葡萄酒中桔青霉素快速檢測間接競爭ELISA方法的建立

王 一，寧 茜，張 源，姜宇航，裴世春 *，趙小旭，趙 鋼

（1.通化師范學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 通化 134001；2.山東美正生物科技有限公司，山東 日照 276800；3.蘇州諾威百奧生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215000）

桔青霉素（citrinin，CIT）是引起腎臟毒性的真菌毒素之一[1]，在紅曲產(chǎn)品、發(fā)霉水果、霉變糧食及其相關(guān)食品中檢出率極高[2]。已有的研究表明，紅曲霉、青霉和曲霉等霉菌是引起食品中桔青霉素殘留的主要原因，其中紫色紅曲霉（Monascus purpureus）、紅色紅曲霉（Monascus ruber）、橙色紅曲霉（Monascus aurantiacus）、叢毛紅曲霉（Monascus pilosus）、血紅紅曲霉（Monascus sanguineus）、安卡紅曲霉（Monascus anka）等紅曲霉，糾纏青霉（Penicillium implicatum）、癭青霉（Penicillium fellutanum）、黃綠青霉（Penicilli-um citreoviridin）、點(diǎn)青霉（Penicillium notatum）、擴(kuò)展青霉（Penicillium expansum）、詹森青霉（Penicillium jensenii）等青霉以及土曲霉和白曲霉等曲霉已被報道為桔青霉素產(chǎn)毒菌[1，3-5]。

葡萄酒是以釀酒葡萄為原料，經(jīng)過長時間釀造而成的酒精飲料，由于釀酒葡萄在生長期、采摘期、存儲期和釀造過程中易被各種霉菌污染，其中灰霉菌、青霉和曲霉是在葡萄中常被分離到的霉菌[6-11]，而這些從釀酒葡萄中分離鑒定的霉菌有一些菌與桔青霉素產(chǎn)毒菌一致，因此，從保障消費(fèi)者飲用葡萄酒的安全性考慮，有必要對國內(nèi)葡萄酒產(chǎn)品中的桔青霉素殘留狀況進(jìn)行檢測和風(fēng)險評估。

目前，我國國標(biāo)GB 5009.222—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中桔青霉素的測定》中規(guī)定桔青霉素的檢測方法為免疫親和柱凈化-高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和C18固相萃取小柱凈化-高效液相色譜法[12]，這兩種方法在批量樣品檢測時需要大量的免疫親和柱或C18固相萃取小柱用于樣品前處理，不僅耗時而且檢測成本也很高，不利于大批量樣品的篩查。為此，本研究利用桔青霉素不同基團(tuán)制備全抗原，經(jīng)免疫小鼠后篩選最佳配對的抗血清和包被抗原，構(gòu)建適合葡萄酒直接上樣檢測桔青霉素的高效間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay，IC-ELISA）方法，該方法可免除桔青霉素的提取、凈化過程，而且可以利用96孔板從批量樣品中快速篩選陽性樣品，為葡萄酒中桔青霉素安全性評估提供了高效率的檢測工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒：市售；桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）、展青霉素（純度＞99%）、黃曲霉毒素B1（純度＞98%）、沙丁胺醇（純度＞98%）、1,4-丁二醇二縮水甘油醚（純度＞93%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（純度98%）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（純度98%）、血藍(lán)蛋白（keyhole limpet hemocyanin，KLH）（純度85%）、N-羥基丁二酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）（純度98%）、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺（N,N'-dicyclohexylcarbodiimide，DCC）（純度99%）、二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）（純度99%）、弗氏完全佐劑（純度99%）、弗氏不完全佐劑（純度98%）、Tween-20（純度99%）：美國Sigma公司；BALB/c小鼠：齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物部；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

桔青霉素免疫親和柱：北京華安麥科生物科技有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；HF4500酶標(biāo)儀：北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；3K15低溫高速離心機(jī)：美國Sigma公司；MS204精密分析天平：瑞士Metter公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原偶聯(lián)

（1）基于桔青霉素羥基的蛋白偶聯(lián)

