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    微生物合成3-甲硫基丙醇的研究現(xiàn)狀

    2022-02-07 13:09:30馬景浩張玉姣成柳潔李秀婷范光森
    中國釀造 2022年1期
    關(guān)鍵詞:脫羧酶丙醇硫基

    馬景浩,王 洋,張玉姣,成柳潔,滕 超,李秀婷,范光森*

    (1.北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院,北京 100048;2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心,北京 100048;3.濟(jì)南海關(guān)技術(shù)中心 德州實(shí)驗(yàn)室,山東 德州 253000)

    3-甲硫基丙醇(俗稱菠蘿醇)是一種重要的含硫高級醇,常溫下為易流動的淡黃色液體,低濃度時(shí)具有強(qiáng)烈的肉類芬芳香氣,天然存在于蘋果、番茄、醬油、奶酪、白酒、葡萄酒、啤酒、威士忌、白蘭地等食品或飲料中,能賦予眾多食品其特有的風(fēng)味[1]。3-甲硫基丙醇香氣閾值低,在1~3 mg/L之間即可表現(xiàn)出一種令人愉悅的、肉類的或者烤制奶酪的香氣,是調(diào)配肉味香精的重要香料之一,是國家允許使用的食品用香料,廣泛應(yīng)用于香精香料調(diào)配和食品增香,是一類應(yīng)用非常廣泛的食用香料化合物,市場需求量大[2-3]。

    目前,3-甲硫基丙醇的生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法,其中化學(xué)合成法是目前3-甲硫基丙醇生產(chǎn)的主要方法。化學(xué)合成法雖然成本低,但卻存在合成過程污染較大等問題,不能滿足消費(fèi)者日益對環(huán)保、綠色和純天然香精香料青睞的需求。由于生物轉(zhuǎn)化制備天然3-甲硫基丙醇具有構(gòu)型單一、綠色環(huán)保,成為近年來生產(chǎn)3-甲硫基丙醇的重要發(fā)展方向[4]。相關(guān)研究表明,微生物,尤其是酵母能代謝L-蛋氨酸發(fā)酵合成3-甲硫基丙醇,是生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然3-甲硫基丙醇的有效途徑。目前,有關(guān)微生物發(fā)酵合成3-甲硫基丙醇的研究相對較少,需要對其進(jìn)行深入研究。本文正是基于微生物合成3-甲硫基丙醇的重要性,通過對微生物合成3-甲硫基丙醇的主要微生物及其代謝途徑中的關(guān)鍵酶進(jìn)行簡述,加強(qiáng)對微生物產(chǎn)天然3-甲硫基丙醇研究現(xiàn)狀的了解,為相關(guān)研究提供參考。

    1 3-甲硫基丙醇在食品中的作用

    3-甲硫基丙醇具有強(qiáng)烈的甜香、湯或肉樣香氣,早在1973年美國食用香料與提取物制造者協(xié)會(Flavour and Extract Manufactuere's Association,F(xiàn)EMA)將其確定為一般認(rèn)為安全的香料物質(zhì),在食品中建議用量為0.1~50 mg/kg[5],1986年,我國相關(guān)食品國家標(biāo)準(zhǔn)也將其列為暫時(shí)允許使用的食品香料。3-甲硫基丙醇特有的肉香味及其低閾值特性,對眾多食品呈現(xiàn)獨(dú)特的風(fēng)味發(fā)揮了重要的作用,如在切達(dá)干酪、藍(lán)奶酪、卡門培爾干酪等奶酪中呈現(xiàn)發(fā)酵卷心菜的獨(dú)特氣味,能很容易在奶酪中被辨識出,是奶酪整體風(fēng)味的重要組成部分[6-7];盡管3-甲硫基丙醇是否是芝麻香型白酒中的特征風(fēng)味物質(zhì)存有爭論,但其在部分品牌芝麻香型白酒的風(fēng)格形成中發(fā)揮著重要作用,并且在豉香型白酒及果酒的呈味中也具有重要的貢獻(xiàn),表現(xiàn)出花椰菜和煮熟蔬菜的香氣,對風(fēng)味品質(zhì)的貢獻(xiàn)顯著[1,8];3-甲硫基丙醇是黃酒中的重要含硫化合物,在清爽型黃酒中香氣強(qiáng)度較高,主要賦予黃酒青香和煮熟蔬菜的氣味,豐富黃酒的香氣[9];3-甲硫基丙醇也是葡萄酒中重要的風(fēng)味物質(zhì),能賦予葡萄酒煮土豆味,豐富其風(fēng)味[10]。除此之外,因其具有甜的肉及肉湯氣味,3-甲硫基丙醇是調(diào)配肉味香精的重要原料,還可用于調(diào)配諸如水果、蔬菜、醬油、酒等眾多食用香精,用途廣泛[11]。

