革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)及其分泌產(chǎn)物研究進展

余樂正，柳鳳娟，鄢南南，程 旭，李益洲，郭延芝

(1.貴州師范學院化學與生命科學學院，貴州貴陽 550018；2.四川大學化學學院，四川成都 610065)

革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)及其分泌產(chǎn)物研究進展

余樂正1,2，柳鳳娟1，鄢南南1，程 旭1，李益洲2，郭延芝2

(1.貴州師范學院化學與生命科學學院，貴州貴陽 550018；2.四川大學化學學院，四川成都 610065)

蛋白質(zhì)分泌在細菌生命活動中發(fā)揮著重要作用。通過各種各樣的分泌系統(tǒng)，革蘭陰性菌可分泌出大量蛋白質(zhì)，以協(xié)調(diào)細菌與周圍環(huán)境及其他細菌間的相互作用。由于細菌毒力的發(fā)揮離不開這些蛋白質(zhì)，故它們在疾病發(fā)病機理及抗菌藥物開發(fā)等研究中扮演著重要角色。論文圍繞不同類型的革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)及其分泌產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、功能等進行綜述,旨在為革蘭陰性菌致病機理研究和相關(guān)病害防控提供參考。

革蘭陰性菌；分泌系統(tǒng)；分泌蛋白；分泌信號

蛋白質(zhì)分泌在調(diào)控細菌與其周圍環(huán)境間的互相作用中發(fā)揮著重要作用。細菌分泌系統(tǒng)是一類將細菌體內(nèi)合成的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到細胞外環(huán)境或宿主體內(nèi)的系統(tǒng)，其與細菌的生存及致病性等緊密相關(guān)。通過各種分泌系統(tǒng)，致病菌可將毒力因子等生物大分子轉(zhuǎn)運到真核宿主體內(nèi)，導致宿主多種疾病的發(fā)生；而非致病菌則可分泌出各種效應(yīng)分子以適應(yīng)快速變化的環(huán)境[1]。對細菌分泌產(chǎn)物進行系統(tǒng)研究，不僅有助于深入理解與認識疾病發(fā)病機制，了解細菌生存狀態(tài)，對于疾病的診斷與治療、抗菌藥物研發(fā)等也具有重要意義。

目前，研究人員對細菌分泌系統(tǒng)的研究主要集中于革蘭陰性菌，且對各類分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能均已基本解釋清楚，但對其分泌產(chǎn)物的系統(tǒng)研究仍然很少。國內(nèi)學者對革蘭陰性菌Ⅰ型～Ⅶ型分泌系統(tǒng)已開展了大量研究，但對國外最新發(fā)現(xiàn)并命名的Ⅷ型、Ⅸ型分泌系統(tǒng)的研究亟待加強[2]。本文結(jié)合對應(yīng)的分泌系統(tǒng)，分析了不同類型的革蘭陰性菌分泌蛋白的基本特征，并對今后的研究進行了展望。

1 革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)

根據(jù)革蘭染色法，細菌可簡單分為革蘭陰性菌和革蘭陽性菌兩大類。在蛋白質(zhì)分泌過程中，革蘭陰性菌蛋白需穿越細胞質(zhì)膜和外膜兩個磷脂雙分子層，而革蘭陽性菌蛋白則只需穿越細胞質(zhì)膜這一個磷脂雙分子層。由于兩類細菌細胞結(jié)構(gòu)上的較大差異，使得前者的分泌過程較后者更為復雜，相關(guān)的研究也更多。

迄今為止，從革蘭陰性菌細胞中至少發(fā)現(xiàn)了9種不同類型的分泌系統(tǒng)。根據(jù)外膜分泌機制，它們分別被命名為Ⅰ型分泌系統(tǒng)(type Ⅰ secretion system,T1SS)至Ⅸ型分泌系統(tǒng)(type Ⅸ secretion system,T9SS)[2]。這些分泌系統(tǒng)大致可分為兩類，即一步分泌系統(tǒng)和兩步分泌系統(tǒng)。其中，一步分泌系統(tǒng)包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型四類分泌系統(tǒng)，而兩步分泌系統(tǒng)則包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅷ型和Ⅸ型五類分泌系統(tǒng)[3]。