基于桔青霉素羥基的蛋白偶聯(lián)見圖1。

圖1 基于桔青霉素羥基的蛋白偶聯(lián)Fig.1 Protein conjugation based on citrulin hydroxyl

具體方法：準(zhǔn)確稱取桔青霉素2.5 mg溶于1 mL NaOH（0.6 mol/L）溶液中，加入2.5 mL NaBH4（2 mg/mL）和2.5 mL 1,4-丁二醇二縮水甘油醚，室溫反應(yīng)4 h。取0.5 mL溶于碳酸鹽緩沖溶液的偶聯(lián)用蛋白（5 mg/mL）添加到活化的桔青霉素溶液中，37 ℃孵育24 h，分別制備CIT-BSA（OH）、CIT-OVA（OH）和CIT-KLH（OH）偶聯(lián)物。CIT-BSA（OH）、CIT-OVA（OH）和CIT-KLH（OH）偶聯(lián)物用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）在4 ℃透析48 h，凍干保存在冰箱中待用。

（2）基于桔青霉素羧基的蛋白偶聯(lián)

基于桔青霉素羧基的蛋白偶聯(lián)見圖2。

圖2 基于桔青霉素羧基的蛋白偶聯(lián)Fig.2 Protein conjugation based on citrulin carboxyl

具體方法：準(zhǔn)確稱取桔青霉素1 mg溶于0.3 mL DMF溶液中，加入2 mg NHS和3 mg DCC室溫孵育過夜。取2 mL溶于碳酸鹽緩沖溶液的偶聯(lián)用蛋白（2.5 mg/mL）滴加到活化的桔青霉素溶液中，冷藏孵育24 h，分別制備的CIT-BSA（COOH）、CIT-OVA（COOH）和CIT-KLH（COOH）偶聯(lián)物。CIT-BSA（COOH）、CIT-OVA（COOH）和CIT-KLH（COOH）偶聯(lián)物用0.01 mol/L的PBS在4 ℃透析48 h，凍干保存在冰箱中待用。

（3）基于桔青霉素活潑氫的蛋白偶聯(lián)

基于桔青霉素活潑氫的蛋白偶聯(lián)見圖3。具體方法：準(zhǔn)確稱取桔青霉素1 mg溶于0.2 mL甲醇溶液中，取0.8 mL溶于乙酸鈉（pH 4.2）緩沖溶液的偶聯(lián)用蛋白（6 mg/mL）添加到活化的桔青霉素溶液中，加入37%的甲醛溶液混勻，37 ℃反應(yīng)24 h，分別制備的CIT-BSA（H）、CIT-OVA（H）和CIT-KLH（H）偶聯(lián)物。CIT-BSA（H）、CIT-OVA（H）和CIT-KLH（H）偶聯(lián)物用0.01 mol/L的PBS在4 ℃透析3 d，凍干保存在冰箱中待用。

圖3 基于桔青霉素活潑氫的蛋白偶聯(lián)Fig.3 Protein conjugation based on citrulin active hydrogen

1.3.2 免疫小鼠

27只BALB/c小鼠分為9組，將基于羥基偶聯(lián)、羧基偶聯(lián)和活潑氫偶聯(lián)的CIT-BSA（OH）、CIT-OH-OVA（OH）、CIT-KLH（OH）、CIT-BSA（COOH）、CIT-OVA（COOH）、CITKLH（COOH）、CIT-BSA（H）、CIT-OVA（H）、CIT-KLH（H）全抗原分別溶解于0.01 mol/L的無菌PBS中，與等體積的弗氏完全佐劑乳化后每隔2周免疫一次，每組小鼠分別皮下和腹腔注射全抗原10～20 μg/只，共免疫3次。3次免疫后10 d從尾部采血，采用間接ELISA法測定抗體效價，血清效價超過1∶3 200的小鼠用等體積不完全弗氏完全佐劑乳化全抗原后進(jìn)行增強(qiáng)免疫。

1.3.3 最佳配對抗血清和包被抗原的篩選

采用間接競爭ELISA法篩選最佳配對抗血清和包被抗原。以溶解于0.2 mol/L碳酸鈉緩沖溶液（pH 9.6）的1 μg/mL偶聯(lián)物按100 μL/每孔添加到96孔板孵育過夜。用含1.5%吐溫20的PBS洗滌4次，每孔加入200 μL含5%脫脂奶粉的PBS，37 ℃孵育45 min。用含1.5%吐溫20的PBS洗滌4次，每孔分別加入含5%脫脂奶粉的PBS倍比稀釋的小鼠抗血清50 μL和競爭抗原（桔青霉素質(zhì)量濃度1 μg/L）的PBS溶液50 μL，以添加PBS 50 μL為對照，37 ℃孵育1 h。用含1.5%吐溫20的PBS洗滌4次，按100 μL/每孔加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化物酶（horse radish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，37 ℃孵育1 h后，每孔加入100 μL 3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine，TMB），37 ℃反應(yīng)15 min，加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測定吸光度值。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及交叉反應(yīng)性[13-14]