    2 3-甲硫基丙醇的生產(chǎn)方法

    2.1 化學(xué)合成法

    化學(xué)合成方法因具有成本低、合成快、產(chǎn)物濃度高的優(yōu)勢,一直是3-甲硫基丙醇主流的生產(chǎn)方法。目前,有關(guān)3-甲硫基丙醇的化學(xué)合成方法主要有四種:①采用甲硫醇和烯丙醇的加成反應(yīng)。②利用3-氯-1-丙醇和甲硫醇鈉在醚中進(jìn)行取代反應(yīng)。③采用烯丙基甲基硫醚的分解反應(yīng)。④3-巰基-1-丙醇和硫酸二甲酯的取代反應(yīng)(圖1)[11]。其中,前兩種反應(yīng)是目前實(shí)際生產(chǎn)中所采用的方法,相關(guān)研究也較多。劉玉平等[11]以3-氯-1-丙醇和甲硫醇鈉為原料,在相轉(zhuǎn)移催化劑四甲基溴化銨的作用下發(fā)生取代反應(yīng),制得了純度較高的3-甲硫基丙醇,產(chǎn)率達(dá)到81%。雖然,化學(xué)合成成本低廉,但存在的一些諸如原料毒性高、生產(chǎn)過程中的毒副產(chǎn)物難以去除及污染較大等問題引起關(guān)注,在一定程度上限制了其在工業(yè)化生產(chǎn)中的長期使用,必須拓展新的生產(chǎn)方法[12]。

    圖1 3-甲硫基丙醇的4種化學(xué)合成方法Fig.1 Four chemical synthesis methods for 3-methithiopropanol

    2.2 微生物合成法

    有關(guān)研究表明,微生物可以將甲硫氨酸轉(zhuǎn)化為3-甲硫基丙醇[7,13]。如,BUZZINI P等[13]篩選獲得10株能夠轉(zhuǎn)化氨基酸生成3-甲硫基丙醇的酵母菌株,產(chǎn)量在0.04~0.40 g/L。雖然,當(dāng)前微生物轉(zhuǎn)化合成3-甲硫基丙醇的速率不及化學(xué)方法,但由于其具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物構(gòu)型單一、綠色環(huán)保、所用原料安全無污染等特點(diǎn),成為近年來制備“綠色”和“天然”的3-甲硫基丙醇的重要發(fā)展方向。

    2.2.1 生產(chǎn)3-甲硫基丙醇的天然菌株

    當(dāng)前,國內(nèi)外有關(guān)微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)天然3-甲硫基丙醇的研究相對較少,能夠產(chǎn)生3-甲硫基丙醇的微生物種類不多,主要集中于酵母菌株(表1)。已報(bào)道能夠產(chǎn)3-甲硫基丙醇的菌株包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、漢遜德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、酒類酒球菌(Oenococcus oeni)、擔(dān)子菌酵母(Basidiomycetous yeasts)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)、魯氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、擬威爾酵母(Williopsis)等[4,13-21]。目前,天然微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)3-甲硫基丙醇的能力相對較弱,CASTILLO-LOZANO M L D等[7]通過搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)5株酵母菌株,其中乳酸克魯維酵母KL640和釀酒酵母SC45能轉(zhuǎn)化生成3-甲硫基丙醇,產(chǎn)量分別為14.51 mg/L和25.70 mg/L;BUZZINI P等[13]從37株擔(dān)子菌酵母中獲得10株可以生成3-甲硫基丙醇的酵母,其產(chǎn)量在0.04~0.40 g/L;侯晟等[4]優(yōu)化了釀酒酵母SC408發(fā)酵合成3-甲硫基丙醇的條件,在最優(yōu)條件下,該菌株所產(chǎn)3-甲硫基丙醇的量達(dá)到1.6 g/L;為進(jìn)一步提高釀酒酵母SC408發(fā)酵合成3-甲硫基丙醇的產(chǎn)量,王成濤等[22]采用發(fā)酵-分離耦合技術(shù)降低3-甲硫基丙醇對細(xì)胞的毒害作用,最終產(chǎn)量可達(dá)2.26 g/L,為已報(bào)道天然菌株中所產(chǎn)3-甲硫基丙醇最高產(chǎn)量;另外,WILLIAMS A G等[23]從切達(dá)干酪中分離獲得29株能產(chǎn)3-甲硫基丙醇的乳酸菌,產(chǎn)量也較低,在0.04~0.30 g/L之間。天然菌株所產(chǎn)3-甲硫基丙醇普遍低的現(xiàn)象(幾乎都低于0.1 g/L),成為采用天然菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)3-甲硫基丙醇最主要的限制因素[24]。

