結(jié)核分枝桿菌ESX-1分泌系統(tǒng)的研究進(jìn)展

鄧儀昊，何紅云，王 勇

（大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

ESAT-6 secretion system-1（ESX-1）分泌系統(tǒng)是結(jié)核分枝桿菌中以分泌ESAT-6（Rv3875）及CFP-10（Rv3874）蛋白為特征的毒力分泌系統(tǒng)。參與該分泌系統(tǒng)的基因包括RD-1（region of difference）區(qū)Rv3871-Rv3879 9個(gè)基因，Rv3614c-Rv3616c（EspA）3個(gè)基因、Rv3881c（EspB）、Rv3867、Rv3849（EspR）、Rv3864、Rv3883c （MyP1）、Rv3868、Rv3869、Rv3870及Rv3882c組成。本文就該分泌系統(tǒng)的組成及其各組分對(duì)ESX-1分泌系統(tǒng)的調(diào)控進(jìn)行綜述。

1 ESX-1分泌系統(tǒng)的組成

通過比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)卡介苗（Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin，BCG）與結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）標(biāo)準(zhǔn)株H37RV基因之間存在著16個(gè)差異區(qū)段〔1〕，即RD1-RD16，共16個(gè)區(qū)，129個(gè)開放讀碼框，統(tǒng)稱為RD（region of difference）區(qū)。其中RD1區(qū)由Rv3871-Rv3879 9個(gè)基因組成，是一個(gè)以分泌ESAT-6（Rv3875）及CFP-10（Rv3874）為特征的分泌系統(tǒng)，因此稱為ESX-1分泌系統(tǒng)〔2〕，是結(jié)核分枝桿菌重要的毒力因子。研究發(fā)現(xiàn)，在其編碼基因的上下游基因?qū)ι鲜?種蛋白分泌具有重要的調(diào)節(jié)作用，如Rv3870、Rv3871及Rv3877中任何一個(gè)基因敲除均明顯影響ESAT-6及CFP-10的正常分泌〔3-4〕。最近研究顯示，除RD-1區(qū)以外，參與構(gòu)成ESX-1分泌系統(tǒng)的還包括較多基因區(qū)域。Rv3614c-Rv3616c基因區(qū)域是參與ESAT-6及CFP-10表達(dá)分泌的重要組分〔5〕，當(dāng)結(jié)核分枝桿菌缺失基因Rv3616（EspA）及Rv3615時(shí)，ESAT-6/CFP-10表達(dá)產(chǎn)物不能分泌至細(xì)胞外，在此區(qū)域中的任何一個(gè)基因缺失或突變，則可導(dǎo)致菌株的毒力下降。RD-1區(qū)鄰近的基因Rv3881c對(duì)ESX-1系統(tǒng)的分泌產(chǎn)生顯著影響，對(duì)ESAT-6/CFP-10的分泌具有促進(jìn)作用〔6〕。最近研究發(fā)現(xiàn)，Rv3864也是ESX-1的分泌蛋白〔7〕，而Rv3849不僅是ESX-1分泌蛋白，而且是該系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子〔8〕。Rv3868是具有AAA+ATP酶位點(diǎn)假定細(xì)胞質(zhì)伴侶蛋白，Rv3883c（MycP1）是一種枯草桿菌樣絲氨酸蛋白酶，均參與ESAT-6向細(xì)胞外的分泌〔9〕。

到目前為止，已研究證實(shí)確切參與ESX-1分泌系統(tǒng)組成的有：RD-1區(qū)基因區(qū)域有Rv3871-Rv3879九個(gè)基因、Rv3614c-Rv3616c（EspA）3個(gè)基因、Rv3849 （EspR）、Rv3864、Rv3867、Rv3868、Rv3869、Rv3870、Rv3881c （EspB）、Rv3882c 及 Rv3883c（MyP1）。隨著研究的深入及實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，由ESX-1分泌以及調(diào)節(jié)ESX-1分泌系統(tǒng)功能的組分陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。

2 ESX-1系統(tǒng)新發(fā)現(xiàn)的組分及其調(diào)節(jié)作用

2.1 Rv3881c（EspB）McLaughlin等將Rv3881c表達(dá)蛋白命名為ESX-1分泌蛋白B（EspB），它的分泌需要RD-1區(qū)基因Rv3879和Rv3871存在下方可實(shí)現(xiàn)，而不受RD-1延伸區(qū)Rv3866或Rv3867的影響〔10〕。研究顯示，EspB是ESX-1分泌系統(tǒng)的重要組成成分，與結(jié)核分枝桿菌的毒性及其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長密切相關(guān)〔11〕。另有研究發(fā)現(xiàn)，Rv3881c編碼蛋白在ESX-1系統(tǒng)分泌時(shí)C端已被切除，提示EspB參與了ESX-1系統(tǒng)的協(xié)同分泌。Xu J等〔6〕研究表明，Mh3881c（Rv3881c同源）與ESAT-6及CFP-10呈共同依賴式分泌，而這種共依賴分泌形式與結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)存活、及其阻止吞噬體成熟的作用密切相關(guān)。

