UPLC-MS/MS法測定茶葉中丙烯酰胺

尚遠(yuǎn)宏，田金鳳 *，張 喆，孫卓然

（1.攀枝花學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，四川 攀枝花 617000；2.呼和浩特市疾病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010070）

茶作為一種快消飲品，其茶湯通過自身的香氣和滋味來滿足人們的飲用需求。在我國，綠茶、紅茶和烏龍茶是人們普遍愛飲的茶類，其消費量逐年增加。同時，國家市場監(jiān)督管理局頒布的《食品生產(chǎn)許可分類目錄》中“茶葉及相關(guān)制品”里的“茶葉”項下包含了綠茶、紅茶和烏龍茶，說明茶葉屬于食品，可以進(jìn)行市場流通。綠茶（炒青、烘青、曬青和蒸青四大類）為不發(fā)酵茶，其工序主要包括殺青、揉捻、干燥三個過程[1]；紅茶屬于完全發(fā)酵茶，為北方人所喜歡，主要加工技術(shù)為萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等[2]；烏龍茶屬于半發(fā)酵茶，主產(chǎn)于福建、廣東、中國臺灣三省，其加工過程主要分為萎調(diào)、做青、殺青、做形和干燥等[3]。茶葉生產(chǎn)過程中可能產(chǎn)生的有毒物質(zhì)丙烯酰胺現(xiàn)成為人們關(guān)注的焦點問題，丙烯酰胺屬于二類致癌物[4]，存在于一些不同的熱處理食品（油炸土豆片、烘焙咖啡、焙烤面包和綠茶[5-6]等）中，而茶葉中的丙烯酰胺的來源可能主要集中在殺青或干燥處理（高溫）階段。在我國目前標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.204—2014《食品中丙烯酰胺的測定》中尚未有確規(guī)定茶葉中丙烯酰胺的限量標(biāo)準(zhǔn)[7]，而歐盟正式實施了關(guān)于丙烯酰胺的法案，對常見食物中的丙烯酰胺含量限值大多在300～850 μg/kg，因此，我國在茶葉生產(chǎn)中也應(yīng)嚴(yán)格控制丙烯酰胺形成途徑，并有必要建立茶葉中丙烯酰胺的痕量檢測方法。

丙烯酰胺是在高溫油炸或食品烘烤過程中因美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的副產(chǎn)物[8]，即高溫易產(chǎn)生丙烯酰胺，它對人體有神經(jīng)毒性和潛在的致癌性[9]。目前關(guān)于茶葉中的丙烯酰胺的檢測報道較少，且鑒于一般的化學(xué)分析不能達(dá)到分析的要求，在實際應(yīng)用的檢測方法主要以儀器分析為主，當(dāng)前已報導(dǎo)的檢測手段為氣相色譜法[10]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-13]。然而，茶葉中成分復(fù)雜、干擾物較多，以現(xiàn)有的方法很難快速準(zhǔn)確地分析低含量的丙烯酰胺。為了提高測定的靈敏度和準(zhǔn)確度，本研究研究結(jié)合固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）技術(shù)，利用同位素內(nèi)標(biāo)法定量（該法抵消了上樣體積，乃至流動相、檢測器的影響和在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差，有效提高方法的準(zhǔn)確度和精密度），建立超高效液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-MS/MS）法測定茶葉中的丙烯酰胺，并在前人研究工作的基礎(chǔ)上[12-13]，適當(dāng)改進(jìn)樣品前處理方法，先經(jīng)過正己烷（除去低極性化合物）和乙腈等溶劑提取后經(jīng)搖床振搖，目的為充分除雜和增加丙烯酰胺提取效率。同時，在茶葉生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制丙烯酰胺形成途徑和建立丙烯酰胺的痕量檢測方法，可應(yīng)用于茶葉的食品安全風(fēng)險監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