    表1 產(chǎn)3-甲硫基丙醇的天然菌株Table 1 Natural strains that produce 3-methylthiopropanol

    續(xù)表

    2.2.2 生產(chǎn)3-甲硫基丙醇的基因工程菌

    隨著人們對天然生產(chǎn)的3-甲硫基丙醇的需求增加以及基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的學(xué)者開始采用分子生物學(xué)技術(shù)對菌株進(jìn)行改造,以此實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)3-甲硫基丙醇的工程菌株。劉麗等[26]通過過表達(dá)釀酒酵母S288C中的氨基轉(zhuǎn)移酶ARO8基因構(gòu)建工程菌ARO8,工程菌所產(chǎn)3-甲硫基丙醇達(dá)到0.76 g/L,相比野生型S288C提高了28.8%;溫明顯等[3]通過過表達(dá)釀酒酵母INVSc1中的脫羧酶基因ARO10構(gòu)建了釀酒酵母轉(zhuǎn)化子SC10-1,其產(chǎn)3-甲硫基丙醇的量相比天然菌株提高了55.2%,達(dá)到0.90 g/L;YIN S等[27]通過共表達(dá)氨基轉(zhuǎn)移酶基因ARO8和ARO10構(gòu)建了釀酒酵母轉(zhuǎn)化子S810,在搖瓶水平上,該工程菌所產(chǎn)3-甲硫基丙醇達(dá)到1.27 g/L,通過分批補(bǔ)料發(fā)酵罐培養(yǎng),產(chǎn)量達(dá)到3.24 g/L;ETSCHMANN M M W等[24]通過分批補(bǔ)料發(fā)酵方法實(shí)現(xiàn)了工程菌釀酒酵母CEN.PK113-7D高產(chǎn)3-甲硫基丙醇的目的,產(chǎn)量可達(dá)3.5 g/L;楊雪蓮等[28]優(yōu)化了過表達(dá)脫羧酶基因ARO10的釀酒酵母工程菌合成3-甲硫基丙醇的發(fā)酵條件,在最優(yōu)條件下,工程菌株所產(chǎn)3-甲硫基丙醇可達(dá)4.38 g/L,為已報(bào)道中的最高水平。部分產(chǎn)3-甲硫基丙醇的基因工程菌株見表2,由表2可知,通過基因改造可以實(shí)現(xiàn)3-甲硫基丙醇產(chǎn)量的大幅度提高,為工業(yè)化應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)3-甲硫基丙醇打下基礎(chǔ)。

    表2 產(chǎn)3-甲硫基丙醇的基因工程菌株Table 2 Genetically engineered strains producing 3-methylthiopropanol

    3 微生物生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)3-甲硫基丙醇的關(guān)鍵基因和酶

    在酵母細(xì)胞中,Ehrlich途徑是生物轉(zhuǎn)化生成高級醇的最重要的途徑[2]。3-甲硫基丙醇是高級醇的一種,可以由蛋氨酸經(jīng)過Ehrlich途徑代謝產(chǎn)生[34]。在3-甲硫基丙醇的生物合成過程中,如果沒有蛋氨酸,3-甲硫基丙醇幾乎不產(chǎn)生,這足以表明Ehrlich途徑在合成3-甲硫基丙醇中的重要性[24]。在Ehrlich途徑中,首先,蛋氨酸在氨基轉(zhuǎn)移酶(aminotransferase)作用下發(fā)生轉(zhuǎn)氨基作用生成α-酮-γ-甲硫基丁酸(α-keto-γ-(methylthio)butyrate,KMBA),然后在脫羧酶(decarboxylase)作用下生成3-甲硫基丙醛,最后在乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase,ADH)作用下發(fā)生還原反應(yīng)生成3-甲硫基丙醇[24,35]。