2.2 Rv3614c-Rv3616c（EspA）Rv3614c-Rv3616c區(qū)基因是ESX-1分泌系統(tǒng)的主要組分之一，對(duì)此分泌系統(tǒng)的功能發(fā)揮極其重要的作用。MacGurn等〔12〕發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Rv3616c（EspA）和Rv3615缺失時(shí)，ESAT-6/CFP-10蛋白可正常表達(dá)，但不能分泌到細(xì)胞外，提示Rv3614c-Rv3616c對(duì)ESX-1分泌系統(tǒng)的分泌功能至關(guān)重要。同時(shí)，EspA也必須依賴ESX-1系統(tǒng)才能分泌到培養(yǎng)濾液中，提示EspA與ESX-1系統(tǒng)分泌蛋白相互補(bǔ)充和調(diào)節(jié)。Fortune等〔13〕研究顯示，若Rv3614c-Rv3616c中有1個(gè)基因被破壞，則可導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌的毒力降低，這可能是Rv3614c-Rv3616c的破壞引發(fā)ESX-1分泌系統(tǒng)的功能受損，毒力因子未能分泌至細(xì)胞外導(dǎo)致的。胞質(zhì)蛋白R(shí)v3614c與胞膜蛋白R(shí)v3882c相互作用，促進(jìn)相關(guān)ESX-1分泌蛋白的分泌。研究發(fā)現(xiàn)，Rv3615c是一種分泌蛋白，其C端是分泌系統(tǒng)ESX-1所必須的，因此，在缺少EspA或Rv3615c時(shí)，結(jié)核分枝桿菌ESAT-6/CFP-10可形成復(fù)合物，但只能停留在細(xì)胞內(nèi)而不被分泌。Rv3616c（EspA）與Rv3614c和Rv3615c形成一個(gè)操縱子，同時(shí)，Rv3616c（EspA）、Rv3615c與ESAT-6/CFP-10在分泌上相互依賴，互相促進(jìn)，協(xié)同分泌〔14〕。

2.3 Rv3849（ESX-1調(diào)節(jié)蛋白，EspR）Rv3849（EspR）編碼蛋白不僅是ESX-1系統(tǒng)的分泌蛋白，同時(shí)可調(diào)節(jié)ESX-1分泌系統(tǒng)的功能。EspR可直接與Rv3614c-Rv3616c結(jié)合，并激活其啟動(dòng)子，使Rv3614c-Rv3616c表達(dá)，Rv3614c-Rv3616c的表達(dá)可提高ESX-1系統(tǒng)的分泌。與此同時(shí)，EspR本身也受到ESX-1分泌系統(tǒng)的調(diào)節(jié)〔8〕。值得注意的是，當(dāng)調(diào)節(jié)因子EspR分泌增加時(shí)，Rv3614c-Rv3616c轉(zhuǎn)錄反而減少，使ESX-1系統(tǒng)的分泌減少。這樣就形成了一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)，即EspR分泌增加—導(dǎo)致Rv3614c-Rv3616c轉(zhuǎn)錄減少—ESX-1分泌減少—結(jié)核分枝桿菌毒性減小，反之亦然。由于EspR的功能主要是調(diào)節(jié)ESX-1的分泌，所以將它命名為ESX-1調(diào)節(jié)蛋白。EspR與Rv3614c-Rv3616c形成的反饋調(diào)節(jié)循環(huán)對(duì)結(jié)核桿菌的毒性及免疫原性至關(guān)重要，它對(duì)結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)的長期存活及其在體內(nèi)誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答均產(chǎn)生較大影響。

2.4 Rv3868 位于RD-1延伸區(qū)的Rv3868是ESX-1分泌系統(tǒng)的組成部分，它可增加細(xì)胞膜活性，與結(jié)核桿菌的毒性及其在體內(nèi)的存活擴(kuò)散相關(guān)，并參與結(jié)核分枝桿菌毒性分子的分泌。Rv3868是具有AAA+ATP酶位點(diǎn)的細(xì)胞質(zhì)伴侶蛋白〔15〕，它可與Rv3870和Rv3871相互作用促進(jìn)ESAT-6/CFP-10蛋白的分泌。Teutschbein等〔16〕研究ESX-1分泌系統(tǒng)（包括Rv3868-Rv3877 10個(gè)基因）中各基因間的相互關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，Rv3866、Rv3868和CFP-10同Rv3873相互作用，共同促進(jìn)ESAT-6的分泌。另有研究顯示，Rv3868、Rv3869、Rv3870、Rv3871及Rv3877編碼蛋白對(duì)ESAT-6/CFP-10的分泌極為重要，而ppe68、Rv3873及Rv3876的失活并不妨礙ESAT-6的分泌〔17〕。

