高效液相色譜法測(cè)定濃香型白酒中己酸的結(jié)果不確定度評(píng)定

夏 燕，張瑞景 *，李大海，朱正軍，徐 健

（1.湖北琪譜檢測(cè)技術(shù)有限公司，湖北 武漢 430068；2.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430068；3.丹陽(yáng)頤和食品有限公司，江蘇 鎮(zhèn)江 212300）

己酸是一種揮發(fā)性脂肪酸，具有椰子油脂氣味，作為食用香料廣泛應(yīng)用于干酪、奶油和水果香精中，同時(shí)也是濃香型白酒中主要的酸類物質(zhì)之一[1-2]。濃香型白酒中的己酸主要由白酒發(fā)酵窖泥中的己酸菌代謝產(chǎn)生[3-4]，其含量受窖齡、窖泥質(zhì)量、大曲質(zhì)量等多種因素的影響[5-6]。適當(dāng)含量的己酸可以增加濃香型白酒的濃郁感和豐滿度，使酒體窖香突出、更具濃厚感[7-8]。此外，己酸還是生成濃香型白酒主體香味物質(zhì)己酸乙酯的重要前體物質(zhì)，作為評(píng)判濃香型白酒品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵指標(biāo)，酒體中己酸乙酯的含量與己酸的含量呈正相關(guān)[9-11]。

在GB/T 10781.1—2021《白酒質(zhì)量要求第1部分：濃香型白酒》標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)濃香型白酒中己酸和己酸乙酯含量的總和做出了規(guī)定[12]。因此，準(zhǔn)確測(cè)定酒體中己酸的含量對(duì)于指導(dǎo)白酒企業(yè)的實(shí)際生產(chǎn)具有重要意義。目前，己酸的檢測(cè)方法主要包括比色法、紙層析法、硫酸銅顯色法以及氣相色譜法等[13-14]。其中，比色法、紙層析法和硫酸銅顯色法不能準(zhǔn)確檢測(cè)出樣品中己酸的含量，因此多用于生產(chǎn)過(guò)程中的快速檢測(cè)[15]。酒樣中的己酸含量多采用氣相色譜法進(jìn)行測(cè)定[16-17]，但該方法實(shí)際應(yīng)用時(shí)存在峰形不對(duì)稱、拖尾等現(xiàn)象[8，18]，對(duì)己酸的精確定量具有一定影響。高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）具有靈敏度高、分離效率好、前處理簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[19]，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵過(guò)程中檸檬酸[20]、山梨酸[21]、乳酸[22]、乙酸[23]等有機(jī)酸的檢測(cè)。因此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)濃香型白酒中的己酸含量進(jìn)行測(cè)定。

不確定度是與測(cè)量結(jié)果相關(guān)聯(lián)的參數(shù)，表征合理地賦予被測(cè)量值的分散性[24]。對(duì)測(cè)量結(jié)果不確定度進(jìn)行考察，可以有效反映檢測(cè)過(guò)程中不同步驟、不同處理方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響情況以及測(cè)量結(jié)果的可靠性，對(duì)于評(píng)定檢測(cè)方法的優(yōu)劣具有重要意義[25]。本試驗(yàn)依據(jù)JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[26]、JJG 20—2001《標(biāo)準(zhǔn)玻璃量器》[27]、JJG 196—2006《常用玻璃量器》[28]和CNAS-GL006—2019《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[29]中不確定度評(píng)定的基本程序，評(píng)定高效液相色譜法測(cè)量濃香型白酒中己酸含量的不確定度，為濃香型白酒的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

己酸標(biāo)準(zhǔn)品（編號(hào)為DRE-C14196000）：LGCDR.GmbH公司（純度98.55%），不確定度U=0.44%；乙腈（液相色譜級(jí)）：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；甲磺酸（色譜級(jí)）：梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；乙醇（色譜級(jí)）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

濃香型白酒樣品：酒精度為55.81%vol（20 ℃），湖北工業(yè)大學(xué)釀酒中試基地提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo U3000 高效液相色譜儀、Acclaim OA色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：賽默飛世爾科技公司；AS 220.R1分析天平：波蘭RADWAG公司；Direct-Q 5 UV純水儀：美國(guó)Millipore公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 HPLC流動(dòng)相的配制

本試驗(yàn)所用HPLC流動(dòng)相包括乙腈、2.5 mmol/L甲磺酸溶液以及100 mmol/L硫酸鈉溶液。

100 mmol/L硫酸鈉溶液：準(zhǔn)確稱取14.204 g硫酸鈉用純水溶解，加入300 μL甲磺酸調(diào)節(jié)pH至2.6后，用純水定容至1 L；2.5 mmol/L甲磺酸溶液：準(zhǔn)確吸取162 μL甲磺酸用純水定容至1 L。上述所配流動(dòng)相經(jīng)0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾，并經(jīng)超聲脫氣30 min后使用。