選用最佳的包被抗原和抗血清稀釋倍數(shù)，將此抗血清分別和質(zhì)量濃度分別為0.01 μg/L、0.100 μg/L、1.00 μg/L、10.00 μg/L、100.00 μg/L、1 000 μg/mL的桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液等體積混合后，按照100 μL/孔添加到包被全抗原的96孔板，以相同質(zhì)量濃度的展青霉素、黃曲霉毒素B1、沙丁胺醇和萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液為對照，進(jìn)行間接競爭ELISA。將質(zhì)量濃度為0.01 μg/L的化合物的OD450nm值用B0表示，各稀釋倍數(shù)的化合物質(zhì)量濃度的OD450nm值用B表示，以化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），B/B0（%）為縱坐標(biāo)（y），建立桔青霉素及其他化合物檢測間接競爭ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后利用Origin 8.1軟件包分別求出CIT和其他化合物對抗血清的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值。最后計(jì)算制備的抗血清與其他化合物的交叉反應(yīng)率（cross reaction rate，CR），其計(jì)算公式如下：

1.3.5 葡萄酒中桔青霉素的測定效果分析

選用最優(yōu)全抗原和抗血清構(gòu)建間接競爭ELISA檢測桔青霉素體系，為了評估葡萄酒中的酒精含量對構(gòu)建的桔青霉素IC-ELISA檢測體系的影響，在葡萄汁樣品中添加乙醇體積分?jǐn)?shù)為14%，以添加14%水的葡萄汁為對照，在樣品中分別添加質(zhì)量濃度為1 μg/L、10 μg/L、50 μg/L的桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行間接競爭ELISA測定，計(jì)算加標(biāo)回收率，其計(jì)算公式如下：

并分析乙醇體積分?jǐn)?shù)對檢測方法的影響，通過加標(biāo)回收試驗(yàn)分析葡萄酒直接上樣檢測的效果。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Origin 8.1軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳配對抗血清和包被抗原的確定

有研究表明[15-19]，利用桔青霉素偶聯(lián)蛋白的全抗原具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性。本研究在9種包被抗原和9種抗血清配對組合構(gòu)建的81對IC-ELISA體系中，有25對有效組合中的抗血清的效價＞1∶3 200，在檢測桔青霉素標(biāo)品質(zhì)量濃度0 μg/L和1 μg/L之間的OD450nm值可以相差1.2以上，陰性結(jié)果與陽性結(jié)果的比值（P/N）可以大于5，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，利用桔青霉素的羥基、羧基和活潑氫與不同蛋白質(zhì)偶聯(lián)均可篩選出具有良好免疫效價的組合，但是基于同一個基團(tuán)偶聯(lián)不同蛋白質(zhì)組合的配對包被抗原與抗血清之間構(gòu)建的競爭性ELISA效果優(yōu)于不同基團(tuán)偶聯(lián)蛋白質(zhì)的組合，基于桔青霉素活潑氫的偶聯(lián)物免疫效果優(yōu)于其他基團(tuán)的偶聯(lián)物，其中基于桔青霉素活潑氫偶聯(lián)的CIT-KLH（H）免疫小鼠所形成的抗血清在稀釋倍數(shù)3 200倍時檢測0 μg/L桔青霉素（陰性）的OD450nm值達(dá)到2.4，與檢測1 μg/L桔青霉素（陽性）的OD450nm值相差最大，為2.1，P/N值為7，其對應(yīng)的包被抗原為基于活潑氫偶聯(lián)的CIT-BSA（H）。因此，確定基于桔青霉素活潑氫偶聯(lián)的免疫原和包被抗原為最佳，經(jīng)過96孔酶標(biāo)板棋盤滴定法確定的最佳全抗原包被質(zhì)量濃度為2 μg/mL，競爭結(jié)合抗血清稀釋倍數(shù)為1∶5 000。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及交叉反應(yīng)性

建立的桔青霉素及其他化合物的間接競爭ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖5。由圖5可知，CIT的抗血清的半數(shù)抑制濃度（IC50）值為9.8 μg/L，檢測范圍在0.1～100 μg/L之間的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.969 88，因此，確定檢測限為0.1 μg/L。而抗血清與其他物質(zhì)的B/B0值均＞50%，說明其他化合物沒有與抗血清發(fā)生競爭性結(jié)合，進(jìn)而說明該抗體只特異性結(jié)合桔青霉素，與其他化合物無交叉反應(yīng)性?？寡宓倪@一特異性保障了該IC-ELISA方法可以對葡萄酒中的桔青霉素進(jìn)行精準(zhǔn)的檢測而不受其他成分的影響。