2.5 Rv3883c（MycP1）結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后，正是依賴ESX-1分泌系統(tǒng)的作用將毒性蛋白分泌至宿主細(xì)胞。MycP1是一種由Rv3883c編碼的絲氨酸蛋白酶〔18〕，可介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后ESX-1的分泌。Rv3883c（MycP1）對(duì)于維持ESX-1分泌系統(tǒng)的功能來說是必須的〔9〕，當(dāng)Rv3883c表達(dá)受阻時(shí)，ESX-1分泌系統(tǒng)假設(shè)底物反而增加，這提示作為Rv3883c的可能底物如Rv3881c（EspB）、ESAT-6/CFP-10對(duì)維持ESX-1系統(tǒng)的分泌功能是必須的。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，MycP1失活后可導(dǎo)致慢性感染的毒性減弱，其與毒性分子分泌呈正相關(guān)。在MycP1酶的調(diào)節(jié)下，使結(jié)核分枝桿菌不但具有相當(dāng)?shù)亩玖?，而且能使其在機(jī)體內(nèi)長期存活，它在調(diào)節(jié)ESX-1系統(tǒng)的分泌及其毒性作用方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。目前Rv3883c作用的確切底物仍不明確，可能是Rv3881c（EspB），或ESAT-6/CFP-10。

2.6其它ESX-1分泌系統(tǒng)重要組分及作用Rv3869、Rv3870和Rv3877分別有1、3、11個(gè)轉(zhuǎn)膜位點(diǎn)，這3種蛋白同ESX-1分泌系統(tǒng)的細(xì)胞質(zhì)蛋白R(shí)v3871共形成一個(gè)膜結(jié)合的ESX-1分泌復(fù)合體，依賴ATP水解將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外〔19〕。另外，通過酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)蛋白R(shí)v3614c可與膜蛋白R(shí)v3882c相互作用，促進(jìn)ESX-1分泌蛋白的分泌〔12〕。Rv3864也被研究證實(shí)是ESX-1系統(tǒng)分泌蛋白，其功能與Rv3870相協(xié)同。Rv3815c是一種分泌蛋白，其C端與CFP-10一樣是分泌系統(tǒng)ESX-1所必須的，在缺少EspA或Rv3815c時(shí)，ESAT-6/CFP-10復(fù)合物可形成，但不能被分泌至細(xì)胞外，這提示ESX-1的所有底物（包括ESAT-6、CFP-10、Rv3815c以及EspA等）在分泌時(shí)是相互依賴的〔12-13〕。

結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁的特殊性，導(dǎo)致其通透性極差且具有高度的疏水性。這使得結(jié)核桿菌表達(dá)的蛋白必須要在分泌系統(tǒng)的協(xié)助下才能分泌至細(xì)胞外。近年來，發(fā)現(xiàn)了較多蛋白也參與了ESX-1的構(gòu)成，并ESX-1功能密切關(guān)聯(lián)。因此，ESX-1不再是只包括RD-1區(qū)（Rv3871-Rv3879）基因區(qū)域的系統(tǒng)，而且包括更多的與ESX-1系統(tǒng)分泌相關(guān)基因區(qū)域的統(tǒng)稱。

3 展望

近年來，對(duì)結(jié)核分枝桿菌ESX-1分泌系統(tǒng)的研究取得了較多突破性進(jìn)展，但仍有較多難題需要深入探究：更多的參與ESX-1分泌系統(tǒng)的成分急待發(fā)現(xiàn)，以及這些組分對(duì)ESX-1系統(tǒng)分泌功能的影響；ESX-1分泌蛋白如何穿過結(jié)核桿菌極差通透性和高度疏水性的細(xì)胞膜的，即ESX-1的分泌機(jī)制尚待進(jìn)一步研究；Rv3883c（MycP1）與其可能底物Rv3881c（EspB）、ESAT-6及CFP-10間的相互作用機(jī)制不明確，它在ESX-1分泌系統(tǒng)中的具體作用；ESX-1分泌系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制；除ESX-1分泌系統(tǒng)外，結(jié)核分枝桿菌還有4類分泌系統(tǒng)即ESX-2-ESX-5，這些分泌系統(tǒng)雖分泌功能是獨(dú)立的，但各系統(tǒng)間是否有相互促進(jìn)或抑制作用，各分泌系統(tǒng)間的相互聯(lián)系有待于進(jìn)一步的研究。

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