2 革蘭陰性菌分泌蛋白

革蘭陰性菌分泌蛋白的命名與其通過的分泌系統(tǒng)一一對應(yīng)。通過Ⅰ型分泌系統(tǒng)而被釋放到細胞外的蛋白質(zhì)被命名為Ⅰ型分泌蛋白(type Ⅰ secreted proteins,T1SPs)，其他的以此類推。根據(jù)蛋白質(zhì)分泌過程中是否有N端信號肽的參與，革蘭陰性菌分泌蛋白可簡單分為兩大類，即含有N端信號肽的經(jīng)典分泌蛋白(classically secreted proteins,CSPs)和不含N端信號肽的非經(jīng)典分泌蛋白(non-classically secreted proteins,NCSPs)[4]。其中，經(jīng)典分泌蛋白包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅷ型和Ⅸ型五類分泌蛋白，而非經(jīng)典分泌蛋白則包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型四類分泌蛋白。對于兩步分泌系統(tǒng)，分泌蛋白須在N端信號肽的引導下，通過一般分泌途徑(Sec系統(tǒng))或雙精氨酸移位酶途徑(Tat系統(tǒng))穿過細胞質(zhì)膜。因此，革蘭陰性菌所有的經(jīng)典分泌蛋白均是通過兩步分泌系統(tǒng)被轉(zhuǎn)運到細胞外的，而非經(jīng)典分泌蛋白則主要是通過一步分泌系統(tǒng)被釋放細胞外或直接注入真核宿主體內(nèi)的。

3 不同類型的革蘭陰性菌分泌產(chǎn)物

相較于分泌產(chǎn)物，研究人員通常更關(guān)注于不同類型的革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能。目前，關(guān)于革蘭陰性菌蛋白質(zhì)分泌途徑或分泌系統(tǒng)的研究已有很多[5]，但專門針對其分泌產(chǎn)物的研究仍然很少。為了進一步加強對革蘭陰性菌分泌蛋白的理解與認識，結(jié)合相應(yīng)分泌系統(tǒng)。不同類型的革蘭陰性菌分泌蛋白基本特征匯總見表1。

表1 不同類型的革蘭陰性菌分泌蛋白基本特征

3.1 Ⅰ型分泌蛋白

Ⅰ型分泌系統(tǒng)是Sec不依賴性的，也被稱為三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體(ABC-transporter)分泌路徑，并由三磷酸腺苷酶(ATPase)、膜融合蛋白和外膜三聚體蛋白這3個蛋白質(zhì)組成。通過該途徑而被分泌的蛋白質(zhì)統(tǒng)稱為Ⅰ型分泌蛋白(T1SPs)，包括毒素，脂酶，蛋白酶，核酸酶，葡聚糖酶，表層蛋白，血紅素載體等。Ⅰ型分泌蛋白主要具有以下特征[6]：①分泌信號位于蛋白質(zhì)的C端而不是N端，且分泌過程中不發(fā)生斷裂；②絕大多數(shù)Ⅰ型分泌蛋白含有不同數(shù)量的甘氨酸重復片段(-G-G-X-G-X-D-)，但不含半胱氨酸殘基；③大多數(shù)Ⅰ型分泌蛋白呈酸性，且等電點值約為4；④Ⅰ型分泌蛋白的分子量變化很大，可由幾十至數(shù)千個氨基酸組成。

