鐵死亡在大鼠心肌缺血-再灌注損傷中的作用

趙述傲， 朱儀章， 濮雨凌， 李子千， 杜逸之， 陳 可， 張瀟月， 楊紅寧， 顧文華， 丁夢(mèng)媛，劉江錫， 楊婉婷， 周 翔， 燕憲亮

急性心肌梗死(AMI)是心血管系統(tǒng)疾病中的急危重癥，發(fā)生率逐年增高，是世界范圍內(nèi)常見(jiàn)的死亡原因之一[1]?；謴?fù)心肌再灌注可加重心肌損傷、心功能障礙，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、死亡和心律失常，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血-再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury， MIRI)[2]。近期研究[3]發(fā)現(xiàn)，MIRI中的細(xì)胞死亡除了有凋亡、壞死、自噬性細(xì)胞死亡外，還有另外一種死亡方式——鐵死亡(Ferroptosis)。Ferroptosis是一種鐵離子依賴性的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬的新型程序性細(xì)胞死亡形式，F(xiàn)erroptosis導(dǎo)致線粒體變小，膜密度增高，嵴減少或消失，外膜破碎等細(xì)胞線粒體形態(tài)改變[4]。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞糖氧剝奪/復(fù)灌(OGD/R)模型來(lái)研究MIRI后是否存在Ferroptosis并研究其作用。

1 材料與方法

1.1材料 H9c2細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院分院)；鐵死亡激動(dòng)劑(Erastin)、鐵死亡特異性抑制劑(Ferrostatin-1，F(xiàn)er-1陶素藥業(yè)有限公司)； CCK-8試劑盒(VICMED公司)；細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑(Hyclone公司)。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將H9c2細(xì)胞用含有10%胎牛血清的L-DMEM重懸，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。24 h后換液，棄未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2傳代，達(dá)到基本融合后再次消化傳代，進(jìn)行擴(kuò)增和富集。

1.2.2 分組及藥物濃度 離體培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為正常培養(yǎng)組(Control組)、鐵死亡激動(dòng)劑組(Erastin組)、氧糖剝奪/復(fù)灌組(OGD/R組)、溶劑對(duì)照組(OGD/R+DMSO組)和Ferroptosis抑制劑組(OGD/R+Fer-1組)。鐵死亡抑制劑Fer-1濃度為0.5 μmol/L，作用時(shí)間為16 h；鐵死亡激動(dòng)劑Erastin的濃度為10 μmol/L，作用時(shí)間為24 h。Ferroptosis抑制劑組在OGD/R模型后加入含有Fer-1(0.5 μmol/L)的20%FBS培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)灌12 h。溶劑對(duì)照組在制備OGD 模型后加入含有與抑制劑組同濃度的二甲基亞砜(DMSO)+20% FBS培養(yǎng)液進(jìn)行復(fù)灌12 h。鐵死亡激動(dòng)劑單予以含有Erastin(10 μmol/L)+10% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.2.3 OGD模型建立 預(yù)先調(diào)設(shè)三氣培養(yǎng)箱至缺氧狀態(tài)(37 ℃，1%O2，5%CO2，94%N2)。取培養(yǎng)12 h的H9c2心肌細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液，加入無(wú)糖DMEM培養(yǎng)基，置于三氣培養(yǎng)箱箱內(nèi)培養(yǎng)。通過(guò)在不同缺氧時(shí)間和不同復(fù)灌時(shí)間條件下，觀察H9c2細(xì)胞活力來(lái)確定造模最佳時(shí)間，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用OGD模型放入三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，至觀察時(shí)間點(diǎn)將細(xì)胞取出，換回含有20%FBS的培養(yǎng)液，置于普通培養(yǎng)箱復(fù)灌16 h后觀察檢測(cè)模擬MIRI模型。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性 向96孔板的待檢測(cè)細(xì)胞加入10% CCK-8溶液培養(yǎng)2 h，每組6個(gè)復(fù)孔，將100 μL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至新96孔板，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光值。