綠茶、紅茶和烏龍茶：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

甲酸、乙腈（均為色譜級）：美國Fisher公司；丙烯酰胺、13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高效液相色譜-6460串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀：美國Agilent公司；MCX固相萃取柱（800 mg/6 mL）、1-14k離心機(jī)：美國Sigma公司；NEVAP-45氮吹儀：美國Organomation公司；FA2014B電子天平：上海越平實驗有限公司；Milli-Q IQ7000超純水器：美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱取0.010 0 g丙烯酰胺或13C3-丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至10 mL，質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，-20 ℃避光保存。其他質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液用水定量稀釋即得。

1.3.2 樣品前處理

分別稱取茶葉樣品2 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中，加入100 μL13C3-丙烯酰胺內(nèi)標(biāo)液（4 mg/L），加9 mL水并渦旋使試樣分散，再加入5 mL正己烷和10 mL乙腈渦旋1 min后，加入1.5 g無水醋酸鈉和6 g無水硫酸鎂，室溫下?lián)u床振搖1 h，4 ℃、10 000 r/min離心8 min后，取乙腈層3 mL過MCX固相萃取柱，收集乙腈溶液，在氮氣下吹干，用0.3mL水溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后，即得樣品溶液。

1.3.3 UPLC-MS/MS分析

超高效液相色譜（UPLC）條件：Waters BEH-C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～1.2 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%；1.2～3.0 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)由10%線性升至90%；3.0～4.5 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為90%；4.5～5.0 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)由90%線性降至10%；5～6 min，乙腈體積分?jǐn)?shù)為10%；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.2 mL/min。

質(zhì)譜（MS）條件：電子電離（electronic ionization，EI）源；掃描方式：正、負(fù)離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiplereaction monitoring，MRM）；電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）電壓：3 500 V；輔助氣溫度：300 ℃；輔助氣流速：10 L/min。丙烯酰胺的MRM監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)見表1。定性定量方法參照文獻(xiàn)[14]。

表1 丙烯酰胺分析的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of acrylamide analysis

1.3.4 建立標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定檢出限

用空白綠茶基質(zhì)提取液將200 μg/L丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稀釋成5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L和80 μg/L、160 μg/L系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中含內(nèi)標(biāo)13C3-丙烯酰胺50 μg/L，分別進(jìn)行測定。以丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，定量離子峰面積（y）為縱坐標(biāo)，采用內(nèi)標(biāo)法建立丙烯酰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比（S/N＞3）和10倍信噪比（S/N＞10）分別確定方法檢出限與方法定量限[15-17]。

1.3.5 精密度試驗

取茶葉樣品2 g，按1.3.2節(jié)樣品前處理后，其樣品溶液再按1.3.3節(jié)儀器條件進(jìn)樣，進(jìn)行6次平行試驗。根據(jù)測定的峰面積計算其質(zhì)量濃度，并計算分析結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 加標(biāo)回收率試驗

分別于綠茶、紅茶、烏龍茶基質(zhì)中添加標(biāo)準(zhǔn)液（5 μg/kg、25 μg/kg、100 μg/kg）3個水平下，搖勻、靜置后按1.3.2節(jié)方法處理，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，考察該方法的準(zhǔn)確性。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗所得數(shù)據(jù)為3次重復(fù)實驗結(jié)果的平均值，采用Microsoft Excel 2010軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，通過Origin 7.5軟件進(jìn)行制圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件和儀器條件優(yōu)化

提取條件中，樣品提取過程中用正己烷目的是先將低極性化合物除去[18]，用醋酸鈉可以加大樣品中水的離子強(qiáng)度，通過鹽析作用將待測樣品中水層和乙腈層分離，而無水硫酸鎂與水分子結(jié)合起到除水作用[19]。儀器條件中，少量甲酸在色譜條件中主要目的是改善峰形，同時也為丙烯酰胺提供必需的質(zhì)子來源，提高其離子化效率；在ESI+模式下，丙烯酰胺和13C3-丙烯酰胺經(jīng)過兩級碰撞掃描后，出現(xiàn)不同強(qiáng)度的離子碎片，通過離子強(qiáng)度相加可得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液總的離子流強(qiáng)度。丙烯酰胺在20.0 μg/L時的MRM總離子色譜圖見圖1。