3.2 Ⅱ型分泌蛋白

Klebsiellaoxytoca支鏈淀粉酶是最早被發(fā)現(xiàn)通過Ⅱ型分泌系統(tǒng)(type Ⅱ secretion system,T2SS)而被釋放的蛋白質(zhì)，其分泌后會錨定到細胞外膜上。此后，研究人員從革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)了越來越多的Ⅱ型分泌蛋白(type Ⅱ secreted proteins,T2SPs)，如蛋白酶、纖維素酶、殼多糖酶、果膠酶、磷脂酶、脂酶及毒素等。作為一般分泌系統(tǒng)的主要分支，Ⅱ型分泌系統(tǒng)是Sec依賴性的，且屬于兩步分泌系統(tǒng)。在N端信號肽的引導作用下，Ⅱ型分泌蛋白通過Sec系統(tǒng)或Tat系統(tǒng)首先穿過細胞質(zhì)膜。隨后，折疊狀態(tài)下的Ⅱ型分泌蛋白通過Ⅱ型分泌系統(tǒng)被快速轉(zhuǎn)運到細胞外環(huán)境中。Ⅱ型分泌蛋白的分泌信號位于蛋白質(zhì)的N端，并脫落于周質(zhì)中。由于T4P系統(tǒng)(type 4 pilus system)和Tad系統(tǒng)(tight-adherence piliation system)與Ⅱ型分泌系統(tǒng)是同源的[7]，故通過這兩種分泌途徑而被釋放的蛋白質(zhì)也屬于Ⅱ型分泌蛋白。

3.3 Ⅲ型分泌蛋白

Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)也是Sec不依賴性的，并由20種以上的蛋白質(zhì)組成[8-9]。Ⅲ型分泌系統(tǒng)包含兩種分泌途徑，即注入型(非鞭毛型)系統(tǒng)和鞭毛型系統(tǒng)。在細胞相互接觸的情況下，Ⅲ型分泌蛋白(type Ⅲ secreted proteins,T3SPs)可通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)直接進入真核宿主細胞內(nèi)，從而導致各種疾病的發(fā)生。Ⅲ型分泌蛋白通常也被稱為Ⅲ型效應(yīng)器。雖然Ⅰ型、Ⅲ型分泌蛋白都屬于非經(jīng)典分泌蛋白，但大多數(shù)Ⅲ型分泌蛋白的分泌信號位于蛋白質(zhì)的N端，且編碼在多肽或mRNA上[10]。由于同源分子伴侶蛋白不僅能有效穩(wěn)定Ⅲ型效應(yīng)器，還可防止其終端折疊構(gòu)象的形成，故Ⅲ型分泌不僅受分泌信號的調(diào)控，也十分依賴于分子伴侶蛋白的活性。此外，Ⅲ型效應(yīng)器進化速度非?？?，以至于同一菌種不同分支間的蛋白質(zhì)序列變化很大。為了快速準確地識別Ⅲ型效應(yīng)器及其分泌信號，基于大量的蛋白質(zhì)序列和與眾不同的特點，現(xiàn)已發(fā)展出多種計算方法[11]。

3.4 Ⅳ型分泌蛋白

所有與細菌接合系統(tǒng)同源或功能類似的分泌途徑均屬于Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system,T4SS/TFSS)，且這些分泌器至少由10種不同的蛋白質(zhì)組成。Ⅳ型分泌系統(tǒng)主要包含兩個子系統(tǒng)，即由VirB同源蛋白組裝而成的T4SSa系統(tǒng)和Tra同源蛋白組裝而成的T4SSb系統(tǒng)[12-13]?；谝阎墓δ苄畔?，一些研究人員也將Ⅳ型分泌系統(tǒng)分為3個子系統(tǒng)，即接合系統(tǒng)、效應(yīng)器轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及DNA釋放/吸收系統(tǒng)[14]。與其他分泌系統(tǒng)相比，Ⅳ型分泌系統(tǒng)最大的特點在于能協(xié)調(diào)革蘭陰性菌與細胞外環(huán)境間的DNA互換。通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)，單體蛋白、多亞基毒素和DNA-蛋白質(zhì)復合物等均能被釋放到細胞外環(huán)境中或直接注入真核細胞內(nèi)。因此，Ⅳ型分泌蛋白(type Ⅳ secreted proteins,T4SPs)的分子量變化也很大。Ⅳ型分泌蛋白也屬于非經(jīng)典分泌蛋白，且通常含有一個C端Ⅳ型分泌信號。有趣的是，作為一種已知的Ⅳ型效應(yīng)器，百日咳毒素(Pertussis toxin)的亞基中含有N端信號肽，并通過經(jīng)典的Sec系統(tǒng)穿過細胞質(zhì)膜[15]。Ⅳ型分泌蛋白的靶細胞種類繁多，如人類、動物、植物、真菌及其他細菌。為了適應(yīng)快速變化的環(huán)境，Ⅳ型分泌蛋白進化速度也很快。此外，研究人員已提出了幾種專門用于Ⅳ型分泌蛋白識別的計算方法[16-17]。