1.2.5 透射電子顯微鏡觀察 將細(xì)胞用2.5%戊二醛(pH 7.4)4 ℃固定2 h，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)漂洗，再用1%鋨酸室溫(20 ℃)固定2 h，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)漂洗；用梯度乙醇脫水，樹(shù)脂浸透，包埋、切片，用2%醋酸鈾飽和水溶液和檸檬酸鉛依次染色，電鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1不同缺氧和復(fù)灌時(shí)間、Fer-1濃度、Erastin作用時(shí)間、Erastin濃度時(shí)的細(xì)胞活力 與其他時(shí)間點(diǎn)比較，大鼠OGD模型8 h復(fù)灌12 h時(shí)細(xì)胞活力明顯下降。與Control組比較，在最低濃度Fer-1 0.5 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力明顯增強(qiáng)。在Erastin 10 μmol/L時(shí)，作用24 h細(xì)胞活力明顯下降。見(jiàn)圖1。

2.2細(xì)胞存活狀況 與Control組比較，Erastin組、OGD/R組、OGD/R+DMSO組均出現(xiàn)明顯的細(xì)胞死亡。使用Ferroptosis的抑制劑Fer-1(0.5 μmol/L)后，細(xì)胞死亡減少。見(jiàn)圖2。

注：A為不同缺氧和復(fù)灌時(shí)間；B圖為不同F(xiàn)er-1濃度；C圖為不同Erastin作用時(shí)間；D圖為不同Erastin濃度時(shí)的細(xì)胞活力圖1 不同缺氧和復(fù)灌時(shí)間、Fer-1濃度、Erastin作用時(shí)間及Erastin濃度時(shí)的細(xì)胞活力

注：A為正常培養(yǎng)組(Control)；B為鐵死亡激動(dòng)劑組(Erastin)；C為氧糖剝奪/復(fù)灌組(OGD/R)； D為溶劑對(duì)照組(OGD/R+DMSO)；E為鐵死亡抑制劑組(OGD/R+Fer-1)圖2 光學(xué)顯微鏡下各組細(xì)胞的存活狀況(×100)

注：A為正常培養(yǎng)組(Control)；B為鐵死亡激動(dòng)劑組(Erastin)；C為氧糖剝奪/復(fù)灌組(OGD/R)； D為溶劑對(duì)照組(OGD/R+DMSO)；E為鐵死亡抑制劑組(OGD/R+Fer-1)；圖a、b、c、d、e分別為A、B、C、D、E選中區(qū)域的放大圖；箭頭指示Ferroptosis的特異性改變圖3 各組不同細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)

2.3細(xì)胞活力 與Control組比較，OGD/R組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.001)；與OGD/R組比較，給予抑制劑Fer-1后能夠明顯提高細(xì)胞活力(P<0.05)；與OGD/R組比較，Erastin組、OGD/R+DMSO組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組的細(xì)胞活力比較

2.4細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu) Control組顯示的是H9c2細(xì)胞正常的超微結(jié)構(gòu)，與Control組比較，Erastin組、OGD/R組、OGD/R+DMSO組及OGD/R+Fer-1組都發(fā)現(xiàn)大量脂質(zhì)沉積，可見(jiàn)線粒體體積縮小，雙層脂質(zhì)膜密度增加。使用Ferroptosis抑制劑Fer-1后，脂質(zhì)密度較OGD/R組減少。見(jiàn)圖3。

3 討論

近年來(lái)，我國(guó)人群心血管病發(fā)病率和病死率有持續(xù)上升的趨勢(shì)，而AMI是心血管系統(tǒng)疾病中的急危重癥，發(fā)生率逐年增高[5]。根據(jù)2019年《急性ST段抬高型心肌梗死診斷和治療指南》要求，盡快恢復(fù)心肌再灌注，在時(shí)間窗內(nèi)首選急診經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)[6]，但再灌注導(dǎo)致MIRI，可加重心肌損傷、心功能障礙，誘發(fā)心肌細(xì)胞凋亡、死亡和心律失常，因此，如何減輕MIRI成為研究的熱點(diǎn)。近期研究[7]發(fā)現(xiàn)，MIRI中細(xì)胞死亡除了有凋亡、壞死、自噬性細(xì)胞死亡外，還有一種新的死亡方式——鐵死亡。鐵死亡是一種鐵離子依賴性的，區(qū)別于細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬的新型程序性細(xì)胞死亡形式[8-9]。