圖1 丙烯酰胺混標(biāo)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of acrylamide mixed standard solution

2.2 方法的線性關(guān)系及檢出限

丙烯酰胺的線性范圍、線性方程及相關(guān)系數(shù)見表2。由表2可知，丙烯酰胺在質(zhì)量濃度5.0～160.0 μg/L線性范圍內(nèi)其線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（R2）＞0.999。檢出限（detection limit，LOD）為0.5 μg/kg，定量限（limit of quantitation，LOQ）為1.5 μg/kg，其方法的靈敏度能滿足檢測要求。

表2 丙烯酰胺的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equation,linear range,and correlation coefficient of acrylamide

2.3 方法的精密度試驗

茶葉樣品經(jīng)前處理后進(jìn)樣，平行測定6次，實驗結(jié)果見表3，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.73%，表明該檢測方法的精密度符合要求。

表3 精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of precision tests

2.4 方法的加標(biāo)回收率試驗

丙烯酰胺加標(biāo)回收率試驗結(jié)果見表4。由表4可知，丙烯酰胺在茶葉中的平均回收率范圍為88.0%～96.8%，回收率測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.75%～5.78%。結(jié)果表明，該檢測方法的準(zhǔn)確度度符合要求。

表4 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of standard recovery rate tests

2.5 實際樣品分析

按試驗方法對市售茶葉20個樣品中丙烯酰胺的含量進(jìn)行分析，結(jié)果見表5。

表5 不同茶葉樣品中丙烯酰胺的含量測定結(jié)果Table 5 Determination results of acrylamide contents in different tea samples

由表5可知，茶葉樣品中丙烯酰胺的含量均＜150μg/kg，低于歐盟對常見食物中的丙烯酰胺含量限定范圍（300～850 μg/kg），說明國內(nèi)市場流通的茶葉中丙烯酰胺的含量是相對安全的。其中，除8個茶葉樣品未檢出之外，紅茶中丙烯酰胺的含量范圍在10.5～146 μg/kg；綠茶中丙烯酰胺的含量范圍在10.9～88.6 μg/kg；烏龍茶中丙烯酰胺的含量范圍在7.92～13.2 μg/kg；表明綠茶和烏龍茶的丙烯酰胺含量相對較低，而丙烯酰胺含量不同可能是由于對不同茶葉加工過程中丙烯酰胺的產(chǎn)生因素不同導(dǎo)致，或者由于綠茶提取物或茶中的兒茶素等作為強(qiáng)抗氧化物質(zhì)降低丙烯酰胺含量的作用[20-23]。

3 結(jié)論

綠茶、紅茶和烏龍茶作為市場流通的常見茶葉產(chǎn)品，其產(chǎn)品中的丙烯酰胺含量將逐漸引起人們越來越多的重視和關(guān)注。雖然我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)尚未明確茶葉中丙烯酰胺的限量，但由于丙烯酰胺對人體可能存在健康風(fēng)險[24-26]，非常有必要對茶葉中的丙烯酰胺含量進(jìn)行檢測和監(jiān)控。本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分析綠茶、紅茶和烏龍茶中丙烯酰胺含量的測定方法。該方法前處理操作簡單，儀器靈敏度高，回收率和重現(xiàn)性符合檢測要求，其檢測定量限（LOQ）為1.5 μg/kg，低于GB 5009.204—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙烯酰胺的測定》中的檢測限（10 μg/kg），在實際檢測中具有較強(qiáng)的可行性和實用性，為食品安全風(fēng)險監(jiān)測茶葉樣品中丙烯酰胺含量的檢測方法和限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了一定的參考依據(jù)。