3.5 Ⅴ型分泌蛋白

自主分泌途徑(autotransporter pathway)首次提出于1987年，用以解釋Neisseriagonorrhoeae免疫球蛋白A1(IgA1)蛋白酶的分泌機制。除了該分泌途徑，雙組分分泌途徑 (two-partner secretion pathway)和三聚體自主分泌途徑(trimeric autotransporters pathway)也屬于Ⅴ型分泌系統(tǒng)(type Ⅴ secretion system,T5SS)。作為革蘭陰性菌中分布最廣的分泌系統(tǒng)，Ⅴ型分泌系統(tǒng)擁有最簡單的分泌器，且分泌過程中不需要能量[18]。由于Ⅴ型分泌蛋白(type Ⅴ secreted proteins,T5SPs)的分泌過程通常是由其自身所引導的，故它們昵稱為自轉(zhuǎn)運子。目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)了上千個Ⅴ型分泌蛋白，它們構(gòu)成了革蘭陰性菌分泌蛋白中最大的子家族。自轉(zhuǎn)運子一般由3個功能結(jié)構(gòu)域組成，包括引導蛋白質(zhì)前體穿過細胞質(zhì)膜的N端信號肽，行使蛋白質(zhì)功能的內(nèi)部乘客域，以及引導成熟蛋白質(zhì)穿越外膜的C端輔助域(β-domain)。對于雙組分分泌途徑，其乘客域和輔助域是2個獨立的蛋白質(zhì)，分別被命名為TpsA蛋白和TpsB蛋白。其中，TpsA是最終的分泌蛋白，而TpsB是TpsA的轉(zhuǎn)運器。此外，已有研究證實一些自轉(zhuǎn)運子含有非常規(guī)的信號肽，其長度可超過50個氨基酸[19]。

3.6 Ⅵ型分泌蛋白

2006年，Ⅵ型分泌系統(tǒng)(type Ⅵ secretion system,T6SS)首次發(fā)現(xiàn)于Vibriocholera中[20-21]。Ⅵ型分泌系統(tǒng)也是Sec不依賴性的，但蛋白質(zhì)穿越外膜時需要能量。Ⅵ型分泌系統(tǒng)被認為是由保守的基因簇編碼而來的，而每個基因簇包含15個～25個基因[22-23]。雖然Ⅵ型分泌系統(tǒng)在許多病原體中是相對保守的，但目前已報道的Ⅵ型分泌蛋白(type Ⅵ secreted proteins,T6SPs)數(shù)量仍然很少。溶血素調(diào)節(jié)蛋白(hemolysin coregulated protein,Hcp)和纈氨酸-甘氨酸重復蛋白質(zhì)G(valine-glycine repeat protein G,VgrG)是兩個重要的Ⅵ型分泌蛋白，它們常作為典型代表用于Ⅵ型分泌系統(tǒng)的研究。為了能被順利釋放，這2個蛋白質(zhì)在分泌過程中會相互協(xié)作，故推測它們可能是Ⅵ型分泌器的2個亞基[24]。為了進一步理解和認識相關(guān)疾病的發(fā)病機制，在今后的研究中應(yīng)加快對Ⅵ型分泌系統(tǒng)及Ⅵ型分泌蛋白的研究。