    圖2 微生物轉(zhuǎn)化L-蛋氨酸產(chǎn)3-甲硫基丙醇的Erich途徑Fig.2 Erich pathway of microbial transformation of L-methionine to produce 3-methylthiopropanol

    3.1 氨基轉(zhuǎn)移酶

    在Ehrich途徑中具有轉(zhuǎn)氨作用的基因有4種,分別為BAT1、BAT2、ARO8和ARO9[2]。CHOLET O等[36]對漢斯德巴氏酵母菌(Debaryomyces hansenii)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)中的86個(gè)基因進(jìn)行了脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)微陣列分析,發(fā)現(xiàn)能高效同化L-蛋氨酸的解脂耶氏酵母中,與釀酒酵母同源的基因BAT2和ARO8表達(dá)量較高,表明這兩種轉(zhuǎn)氨酶在酵母通過Ehrich途徑轉(zhuǎn)化蛋氨酸生成3-甲硫基丙醇中起到一定的作用。研究表明,基因BAT1編碼線粒體氨基轉(zhuǎn)移酶BAT1p,優(yōu)先參與支鏈氨基酸(BCAAs)的生物合成,BAT2則編碼細(xì)胞質(zhì)氨基轉(zhuǎn)移酶BAT2p,參與BCAAs的分解代謝,兩者在3-甲硫基丙醇的合成中起到的作用較小,而在合成其他高級醇中的作用顯著[37-40]。基因ARO8和ARO9則分別編碼Aro8p和Aro9p,兩者作用的底物是芳香族氨基酸,分別被稱為芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和Ⅱ[41-42]。Aro8p屬于組成型表達(dá)蛋白,是主要的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶,它的表達(dá)易受到氨基酸合成代謝的影響;Aro9p則是一種誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,其表達(dá)受到氮源調(diào)控以及ARO8基因缺失等因素的影響。在已有研究中發(fā)現(xiàn),雖然L-蛋氨酸不是芳香族氨基酸,但其代謝過程與芳香族氨基酸相似,基因ARO8和ARO9在利用L-蛋氨酸合成3-甲硫基丙醇中起到重要的作用[42-43]。Aro8p和Aro9p都具有廣泛的底物特異性,其表達(dá)水平在以L-蛋氨酸為唯一氮源、葡萄糖受限的條件下較高,Aro8p表現(xiàn)出較強(qiáng)的催化蛋氨酸轉(zhuǎn)氨基生物活性[2,43-44]。URRESTARAZU A等[43]研究表明,單獨(dú)缺失ARO8或ARO9基因的釀酒酵母都能在含有蛋氨酸存在的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長,而同時(shí)缺失ARO8和ARO9基因后則無法生長,通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ARO8基因編碼的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶I不僅對芳香族氨基酸具有轉(zhuǎn)氨作用,而且還對蛋氨酸、α-氨基乙二酸和亮氨酸具有轉(zhuǎn)氨活性,ARO9基因編碼的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶II同樣具有較寬廣的底物特異性。YIN S等[27]研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)ARO8基因提高的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶活性明顯高于過表達(dá)ARO9基因所獲得的活性,表明相比芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶II,芳香族氨基酸轉(zhuǎn)移酶I在轉(zhuǎn)化L-蛋氨酸合成3-甲硫基丙醇中效果更為明顯。DEED R C等[25]研究表明,單獨(dú)缺失基因ARO8可使釀酒酵母BY4743合成3-甲硫基丙醇的能力下降44%,使商用葡萄酒酵母F15合成3-甲硫基丙醇的能力降低92%;單獨(dú)缺失ARO9基因?qū)︶劸平湍窧Y4743合成3-甲硫基丙醇沒有影響,然而卻使菌株F15的3-甲硫基丙醇含量相比野生型菌株提高了46%。另外,相關(guān)研究還表明,轉(zhuǎn)氨酶的轉(zhuǎn)氨作用具有可逆性,Aro8p和Aro9p可以催化α-KMBA發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)生L-蛋氨酸[45-46]。綜上可見,酵母通過Ehrlich途徑合成3-甲硫基丙醇中轉(zhuǎn)氨酶Aro8p所發(fā)揮的轉(zhuǎn)氨作用最為重要。

