響應(yīng)面法優(yōu)化信陽地區(qū)霉豆渣發(fā)酵工藝和營養(yǎng)成分分析

張 杰，韓亞飛，喬妍妍，游新俠*

（鄭州科技學(xué)院 食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450064）

我國是大豆生產(chǎn)加工大國，豆制品企業(yè)數(shù)量眾多，產(chǎn)生的大豆副產(chǎn)品也較多，副產(chǎn)品中的豆渣水分含量較高，營養(yǎng)成分豐富，不能及時處理容易腐爛變質(zhì)，造成嚴(yán)重的浪費[1]。因此，實現(xiàn)豆渣的再利用，使其變廢為寶成為近年來的研究熱點，主要表現(xiàn)在提取豆渣營養(yǎng)成分[2-5]、制作豆渣飼料[6-9]和開發(fā)豆渣食品[10-12]等方面。

霉豆渣是我國傳統(tǒng)的豆渣食品，主要分布在湖北省和河南省信陽市等地區(qū)，其發(fā)酵工藝為將豆渣加入少量的黃漿水或飲用水均勻攪拌后，進(jìn)行蒸制、翻炒、放涼，手捏成團(tuán)放在干凈的稻草上進(jìn)行自然發(fā)酵，待豆渣表層長出大量白色絨毛即可。它不僅能使豆渣中蛋白質(zhì)和不溶性膳食纖維在一定程度上得到降解，產(chǎn)生奇特的發(fā)酵風(fēng)味，還能增加豆渣中游離氨基酸的含量，提高豆渣的可吸收性和營養(yǎng)性[13]。另有研究表明，發(fā)酵后的霉豆渣具有抗氧化、降血壓、抑制糖尿病和降低膽固醇等多種功能性作用[14-16]。目前，霉豆渣的研究集中在菌種多樣性研究[17-19]、發(fā)酵劑的制備與優(yōu)化[20-22]、營養(yǎng)成分及功能性研究[23-25]等方面，對于霉豆渣的工藝優(yōu)化研究較少。姚英政[26]采用分段發(fā)酵方法對湖北地區(qū)的霉豆渣粑發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定其最佳發(fā)酵工藝為：28 ℃條件下發(fā)酵18 h，降溫至24 ℃發(fā)酵4 h、再降溫至20 ℃發(fā)酵62 h，此時的霉豆渣粑營養(yǎng)價值得到了較大提升。

傳統(tǒng)霉豆渣的制作主要是依照工作人員的經(jīng)驗，以當(dāng)?shù)丨h(huán)境中特有的霉菌作為發(fā)酵劑進(jìn)行自然發(fā)酵，因此不同地區(qū)霉豆渣的制作工藝和口味略有差別。本試驗以干豆渣粉為主要原料制備霉豆渣，參照河南信陽的霉豆渣制作工藝，以純發(fā)酵劑代替天然發(fā)酵劑，感官評分及氨基酸態(tài)氮含量為評價指標(biāo)，采用單因素試驗及響應(yīng)面法對其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對霉豆渣營養(yǎng)成分進(jìn)行分析，為霉豆渣的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論支持，以期為傳統(tǒng)美食霉豆渣進(jìn)行推廣。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干豆渣粉：鄭州市祥云食品有限公司；毛霉菌粉（10 000 CFU/mg）：沂水錦潤生物科技有限公司；體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；石油醚（30～60 ℃）：鄭州派尼化學(xué)試劑廠；熱穩(wěn)定α-淀粉酶（酶活10 000 U/mL）、蛋白酶液（酶活300～400 U/mL）、淀粉葡萄糖苷酶液（酶活2 000～3 000 U/mL）：上海藍(lán)季生物試劑有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1204型分析天平：上海力辰儀器科技有限公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海森信實驗儀器有限公司；HH-1型電熱恒溫水浴鍋：北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；UV-4802型紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；DZF-6050A型真空干燥箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；BBS-SDC型超凈工作臺：濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；BSXT-02型索氏抽提器：上海賀帆儀器有限公司；KDN-08B（04B）型凱氏定氮儀：上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；YXQ-50A型立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 方法

1.3.1 霉豆渣發(fā)酵工藝流程及操作要點[22]

