腫瘤治療的難題，基于ICD誘導(dǎo)的多種免疫療法聯(lián)合使用可能是未來腫瘤免疫治療的新方向，如聯(lián)合免疫檢查點療法。今后，將對高效誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生ICD及其作用機制進行進一步深入研究，以期為合理利用ICD誘導(dǎo)進行腫瘤治療及設(shè)計更有效的腫瘤疫苗進行臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。