過(guò)去幾年中，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，一些小分子化合物可以誘導(dǎo)RAS基因突變的腫瘤細(xì)胞發(fā)生一種新型的死亡[10]。這些小分子物質(zhì)包括Erastin、SAS等，被稱為選擇性致死藥物(RAS-selective lethal， RSLs)[11-12]。進(jìn)一步研究[13]表明，Erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡主要特征是細(xì)胞內(nèi)鐵依賴性ROS異常增高、氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，將其命名為Ferroptosis。目前認(rèn)為，F(xiàn)erroptosis與凋亡、壞死和自噬在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和遺傳學(xué)等方面均有明顯差異。Ferroptosis典型特征為線粒體變小，雙層膜的密度增加，細(xì)胞脂質(zhì)活性氧增多[14]。Fer-1是一種人為合成的分子量為262的芳烷基胺，常作為食物中防腐劑及化學(xué)材料抗氧化劑，F(xiàn)er-1對(duì)Ferroptosis的抑制作用主要是通過(guò)抗氧化作用清除脂質(zhì)ROS實(shí)現(xiàn)的[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)OGD模型后再予含有20%血清正常培養(yǎng)心肌細(xì)胞12 h模擬MIRI，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力，并用透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)來(lái)研究MIRI后發(fā)生Ferroptosis，并研究Ferroptosis的作用。光學(xué)顯微鏡結(jié)果所示，使用Erastin和OGD/R等方式處理細(xì)胞后均可使H9c2細(xì)胞明顯死亡，并用CCK-8檢測(cè)細(xì)胞的存活率，提示實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ统晒?P<0.05)。使用Fer-1后，細(xì)胞的存活率明顯增加，表明Fer-1可以減少OGD/R后心肌細(xì)胞的死亡。為了驗(yàn)證Fer-1對(duì)H9c2細(xì)胞OGD/R后有保護(hù)作用，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)不同組的細(xì)胞活力(見(jiàn)表1)，也得到相應(yīng)的趨勢(shì)。本研究表明，F(xiàn)er-1可降低OGD/R后心肌細(xì)胞的死亡率，對(duì)OGD/R心肌細(xì)胞有保護(hù)作用，說(shuō)明OGD/R后心肌細(xì)胞可能存在Ferroptosis。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OGD/R存在Ferroptosis，本實(shí)驗(yàn)使用透射電子顯微鏡觀察不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，OGD/R組及Erastin組均發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中出現(xiàn)大量的脂質(zhì)沉積、雙層密度膜增加。在OGD/R中發(fā)現(xiàn)了和Erastin類似的結(jié)構(gòu)改變，表示OGD/R后心肌細(xì)胞發(fā)生了和Erastin相同的細(xì)胞死亡，考慮在OGD/R中可能存在Ferroptosis。本研究采用了Fer-1進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)使用Fer-1后心肌細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積較少，雙層膜密度較少，說(shuō)明應(yīng)用Fer-1后可減少OGD/R后心肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積。這與光學(xué)顯微鏡及細(xì)胞活力檢測(cè)的結(jié)果一致，說(shuō)明OGD/R中可能存在Ferroptosis。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Erastin組和OGD/R組細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)類似，兩組CCK-8值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？紤]Erastin是通過(guò)減少胱氨酸的攝入，從而降低谷胱甘肽的含量，導(dǎo)致其過(guò)氧化物酶活性降低，引起脂質(zhì)過(guò)氧化[17-18]。AMI時(shí)存在氨基酸及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等缺乏，急診介入后有血液的再灌注，因此猜測(cè)，OGD/R模型中產(chǎn)生的Ferroptosis和Erastin一樣通過(guò)谷胱甘肽調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化平衡。

本實(shí)驗(yàn)初步驗(yàn)證，MIRI后存在鐵死亡，以及鐵死亡通過(guò)降低細(xì)胞活性導(dǎo)致細(xì)胞死亡，為后續(xù)研究鐵死亡的機(jī)制提供了基礎(chǔ)，對(duì)于治療MIRI具有重要的理論價(jià)值和臨床意義。