3.7 Ⅶ型和Ⅷ型分泌蛋白

菌毛、纖毛等黏附結(jié)構(gòu)通常是在革蘭陰性致病菌的細胞表面被組裝起來的。目前，研究人員已發(fā)現(xiàn)了4種主要的黏附結(jié)構(gòu)組裝機制，包括經(jīng)典的分子伴侶/分子引導分泌途徑(chaperone/usher pathway,CU pathway)，交替分子伴侶途徑(alternate chaperone pathway,AC pathway)，T4P系統(tǒng)和胞外核聚-沉淀途徑 (extracellular nucleation-precipitation pathway,ENP pathway)。其中，T4P系統(tǒng)是Ⅱ型分泌系統(tǒng)的一個分支，分子伴侶/分子引導分泌途徑已被命名為Ⅶ型分泌系統(tǒng)(type Ⅶ secretion system,T7SS)，而胞外核聚-沉淀途徑則被稱為Ⅷ型分泌系統(tǒng)(type Ⅷ secretion system,T8SS)。值得注意的是，分子伴侶/分子引導分泌途徑不同于革蘭陽性菌Ⅶ型分泌系統(tǒng)，后者也被稱為ESAT-6分泌系統(tǒng)(Ess/ESX)[25]。盡管交替分子伴侶途徑與經(jīng)典的分子伴侶/分子引導分泌途徑具有一些共同的特征，但目前仍無法確定該途徑是Ⅶ型分泌系統(tǒng)的一個分支，還是一種全新的分泌系統(tǒng)。

作為黏附結(jié)構(gòu)最常見的組裝機制，分子伴侶/分子引導分泌途徑至少參與了30種革蘭陰性致病菌黏附細胞器的組裝[26]。這些黏附細胞器被編碼在獨立的基因簇中，每個基因簇可編碼不同數(shù)量的亞基蛋白。這些亞基蛋白可分為兩類，即由相同亞基組成的均聚物和由不同亞基組成的雜聚物。分泌過程中，亞基蛋白首先通過Sec系統(tǒng)穿過細胞質(zhì)膜。隨后，它們在周質(zhì)中與同源分子伴侶形成分子伴侶-亞基復合物。這些分子伴侶-亞基復合物與外膜引導蛋白結(jié)合后組裝成暴露于細胞表面的菌毛黏附素后，亞基蛋白最后通過分子引導通道而被釋放到細胞外。周質(zhì)分子伴侶和外膜引導蛋白也編碼在基因簇中，Zav'yalov V等[27]已對它們的功能進行了詳細介紹。

作為一種薄的、卷曲的、高度聚合的表面黏附結(jié)構(gòu)，薄聚菌毛(thin aggregative fimbriae,Tafi)也被稱為Curli，是唯一由胞外核聚-沉淀途徑組裝而成的黏附細胞器。Curli主要存在于沙門菌和大腸埃希菌中，分別由agf操縱子和csg操縱子所編碼。作為大腸埃希菌中2個分泌型的Curli亞基，CsgA蛋白和CsgB蛋白是由csgBA操縱子所編碼的，且CsgB作為成核劑可促進CsgA的聚合。CsgA和CsgB首先通過Sec系統(tǒng)穿過細胞質(zhì)膜。隨后，在外膜脂蛋白CsgG的幫助下，二者被轉(zhuǎn)運出細胞外膜。因此，CsgG可能扮演著分子伴侶或?qū)儆贑sg蛋白轉(zhuǎn)運通道的角色。不同于其他3種組裝機制，Curli菌毛的組裝通常發(fā)生細胞外。此外，Curli具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，以至于它們的解聚需要使用強化學處理方法。為了進一步揭示這一極具發(fā)展?jié)摿Φ慕M裝機制，在新的Curli識別方面我們應(yīng)做出更多的努力。