圖5 桔青霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線及其他化合物的交叉反應(yīng)性Fig.5 Citrinin standard curve and cross reactivity of other compounds

2.3 IC-ELISA法加標(biāo)回收率試驗(yàn)

IC-ELISA法測定葡萄酒中桔青霉素的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 間接競爭ELISA法檢測桔青霉素的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of standard recovery rate test for the detection of citrinin by indirect competitive ELISA

由表1可知，葡萄酒中添加桔青霉素1～50 μg/L，間接競爭ELISA檢測的回收率在92.01%～119.33%之間，加標(biāo)回收率試驗(yàn)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.35%～5.22%，由此可認(rèn)為利用本試驗(yàn)制備的抗血清構(gòu)建的桔青霉素間接競爭ELISA分析體系在對一定桔青霉素污染度范圍的葡萄酒進(jìn)行測定的方法是可行的，該體系在桔青霉素質(zhì)量濃度10～50 μg/L范圍內(nèi)精確度較高，但對于污染度接近1 μg/L的葡萄酒，在測定過程中可能會存在一定的誤差，但考慮到免疫親和柱凈化-高效液相色譜法的檢測限為8 μg/kg和國際上桔青霉素殘留限量標(biāo)準(zhǔn)一般為200 μg/kg或2 000 μg/kg的現(xiàn)狀[20-22]，本試驗(yàn)制備的抗血清以及間接競爭ELISA檢測方法完全可以用于大量葡萄酒樣品中超標(biāo)陽性樣品的初期篩查研究，因此，結(jié)合我國國標(biāo)方法對大量樣品進(jìn)行檢測時可以有效提高檢測工作效率。

由表1亦可知，添加體積分?jǐn)?shù)14%乙醇的葡萄汁樣品和添加等量水的葡萄汁樣品檢測結(jié)果無顯著性差異（P＞0.05），表明低含量的酒精對IC-ELISA檢測結(jié)果無顯著性影響，因此針對葡萄酒進(jìn)行直接上樣檢測是可行性的，而且該方法免除了葡萄酒前處理過程，可以有效提高檢測效率。

另外，在對葡萄汁和葡萄酒空白樣品的檢測過程中發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)采集的葡萄汁和葡萄酒樣品中含有0.34～0.84 μg/L的桔青霉素污染，雖然相對于國外報道的桔青霉素污染度較低[23-24]，但是由于國內(nèi)對葡萄酒中桔青霉素污染程度的調(diào)查分析資料有限[25]，還無法進(jìn)行有效的對比分析來證明國內(nèi)葡萄及葡萄酒的桔青霉素安全性高于國外，這也提示我們未來需要對我國葡萄及其相關(guān)產(chǎn)品開展廣泛的桔青霉素污染度調(diào)查及膳食攝入風(fēng)險的評估研究。

3 結(jié)論

本研究利用桔青霉素結(jié)構(gòu)中的羧基、活潑氫和羥基分別與BSA、OVA、KLH進(jìn)行偶聯(lián)制備了全抗原，經(jīng)小鼠免疫，采用間接競爭ELISA法篩選出具有最佳競爭性反應(yīng)的配對抗血清和包被抗原，其中最佳抗血清為基于桔青霉素活潑氫偶聯(lián)的CIT-KLH（H），與其對應(yīng)的包被原為基于桔青霉素活潑氫偶聯(lián)的CIT-BSA（H），基于此建立的葡萄酒中檢測桔青霉素間接競爭IC-ELISA法的檢測線性范圍為0.1～100 μg/L（相關(guān)系數(shù)R2為0.969 88），檢測限為0.1 μg/L，桔青霉素抗血清半數(shù)抑制濃度（IC50）值為9.8 μg/L，抗血清對沙丁胺醇、萊克多巴胺、展青霉素和黃曲霉毒素B1均沒有交叉反應(yīng)性，該方法在葡萄酒中檢測CIT的加標(biāo)回收率為92.01%～119.33%，加標(biāo)回收率試驗(yàn)的RSD為2.35%～5.22%，體積分?jǐn)?shù)14%的乙醇對IC-ELISA檢測結(jié)果無顯著性影響（P＞0.05），可直接上樣快速檢測葡萄酒中殘留的桔青霉素。