干豆渣粉預(yù)處理→浸泡→滅菌→接種→攪拌成型→發(fā)酵→霉豆渣

操作要點：

干豆渣粉預(yù)處理：挑選干燥、無霉?fàn)€、不變質(zhì)的豆渣粉，過60目篩后備用。

浸泡：準(zhǔn)確稱取100 g預(yù)處理過的干豆渣粉，添加質(zhì)量比為80%的純凈水混合攪拌均勻，室溫下浸泡12 h。

滅菌：浸泡好的豆渣在115 ℃條件下滅菌30 min。

接種：取干豆渣粉質(zhì)量的2%的發(fā)酵菌種溶于少量蒸餾水中，無菌環(huán)境下，采用直投式的方法接入滅過菌的豆渣中，混合均勻。

攪拌成型：用手將接種好的豆渣，捏制成團(tuán)，置于干燥的豆腐框中，框上依次覆蓋一層帶小孔的保鮮膜和一層豆腐蓋布，便于豆渣的保濕和發(fā)酵菌種的呼吸。

發(fā)酵：將接種過的濕豆渣放置于發(fā)酵箱中，28 ℃條件下發(fā)酵48 h，直至菌絲完全覆蓋表面，霉香味濃郁，發(fā)酵完成。

1.3.2 霉豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

以100 g干豆渣粉為基礎(chǔ)，設(shè)定水分添加量分別為70%、75%、80%、85%、90%，菌種添加量分別為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%，溫度分別為24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃，發(fā)酵時間分別為24 h、36 h、48 h、60 h、72 h，進(jìn)行單因素試驗，考察水添加量、菌種添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對霉豆渣感官評分和氨基酸態(tài)氮含量的影響，其中以感官評價為主要評價指標(biāo)。

1.3.3 霉豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取對結(jié)果影響較大的水添加量（A）、菌種添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）、發(fā)酵時間（D）為自變量，以感官評分為響應(yīng)值（Y），進(jìn)行4因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面試驗，因素與水平見表1。

表1 霉豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for Meitauza fermentation process optimization

1.3.4 霉豆渣的感官評價

選取10名感官評價人員從霉豆渣的外觀（20分）、氣味（30分）、滋味（30分）、質(zhì)地（20分）四個方面進(jìn)行評價，滿分為100分，并取平均值，霉豆渣的感官評分標(biāo)準(zhǔn)[13]見表2。

表2 霉豆渣的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of Meitauza

續(xù)表

1.3.5 霉豆渣理化指標(biāo)的檢測方法

氨基酸態(tài)氮含量的測定：根據(jù)GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測定》中的比色法進(jìn)行；蛋白質(zhì)含量的測定：根據(jù)GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的凱氏定氮法進(jìn)行；脂肪含量的測定：根據(jù)GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法進(jìn)行；膳食纖維含量的測定：根據(jù)GB 5009.88—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》進(jìn)行；總酸含量的測定：根據(jù)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》進(jìn)行。

1.3.6 試驗數(shù)據(jù)處理方法

利用OriginLab OriginPro 8.5和Design Expert.V8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 水分添加量對霉豆渣品質(zhì)的影響

水分添加量對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖1。

圖1 水分添加量對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.1 Effect of water addition on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由圖1可知，當(dāng)水分添加量為70%～85%時，由于含水量較低，不利于微生物的生長，發(fā)酵出的霉豆渣表面菌絲較稀疏，質(zhì)地較為松軟，氨基酸態(tài)氮含量相對較低，表明霉豆渣中游離氨基酸含量較低；當(dāng)水分添加量為85%時，水分充足，微生物生長迅速，霉豆渣表面覆蓋稠密菌絲，質(zhì)地軟硬適中，彈性較好，霉香味濃郁，滋味鮮美，具有霉豆渣特殊風(fēng)味，此時感官評分和氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，分別為83.5分、7.89 mg/g；當(dāng)水分添加量＞85%之后，霉豆渣含水量較高，呈糊狀，質(zhì)地偏軟，彈性較差，口感過于綿軟，感官評分有所下降，微生物生長依舊迅速，氨基酸態(tài)氮含量相對穩(wěn)定不變。綜合考慮，最佳水分添加量為85%。