3.8 Ⅸ型分泌蛋白

2013年，Por分泌系統(tǒng)(PorSS)首次被命名為Ⅸ型分泌系統(tǒng) (type Ⅸ secretion system,T9SS)[28]，并成為最新被列入的革蘭陰性菌分泌系統(tǒng)。研究人員主要在Bacteroidetes門的兩個分支中對Ⅸ型分泌系統(tǒng)進行了相關(guān)研究，包括牙周致病菌Porphyromonasgingivalis和滑行細菌Flavobacteriumjohnsoniae。許多毒力因子均是通過Ⅸ型分泌系統(tǒng)而被釋放到細胞外，牙齦素(gingipains)就是它們中的典型代表。研究證實Ⅸ型分泌蛋白(type Ⅸ secreted proteins,T9SPs)含有可分離的N端信號肽，并通過Sec系統(tǒng)穿過細胞質(zhì)膜[29]。隨后，在C端保守結(jié)構(gòu)域的引導作用下，它們通過Ⅸ型分泌系統(tǒng)被轉(zhuǎn)運出細胞外膜。

4 展望

目前，至少有9種不同類型的分泌系統(tǒng)介導了革蘭陰性菌蛋白質(zhì)的分泌過程。每類分泌蛋白均對應(yīng)于一種特定類型的分泌系統(tǒng)，且它們對真核細胞的侵染可嚴重干擾宿主正常的生理功能。因此，對革蘭陰性菌分泌產(chǎn)物進行系統(tǒng)深入地研究，不僅有助于理解其對應(yīng)的分泌系統(tǒng)和相關(guān)疾病的發(fā)病機制，在疾病的診斷和治療、新藥研發(fā)等方面也具有重要意義。

雖然在革蘭陰性菌分泌產(chǎn)物研究方面我們已開展了很多工作，但仍有許多問題亟待解決。為了深入理解不同類型的革蘭陰性菌分泌蛋白間結(jié)構(gòu)與功能的具體差異，新的分泌蛋白需要盡快被識別出來，尤其是Ⅵ型和Ⅷ型分泌蛋白。同時，研究人員應(yīng)發(fā)展出新的研究方法，完成更多實驗，以揭示尚不清楚或其他未知的分泌機制。Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅴ型四類分泌系統(tǒng)均包含多種分泌途徑，故需進一步找出通過不同分泌途徑而被釋放的同類分泌蛋白子家族間的特征差異。一個綜合且專業(yè)的分泌蛋白數(shù)據(jù)庫對于今后分泌蛋白的研究具有十分重要的作用。此外，研究同一蛋白質(zhì)是否能通過不同類型的分泌系統(tǒng)而被釋放到細胞外，也是一個很有意義的課題。得到這些問題的答案將有助于進一步理解、認識、分析和解釋革蘭陰性菌蛋白質(zhì)分泌過程，可為預防細菌感染等提供更多參考。

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Abstract:Protein secretion plays an important role in bacterial lifestyles.In Gram-negative bacteria,a wide range of proteins are secreted to modulate the interactions of bacteria with their environments and other bacteria via various secretion systems.These proteins are essential for the virulence of bacteria,so it is crucial to study them for the pathogenesis of diseases and the development of drugs.In this article, we reviewed the recent progress on the structure and function of different types of Gram-negative bacterial secretion systems and their secretory products, which may provide reference for studying the pathogenesis of Gram-negative bacteria and the prevention of related diseases.

Keywords:Gram-negative bacteria; secretion system; secreted protein; secretion signal

ProgressonSecretionSystemsandSecretoryProductsofGram-negativeBacteria

YU Le-zheng1,2,LIU Feng-juan1,YAN Nan-nan1,CHENG Xu1,LI Yi-zhou2,GUO Yan-zhi2

(1.SchoolofChemistryandLifeScience,GuizhouEducationUniversity,Guiyang,Guizhou,550018,China; 2.CollegeofChemistry,SichuanUniversity,Chengdu,Sichuan,610065,China)

Q939.1

A

1007-5038(2017)08-0080-05

2017-01-12

國家自然科學基金項目(21305096)；貴州省科學技術(shù)基金計劃項目(黔科合J字[2014]2134號)；貴州省普通本科高等學校青年科技人才成長項目(黔教合KY字[2016]219)

余樂正(1984-)，男，四川井研人，副教授，博士，主要從事生物信息學研究。