    3.2 脫羧酶

    在轉(zhuǎn)氨酶的作用下,L-蛋氨酸轉(zhuǎn)化為α-KM BA,α-KMBA則在脫羧酶作用下生成3-甲硫基丙醛,這種醛也具有獨(dú)特的肉香味,對番茄、奶酪和醬油呈味也發(fā)揮重要的作用[47-48]。脫羧酶與轉(zhuǎn)氨酶不同,在Ehrlich途徑中是不可逆的[2]。VURALHAN Z等[48-49]研究了釀酒酵母CEN.PK113-7D中的脫羧酶,結(jié)果表明其擁有5個(gè)候選基因可以編碼:ARO10(YDR380w)、THI3(YDL080c)、PDC1(YLR044c)、PDC5(YLR134w)和PDC6(YGR087c),表達(dá)的脫羧酶屬于硫胺二磷酸依賴性脫羧酶[27]。ARO10基因編碼的脫羧酶具有廣泛的底物特異性,尤其對芳香族氨基酸具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)氨活性,是產(chǎn)生支鏈和含硫雜醇類的關(guān)鍵貢獻(xiàn)者,尚未發(fā)現(xiàn)THI3編碼具有活性的脫羧酶,PDC1基因和PDC5基因編碼為丙酮酸脫羧酶,與ARO10基因編碼的脫羧酶類似,對所有支鏈和含硫的2-oxo酸均表現(xiàn)出活性,兩者中一種的缺失都會激發(fā)另一種的大量表達(dá),而PDC6僅能在含低硫的條件下表達(dá),并且PDC5基因編碼的脫羧酶脫羧效率與PDC1基因編碼的相當(dāng),而PDC6基因編碼的脫羧酶的脫羧效率最低[50-52]。

    VURALHAN Z等[48]研究發(fā)現(xiàn),在以苯丙氨酸、亮氨酸或蛋氨酸為唯一氮源時(shí),5種脫羧酶基因中只有ARO10基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào),其中使用L-Met作為唯一氮源時(shí),ARO10基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)15倍,當(dāng)其他四個(gè)基因失活時(shí),ARO10能編碼足夠量的苯丙酮酸脫羧酶活性[49]。PERPETE P等[35]研究發(fā)現(xiàn),KMBA在Ydr380wp作用下可脫羧生成3-甲硫基丙醛,若Ydr380wp失活,釀酒酵母不能將L-蛋氨酸轉(zhuǎn)化為3-甲硫基丙醇,而缺失其他四個(gè)脫羧酶仍能轉(zhuǎn)化3-甲硫基丙醇,由此推測KMBA的脫羧作用受Ydr380wp特異性影響。LIU B等[21]研究發(fā)現(xiàn),鹽度可以提高魯氏接合酵母中ARO10基因的表達(dá),從而增加其合成3-甲硫基丙醇的含量。YIN S等[27]通過基因過表達(dá)研究同樣發(fā)現(xiàn),ARO10基因的過表達(dá)可顯著提高細(xì)胞脫羧酶活性,從而提高了3-甲硫基丙醇的產(chǎn)量。由此可見,5種脫羧酶中,ARO10基因所編碼的脫羧酶對酵母通過Ehrlich途徑合成3-甲硫基丙醇更為重要。

    3.3 醇脫氫酶

    在Ehrlich途徑中,3-甲硫基丙醇合成的最后一步是氧化還原反應(yīng),其由3-甲硫基丙醛在醇脫氫酶的作用下發(fā)生還原反應(yīng)而生成的,這一步是非限制性速度,不限制3-甲硫基丙醇的轉(zhuǎn)化速度,因?yàn)榻湍钢写嬖谠S多乙酸脫氫酶,可被其中的任何一種催化完成[2]。