2.1.2 菌種添加量對霉豆渣品質(zhì)的影響

菌種添加量對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖2。

圖2 菌種添加量對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.2 Effect of culture addition on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由圖2可知，當(dāng)菌種添加量為1.0%～2.0%時，霉豆渣的感官評分與氨基酸態(tài)氮含量隨菌種添加量增加而上升；當(dāng)菌種添加量為2.0%時，霉豆渣口感和滋味達(dá)到最佳，感官評分達(dá)到最高，氨基酸態(tài)氮含量較高，分別為80.5分、7.90 mg/g；當(dāng)菌種添加量為2.0%～2.5%時，霉豆渣開始出現(xiàn)氨味，影響霉豆渣整體風(fēng)味，感官評分開始下降，氨基酸態(tài)氮含量繼續(xù)緩慢升高；當(dāng)菌種添加量為2.5%時，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，為8.52 mg/g；當(dāng)菌種添加量＞2.5%之后，過量的微生物開始消耗部分游離氨基酸，氨基酸態(tài)氮含量逐漸下降。綜合考慮，最佳菌種添加量為2.0%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對霉豆渣品質(zhì)的影響

發(fā)酵溫度對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為24～28 ℃時，溫度偏低導(dǎo)致霉菌生長繁殖及代謝活動較為緩慢，發(fā)酵不充分，霉豆渣表面菌絲較為稀疏，內(nèi)外顏色不一，風(fēng)味不夠明顯；隨著發(fā)酵溫度的升高，霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量逐漸上升，當(dāng)發(fā)酵溫度達(dá)到28 ℃時，霉菌生長迅速，發(fā)酵速度加快，霉豆渣表面菌絲密且長，霉香味明顯，煎炸之后有明顯香味與鮮味，此時感官評分和氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，分別為85.6分、8.10 mg/g；當(dāng)發(fā)酵溫度高于28 ℃之后，雜菌開始繁殖代謝，消耗霉豆渣中的營養(yǎng)物質(zhì)，氨基酸態(tài)氮含量緩慢降低，豆渣出現(xiàn)腐爛味，導(dǎo)致感官評分下降。綜合考慮，最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.1.4 發(fā)酵時間對霉豆渣品質(zhì)的影響

發(fā)酵時間對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響見圖4。

圖4 發(fā)酵時間對霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on sensory score and amino nitrogen contents of Meitauza

由圖4可知，隨著發(fā)酵時間在24～72 h范圍內(nèi)的增加，霉豆渣感官評分呈先增加后下降的趨勢，氨基酸態(tài)氮含量呈先上升后緩慢降低的趨勢。當(dāng)發(fā)酵時間在24～48 h之間時，霉菌處于增殖階段，降解蛋白質(zhì)速度低，游離氨基酸含量較少，霉豆渣風(fēng)味不明顯；當(dāng)發(fā)酵時間為48 h時，霉豆渣感官評分與氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到最高，分別為82.6分、8.03 mg/g；當(dāng)發(fā)酵時間＞48 h之后，發(fā)酵時間過長，霉豆渣出現(xiàn)腐爛味與氨味，影響整體風(fēng)味，導(dǎo)致感官評分降低。綜合考慮，最佳發(fā)酵時間為48 h。

2.2 霉豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以感官評分（Y）作為響應(yīng)值，水分添加量（A）、菌種添加量（B）、發(fā)酵溫度（C）和發(fā)酵時間（D）為自變量，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，篩選出霉豆渣的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)，響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3，方差分析見表4。

表3 霉豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface tests for Meitauza fermentation process optimization

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

續(xù)表

采用Design Expert.V8.0.6數(shù)據(jù)分析軟件對表3響應(yīng)面試驗的結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到模型的二次多項回歸方程為：

由表4可知，該模型P＜0.000 1，極顯著，說明通過本次霉豆渣發(fā)酵工藝優(yōu)化結(jié)果很好；失擬項P=0.070 1＞0.05，不顯著，說明理論和實際值偏差較小，擬合度較高，可以通過得到的回歸擬合方程預(yù)測結(jié)果。一次項A、C、D、交互項AD、BD及二次項A2、B2、C2、D2對霉豆渣感官評分的影響極顯著（P＜0.01）。決定系數(shù)R2=0.979 1，說明此模型相關(guān)度良好，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=0.958 1，表明此模型中的95.81%霉豆渣的感官評分變化來自于自變量A、B、C、D。通過F值大小和顯著水平可知，影響感官評分的各因素順序為發(fā)酵時間（D）＞發(fā)酵溫度（C）＞水添加量（A）＞菌種添加量（B）。