1.3.2 HPLC分析條件

本試驗(yàn)所用HPLC配備Acclaim OA色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）和紫外檢測(cè)器，柱溫為25 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。流動(dòng)相：（A）100 mmol/L硫酸鈉溶液、（B）乙腈、（C）2.5 mmol/L甲磺酸溶液，流速：0.8 mL/min。梯度洗脫程序?yàn)? min：100%A；6 min：100%A；10 min：100%C；13 min：100%C；20 min：80%B和20%C；25 min：80%B和20%C。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確量取50 μL己酸標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL的容量瓶中，并置于分析天平上稱量其質(zhì)量為45.2 mg，用10%乙醇溶液進(jìn)行定容，得到實(shí)際質(zhì)量濃度為4.45 mg/mL的己酸母液。用量程為100 μL或1 mL的移液器分別吸取0.02 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL的己酸母液置于10 mL的容量瓶中，用純水進(jìn)行定容，得到不同濃度的己酸單標(biāo)，經(jīng)孔徑為0.22 μm的針頭式濾器過(guò)濾后，備用。

1.3.4 酒樣的處理

準(zhǔn)確吸取0.1 mL酒樣，用純水定容至5 mL，搖勻后經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于液相小瓶中作為待測(cè)樣品供HPLC分析。

1.3.5 己酸含量的測(cè)定

樣品中的己酸含量計(jì)算：由HPLC上測(cè)得的己酸的峰面積，根據(jù)Chromeleon 7軟件擬合得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

濃香型白酒中己酸含量的計(jì)算見(jiàn)公式（1）

式中：w為白酒中己酸的含量，mg/L；c為樣品中己酸的測(cè)試濃度，mg/L；V1為吸取樣品量，mL；V2為定容體積，mL。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

由HPLC檢測(cè)得到的數(shù)據(jù)用Chromeleon 7進(jìn)行處理。用Excel 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行不確定度計(jì)算。用Origin 8.5對(duì)不確定度分量作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來(lái)源

從數(shù)學(xué)模型和檢測(cè)過(guò)程分析可知，濃香型白酒中己酸含量不確定度的來(lái)源主要分為兩大類，第一類為被測(cè)量值重復(fù)測(cè)試導(dǎo)致的A類不確定度，第二類為測(cè)試過(guò)程中的影響因素導(dǎo)致的B類不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、樣品的前處理以及儀器性能等幾個(gè)方面，具體如圖1所示。

圖1 測(cè)試過(guò)程中不確定度的分量構(gòu)成Fig.1 Composition of uncertainty component during determination

2.2 不確定度的評(píng)定

2.2.1 A類不確定度的評(píng)定uA（ref）

在濃香型白酒中己酸含量的不確定度評(píng)定過(guò)程中，A類不確定度主要是重復(fù)性試驗(yàn)引入的。對(duì)濃香型白酒樣品在重復(fù)性條件下進(jìn)行6次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果如表1所示。

表1 濃香型白酒中己酸含量的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of repeated experiments for the determination of hexanoic acid content in strong-flavor Baijiu

根據(jù)貝塞爾公式法，己酸測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）為：

A類標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則測(cè)量值的相對(duì)不確定度為：

2.2.2 B類不確定度

（1）移取樣品量引入的相對(duì)不確定度u1（ref）

吸取樣品量V1=0.1 mL，按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[30]的要求計(jì)量，所用100 μL移液器的不確定為u=0.7 μL=0.000 7 mL，k=2，按照均勻分布，則：

移取樣品量引入的相對(duì)不確定度u1（ref）為：

（2）定容體積引入的相對(duì)不確定度u2（ref）

在酒樣處理中將0.1 mL樣品定容至5 mL，V2=5 mL，按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器》[28]的要求計(jì)量，5 mL容量瓶為A級(jí)，其容量允差為±0.015 mL，按均勻分布評(píng)定，則：

容量瓶定容引入的相對(duì)不確定u2（ref）為：

（3）樣品中測(cè)試濃度C的相對(duì)不確定度uC（ref）

①標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量的相對(duì)不確定度uC1（ref）

本試驗(yàn)所用己酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)置于LGC DR.GmbH公司，編號(hào)為DRE-C14196000，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書查得己酸的純度為98.55%，不確定度為U=0.44%，k=2，則

所用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)不確定度為：

②標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)不確定度uC2（ref）

a.稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)不確定度uC21（ref）

用0.1 mg分度的分析天平，準(zhǔn)確稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.045 2 g定容至10mL，配制成標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。分析天平的精度為0.1mg，1級(jí)合格，最大允許誤差為±0.000 5 g，則：

則稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)不確定為：

b.配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的相對(duì)不確定度uC22（ref）

用移液器分別量取0.02 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于10 mL的容量瓶，其中0.02 mL和0.1mL用100μL的移液器移取，經(jīng)校準(zhǔn)其不確定為u=0.7 μL=0.000 7 mL，k=2；0.2 mL、0.4 mL和0.8 mL用1 mL的移液器移取，經(jīng)校準(zhǔn)其不確定度為u=3 μL=0.003 mL，k=2。則：

c.10 mL容量瓶按照J(rèn)JG 196—2006《常用玻璃量器》[28]計(jì)量結(jié)果為A級(jí)，其容量允許誤差為±0.020 mL，則工作溶液定容引起的相對(duì)不確定度為uC23（ref）

則標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)不確定度uC2（ref）為：

③標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)不確定度uC3（ref）

采用HPLC對(duì)配制的己酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度測(cè)定兩次，得到相應(yīng)的峰面積A，用Chromeleon 7軟件對(duì)測(cè)定的結(jié)果擬合得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，其結(jié)果如表2所示。

表2 擬合己酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度-峰面積結(jié)果Table 2 Fitting result of concentration-peak area of hexanoic acid standard solution

表3 高效液相色譜儀測(cè)定己酸的結(jié)果Table 3 Determination results of caproic acid by HPLC

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)不確定度為：

④測(cè)試過(guò)程中儀器穩(wěn)定性引入的不確定度uC4（ref）

液相色譜儀按照J(rèn)JG 705—2014《液相色譜儀檢定規(guī)程》[31]校準(zhǔn)，其整機(jī)定量重復(fù)性為0.8%，按均勻分布原則其包含因子為，測(cè)試時(shí)由儀器狀態(tài)引入的相對(duì)不確定度為：

則樣品中測(cè)試濃度C的相對(duì)不確定度為：

綜上所述B類不確定度主要由量取樣品、樣品定容、樣品濃度測(cè)試三個(gè)方面的因素組成，則uB（ref）：

2.3 結(jié)果報(bào)告

2.3.1 濃香型白酒中己酸測(cè)量值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc

濃香型白酒中己酸測(cè)量結(jié)果的不確定度，主要來(lái)源于以上提及的A類不確定度分量和B類不確定度分量。由評(píng)定過(guò)程可知，各不確定度分量之間相互獨(dú)立，則相對(duì)合成不確定度為：

濃香型白酒中己酸測(cè)量值w=2.724 g/L，則合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

合成不確定度報(bào)告為：w=2.72 g/L，uc=0.09 g/L

2.3.2 濃香型白酒中己酸的擴(kuò)展不確定度U

取包含因子k=2，U=2×0.09 g/L=0.18 g/L，則報(bào)告擴(kuò)展不確定度為：

在濃香型白酒己酸含量的測(cè)定過(guò)程中，結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于測(cè)量重復(fù)性、酒樣的稀釋與定容、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等幾個(gè)方面，測(cè)量的不確定度分量見(jiàn)圖2。如圖2可知，對(duì)不確定度影響最大的因素是標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制uC2（ref）。從uC2（ref）的計(jì)算公式可知，在配制最低濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，選用100 μL的移液器量取20 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL，對(duì)此項(xiàng)不確定度的貢獻(xiàn)值最大；其次，是選用1 mL的移液器量取200 μL的標(biāo)準(zhǔn)溶液定容至10 mL。這是由于選用的移液器的量程相對(duì)于取液量太大，造成其相對(duì)不確定度較大。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，可擴(kuò)大樣品的體系，如量取100 μL定容至100 mL、量取1 mL定容至50 mL；或者選取量程與取液量接近的移液器，如量程為20 μL、200 μL的移液器量取相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，盡可能減少由于標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度。此外，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)不確定度也較大。由于斜率和截距是由Chromeleon 7根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度和儀器測(cè)得的對(duì)應(yīng)峰面積擬合得到，因此在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，要盡量保持儀器的穩(wěn)定狀態(tài)和較高的靈敏度，以減小測(cè)量過(guò)程中的不確定度。

圖2 測(cè)量不確定度分量Fig.2 Determination of uncertainty components

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)高效液相色譜法測(cè)定濃香型白酒中己酸含量的不確定度分析可知，測(cè)定結(jié)果的不確定度主要來(lái)源于樣品的重復(fù)測(cè)定A類不確定度、測(cè)定過(guò)程中樣品的量取與定容、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及儀器穩(wěn)定性等部分。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制對(duì)合成不確定度的影響較大，在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)選取量程合適的移液器、容量瓶，從而降低這一貢獻(xiàn)值。此外，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要選用校準(zhǔn)合格的量具，嚴(yán)格要求實(shí)驗(yàn)人員按照標(biāo)準(zhǔn)操作，確保儀器穩(wěn)定運(yùn)行，從而保障檢測(cè)結(jié)果的確定性。本文的研究結(jié)果可為白酒中乙酸、丁酸、乳酸和戊酸等其它有機(jī)酸類含量的測(cè)定以及不確定度評(píng)定提供參考。