    BOER V M等[53]研究發(fā)現(xiàn),醛的氧化或還原受培養(yǎng)條件的影響,在葡萄糖限制型的恒化培養(yǎng)基中,當(dāng)進(jìn)行有氧發(fā)酵時(shí)大部分醛被氧化為酸,進(jìn)行無氧發(fā)酵時(shí)大部分醛被還原為醇。VALLET A等[54]研究表明,僅有的能合成3-甲硫基丙醇細(xì)菌-酒類酒球菌IOEB 8406中存在乙醇脫氫酶(ADH)活性,在3-甲硫基丙醇的合成中起到重要的作用。DICKINSON J R等[55]采用13C核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)和氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)分析發(fā)現(xiàn),醇脫氫酶Adh1p、Adh2p、Adh3p、Adh4p、Adh5p和Sfa1p中的任何一種都能將醛轉(zhuǎn)化成3-甲硫基丙醇。然而,CHE Y X等[31]分析了在添加3-甲硫基丙醛的條件下酵母中7個(gè)ADH基因的表達(dá)情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),只有ADH4表達(dá)量明顯增加,在釀酒酵母S288c中過表達(dá)ADH4后,3-甲硫基丙醇產(chǎn)量明顯增加,這表明不同醇脫氫酶在合成3-甲硫基丙醇中的重要性不同,有待進(jìn)一步研究。

    3.4 脫甲硫基酶

    在Ehrlich途徑中,L-蛋氨酸或其衍生物α-KMBA可以通過脫甲基化轉(zhuǎn)化,從而產(chǎn)生甲硫醇(methanthiol,MTL),從而對3-甲硫基丙醇的合成產(chǎn)生影響,具有脫甲硫基功能的酶有胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine γ-lyase,CGL)和胱硫醚-β-裂解酶(cystathionine β-lyase,CBL)等[35]。KNOLL C等[56]研究發(fā)現(xiàn)酒類酒球菌中胱硫醚-γ/β-裂解酶似乎參與了蛋氨酸代謝途徑生成甲硫醇,在過表達(dá)胱硫醚-γ-裂解酶基因的菌株中,顯著增加了蛋氨酸的分解,產(chǎn)生了更多的甲硫醇。JIA K Z等[57]研究發(fā)現(xiàn)胱氨酸-β-裂解酶(CBL)可以將蛋氨酸和KMBA降解為甲硫醇,是合成甲硫醇的限速酶。然而,劉麗等[30]敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因后,釀酒酵母S288c所產(chǎn)3-甲硫基丙醇產(chǎn)量降低,推測可能除了胱硫醚-γ-裂解酶外,還有其他酶參與了L-蛋氨酸的去甲基化。ZHANG Q等[58]在粉紅螺旋聚孢霉和釀酒酵母中過表達(dá)E3-泛素-蛋白連接酶HUWE1后顯著提高了去甲基硫醇途徑中甲硫醇及其衍生物的生物合成,而抑制了Ehrlich途徑中的3-甲硫基丙醛和3-甲硫基丙醇的生物合成。由此可見,影響Ehrlich途徑的支路上的酶對于3-甲硫基丙醇合成也具有重要影響。

    4 展望

    3-甲硫基丙醇是許多食品中的重要風(fēng)味物質(zhì),隨著人們對天然添加劑3-甲硫基丙醇需求的增加,微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)3-甲硫基丙醇成為滿足消費(fèi)者需求的重要方法。但已報(bào)道的天然菌株中具有高產(chǎn)3-甲硫基丙醇的菌株較少,需要進(jìn)一步篩選高產(chǎn)產(chǎn)3-甲硫基丙醇的天然菌株,另外,可以利用基因工程對天然菌株進(jìn)行改造,如可以通過過表達(dá)Ehrlich途徑中的關(guān)鍵酶,也可以敲除胱硫醚-γ-裂解酶基因,減少蛋氨酸的支路代謝,從而提高3-甲硫基丙醇的產(chǎn)量,再次,也可以通過在發(fā)酵過程中分離出發(fā)酵產(chǎn)物3-甲硫基丙醇以減少其對微生物的毒性,從而連續(xù)不斷的轉(zhuǎn)化生成3-甲硫基丙醇。隨著對微生物研究的深入,也可利用微生物群落法對不同的微生物進(jìn)行最佳組合從而獲得3-甲硫基丙醇的最大產(chǎn)量。由此可見,通過傳統(tǒng)篩選方法、分子生物技術(shù)及發(fā)酵技術(shù)等組合可以實(shí)現(xiàn)生物法高效轉(zhuǎn)化合成3-甲硫基丙醇,為生物法合成天然的3-甲硫基丙醇提供廣闊的應(yīng)用空間。

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