2.2.2 交互作用響應(yīng)面分析

各因素間交互作用影響霉豆渣感官評分的響應(yīng)曲面圖及等高線見圖5。

圖5 各因素間交互作用對霉豆渣感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on sensory score of Meitauza

由圖5可知，當(dāng)水添加量、菌種添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間兩兩交互作用時，對霉豆渣的感官評分均有一定影響，各響應(yīng)面陡峭程度及等高線橢圓化程度存在一定差異，其中AD、BD坡面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，表明A與D、B與D之間具有良好的交互作用，對霉豆渣感官評分影響較大。在AB、AC、AD和BC坡面上，感官評分隨A、B、C、D的增加呈現(xiàn)先迅速升高后緩慢降低的變化趨勢；在BD和CD坡面上，感官評分隨B、C、D的增加呈現(xiàn)緩慢升高后迅速降低的變化趨勢，說明感官評分有最大值點。

由Design Expert.V8.0.6軟件預(yù)測得出霉豆渣最佳發(fā)酵工藝為：水分添加量85.35%，菌種添加量1.98%，發(fā)酵溫度29.12 ℃，發(fā)酵時間39.58 h，此時感官評分最高理論值為87.12分。結(jié)合實際操作，將發(fā)酵工藝修正為：水分添加量85%，菌種添加量2.0%，發(fā)酵溫度29 ℃，發(fā)酵時間40 h。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行3次平行驗證試驗，感官評分實際值為89.7±1.2分，與預(yù)測值接近，表明該工藝真實可行。

2.3 霉豆渣理化指標(biāo)檢測結(jié)果

對采用最優(yōu)發(fā)酵工藝制作的霉豆渣的理化指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果見表5。

由表5可知，霉豆渣的各項指標(biāo)均符合GB 2712—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)豆制品》，對比發(fā)酵前豆渣和發(fā)酵后霉豆渣的營養(yǎng)成分，霉豆渣發(fā)酵過程中營養(yǎng)物含量發(fā)生了變化。氨基酸態(tài)氮含量由1.12 mg/g上升至8.75 mg/g，蛋白質(zhì)含量由33.8 g/100 g下降至20.1 g/100 g，表明在微生物的作用下，部分蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變成了游離氨基酸，這使得霉豆渣產(chǎn)生特殊風(fēng)味；脂肪含量由8.7 g/100 g下降至6.9 g/100 g，不可溶性膳食纖維含量由39.2 g/100 g下降至31.8 g/100 g，可溶性膳食纖維含量由10.6 g/100 g上升至12.5 g/100 g，總酸含量由6.2 g/kg上升至7.3 g/kg，表明霉豆渣在微生物發(fā)酵作用下向著低脂肪、高可溶性膳食纖維的方向轉(zhuǎn)變，使得其營養(yǎng)價值更高，更容易消化吸收。

表5 發(fā)酵前豆渣及霉豆渣理化指標(biāo)的檢測結(jié)果Table 5 Determination results of physical and chemical indexes of okara before fermentation and Meitauza

3 結(jié)論

以信陽地區(qū)霉豆渣發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)化，得到霉豆渣的最佳發(fā)酵工藝條件為以100 g干豆渣粉為基礎(chǔ)，水分添加量85%，菌種添加量2.0%，發(fā)酵溫度29 ℃，發(fā)酵時間40 h，采用優(yōu)化工藝制作出的霉豆渣菌絲稠密，質(zhì)地均勻、有彈性，內(nèi)外均為土黃色，有發(fā)酵的霉香味，煎炸之后香氣濃郁、味道鮮美，感官評分達(dá)87.1分。同時，與發(fā)酵前豆渣相比，霉豆渣營養(yǎng)品質(zhì)得到改良，氨基酸態(tài)氮含量由1.12 mg/g上升至8.75 mg/g，蛋白質(zhì)含量由33.8 g/100 g下降至20.1 g/100 g，脂肪含量由8.7 g/100 g下降至6.9 g/100 g，不可溶性膳食纖維含量由39.2 g/100 g下降至31.8 g/100 g，可溶性膳食纖維含量由10.6 g/100 g上升至12.5 g/100 g，總酸含量由6.2 g/kg上升至7.3 g/kg。本次研究確定了信陽地區(qū)霉豆渣的發(fā)酵工藝參數(shù)，分析了霉豆渣的營養(yǎng)成分變化，可為其工業(yè)化生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。